激光共聚焦掃描顯微鏡技術(shù)簡(jiǎn)介及其應(yīng)用

孫學(xué)俊，閆喜中，郝赤*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801; 2.阿爾伯特大學(xué) 醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所，加拿大 埃德蒙頓 T6G1Z2 )

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★特約稿件

激光共聚焦掃描顯微鏡技術(shù)簡(jiǎn)介及其應(yīng)用

孫學(xué)俊1,2，閆喜中1，郝赤1*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801; 2.阿爾伯特大學(xué) 醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所，加拿大 埃德蒙頓 T6G1Z2 )

摘要：激光共聚焦顯微鏡(共聚焦顯微鏡)是在生物學(xué)研究中最通用的熒光顯微鏡工具之一。它的廣泛流行是因?yàn)槠鋬?yōu)越的光學(xué)切片和3維(3D)重建功能。不同于普通顯微鏡觀測(cè)厚樣本時(shí)由于被聚焦外光線干擾導(dǎo)致模糊圖像，激光共聚焦顯微鏡可以從比較厚的生物樣本在短期內(nèi)獲得清晰的光學(xué)切片。激光共聚焦顯微鏡所得到的一幅完全對(duì)齊的3D圖像系列允許對(duì)樣本在虛擬空間的任意角度觀測(cè)。該技術(shù)越來(lái)越成為現(xiàn)代生命科學(xué)研究中必不可少的一項(xiàng)研究工具。本文的目的是為研究生和青年研究人員提供一些使用激光共聚焦顯微鏡的基礎(chǔ)知識(shí)并對(duì)它的應(yīng)用做簡(jiǎn)單的介紹。

關(guān)鍵詞：熒光；共聚焦；顯微鏡；細(xì)胞影像；三維圖像重組

顯微鏡可能是生物研究實(shí)驗(yàn)室中最古老的儀器之一。100多年以來(lái)，它的基本結(jié)構(gòu)并沒(méi)有多大的改變。隨著各種增加圖像對(duì)比度的顯微鏡技術(shù)的發(fā)明，比如相差顯微技術(shù)( DIC , Differential Interference Contrast)、熒光顯微鏡技術(shù)等使顯微鏡成為現(xiàn)代科學(xué)研究中一項(xiàng)更必不可少的研究技術(shù)手段之一。然而沒(méi)有一項(xiàng)顯微鏡技術(shù)的比激光掃描共聚焦顯微鏡(共聚焦顯微鏡)在生物學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用的影響大，共聚焦顯微鏡能夠成為生物研究中最普遍的熒光顯微鏡工具無(wú)疑是基于其卓越的光學(xué)切片和三維重建的能力，該技術(shù)可以方便快捷地從比較厚的生物樣品獲得的清晰的光學(xué)切片，而且對(duì)樣品的任何可能的角度可以作進(jìn)一步的觀測(cè)從而獲得三維圖像。隨著共聚焦顯微鏡的日益發(fā)展，其復(fù)雜程度也日益增加，初學(xué)者或顯微鏡基礎(chǔ)知識(shí)不足的科研工作者很容易犯一些技術(shù)性錯(cuò)誤而得到錯(cuò)誤的圖像。該文章的目的是為相關(guān)科研人員和研究生闡述一些使用共聚焦顯微鏡最基本的知識(shí)，以及使用共聚焦顯微鏡基本設(shè)置的指導(dǎo)方針，了解其成像的基本原理，從而更有效地使用這項(xiàng)技術(shù)。該文對(duì)于影像專家可能過(guò)于簡(jiǎn)單，而初學(xué)者可能會(huì)發(fā)現(xiàn)它太復(fù)雜，作者希望通過(guò)本文讓對(duì)該技術(shù)感興趣的人對(duì)這項(xiàng)技術(shù)有一個(gè)基本的認(rèn)識(shí)，并且掌握使用該技術(shù)的基本知識(shí)。總之，該文是一個(gè)典型的共聚焦顯微鏡培訓(xùn)的工作流程，也可以用作共聚焦顯微鏡培訓(xùn)的參考讀物。

1現(xiàn)代寬視場(chǎng)顯微鏡和它的局限性

細(xì)胞是所有生命形態(tài)的基本構(gòu)建模塊，顯微鏡無(wú)論在細(xì)胞理論的形成還是在對(duì)細(xì)胞功能的研究中都起到了非常重要的作用。顯微鏡的分辨率可以由Abbe定律計(jì)算，即：

分辨率：d=1.22×λ/(NA物鏡+NA聚光鏡)

其中λ是光的波長(zhǎng)；NA是數(shù)值孔徑，定義了鏡頭的光收集能力：

NA =n×sinα

式中，“n”是透鏡設(shè)計(jì)的介質(zhì)的折射率， “α”是鏡頭可以收集的最大光錐的半角。數(shù)值孔徑NA表達(dá)的是一個(gè)鏡頭的最基本的物理特性，它定義了鏡頭可以收集光的能力。透鏡收集的光錐的半角越大，n越高，鏡頭收集光的能力越強(qiáng)。

對(duì)于熒光顯微鏡，Abbe定律可以簡(jiǎn)化為：

d=0.61×λ/NA

“d”為鏡頭的理論分辨率，有時(shí)也稱為Airy單位(以記念 Sir George Biddel Airy，英國(guó)數(shù)學(xué)家、天文學(xué)家)，它是一個(gè)無(wú)限小的自發(fā)光物體在焦距平面上的第一衍射環(huán)的直徑。顯微鏡鏡頭的分辨率通常被描述為可以分辨兩個(gè)無(wú)限小的物體的最小距離(Rayleigh標(biāo)準(zhǔn))。顯微鏡的鏡頭的分辨率通常是一個(gè)Airy單位，因?yàn)榧词乖谧顑?yōu)化的狀態(tài)下，兩個(gè)無(wú)限小的物體的距離低于Airy單位時(shí)是不可能分辨開(kāi)來(lái)的。顯微鏡鏡頭的分辨率是由該透鏡的數(shù)值孔徑(NA)和其采用的光的波長(zhǎng)決定的。這一理論分辨率的極限已在18世紀(jì)后期達(dá)到[1]。然而，另一個(gè)主要光學(xué)顯微鏡的困惑一直到80年代中期都從來(lái)沒(méi)有被真正地解決。顯微鏡的軸分辨率可以表達(dá)為：

d軸向=2×λ×n/(NA)2

軸向分辨率可以定義為透鏡在Z軸可分辨的物體的最小距離。軸向分辨率通常是橫向分辨率的1/3~1/2。而且通常，生物樣品比顯微鏡能提供的光學(xué)厚度要厚很多。即使對(duì)于生命形式的基本構(gòu)建模塊細(xì)胞而言，其大小范圍亦從幾微米(如淋巴細(xì)胞)到幾毫米(如神經(jīng)元)不等。當(dāng)把一個(gè)比較厚的標(biāo)本放在顯微鏡鏡頭下觀察，焦距外物體產(chǎn)生的光線會(huì)把焦距內(nèi)的物體的結(jié)構(gòu)完全遮蔽從而導(dǎo)致一副模糊的圖像。因此，顯微鏡樣本需要切成薄片，而且對(duì)分辨率要求越高，截面就需要越薄。對(duì)于一個(gè)典型的組織學(xué)切片，這種切片的厚度往往在幾微米的范圍內(nèi)(最多約10 μm)。而大多數(shù)的生物樣品的是三維的和相對(duì)較厚的，這就需要先把樣品切片，之后再進(jìn)行三維重建，過(guò)程非常繁瑣和困難。80年代中期，Agard 和 Sedat[2]開(kāi)創(chuàng)了一個(gè)叫反褶積的計(jì)算方案解決了這個(gè)問(wèn)題。簡(jiǎn)單地講，一個(gè)鏡頭的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)(PSF，一個(gè)無(wú)窮小的點(diǎn)光源在三維空間的分布)可以用攝像頭拍攝低于鏡頭分辨率的物體來(lái)獲取或者用數(shù)學(xué)模型來(lái)模擬，根據(jù)點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)以及相機(jī)記錄的圖像來(lái)計(jì)算復(fù)雜物體的真實(shí)狀態(tài)。這個(gè)迭代過(guò)程可以將焦距外光線重新“放回”它所處的位置。 最終計(jì)算出來(lái)的圖像會(huì)增強(qiáng)對(duì)比度和減少焦距外光線的影響。在當(dāng)時(shí)，反褶積被譽(yù)為所有光學(xué)顯微鏡的最終解決方案。然而，由于算法本身對(duì)計(jì)算機(jī)計(jì)算能力的超高要求，反褶積從來(lái)沒(méi)有超出一些特殊的實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用范圍。

早在1957年，Marvin Minsky 就發(fā)明了共焦顯微鏡的基本概念，他使用一個(gè)針孔在顯微鏡的照明光路中，再用另一個(gè)針孔在共軛焦平面(因此稱共聚焦)，由此焦距外的光線可以被針孔阻斷，可以避免樣品其他部位光的散射對(duì)圖像造成影響，這樣的顯微鏡會(huì)產(chǎn)生一幅比傳統(tǒng)的顯微鏡(寬視場(chǎng))更清晰的圖像，當(dāng)時(shí)該儀器的成像是通過(guò)移動(dòng)樣品臺(tái)對(duì)樣品進(jìn)行掃描實(shí)現(xiàn)的。盡管該顯微鏡有明顯的優(yōu)勢(shì)，且Minsky對(duì)該儀器的應(yīng)用有非常有遠(yuǎn)見(jiàn)的預(yù)測(cè)[3]，但是第一臺(tái)商用激光共聚焦顯微鏡在1987才上市[4]，之后才成為熒光顯微鏡領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)工具而得到廣泛的接受。共聚焦激光掃描顯微鏡的設(shè)計(jì)與Minsky的初始設(shè)計(jì)非常相似，它使用一個(gè)針孔阻斷焦距外光線和以柵格模式掃描試樣成像(圖1)。大多數(shù)的現(xiàn)代激光共聚焦顯微鏡用鏡子來(lái)引導(dǎo)激光束代替樣品臺(tái)掃描，基本的設(shè)計(jì)與Minsky的設(shè)計(jì)類似：一個(gè)共焦針孔和光柵式掃描，最終該儀器實(shí)現(xiàn)了光學(xué)切片的功能；每次僅照明一個(gè)光衍射光斑，可以避免樣品其他部分的光散射。這兩個(gè)屬性產(chǎn)生一個(gè)高對(duì)比度，沒(méi)有焦距外光線的光學(xué)切片圖像(圖1)。此外，在適當(dāng)?shù)挠布蛙浖嘟Y(jié)合下，該儀器可以自動(dòng)獲得樣品經(jīng)光學(xué)切片后重新在不同樣品層次聚焦獲取下一幅光學(xué)切片。如此重復(fù)， 共聚焦顯微鏡可以很快地獲取樣品完美的三維圖像數(shù)據(jù)，在計(jì)算機(jī)輔助軟件的幫助下可以對(duì)樣品的三維結(jié)構(gòu)以任意角度進(jìn)行觀察，使對(duì)三維的生物樣品的觀察變的非常容易，因此，共聚焦顯微鏡被廣泛作為生物、醫(yī)學(xué)研究的熒光顯微鏡的標(biāo)準(zhǔn)工具，也成為了廣大科研院所的核心設(shè)施之一。

圖1　寬視場(chǎng)顯微鏡和共聚焦顯微鏡的對(duì)比Fig.1　The comparison copy of wide and confocal microscopy　　注：示意圖顯示寬視場(chǎng)顯微鏡中(A)焦點(diǎn)內(nèi)和焦點(diǎn)外的光都到達(dá)檢測(cè)器而導(dǎo)致一幅模糊的圖像(C)。在共聚焦模式(B)中，一個(gè)針孔(箭頭)被放置在共軛平面。針孔只允許焦距內(nèi)的光的通過(guò)并阻斷聚焦外的光線，結(jié)果形成一幅高對(duì)比度的清楚圖像(D)。C和D是在不同成像模式下對(duì)菊花花芽截面相同區(qū)域的熒光圖像。箭頭和*指示同一區(qū)域。注意在寬視場(chǎng)顯微鏡模式(C)，由于焦距外光線的干擾，基本看不到細(xì)節(jié)。Zeiss LSM710激光共聚焦顯微鏡， 63X/1.4油鏡。 比例尺10 μm。Note:Diagram showing wide field microscope (A) where both out of focus light and in focus light were detected resulted in a blurred image (C). While in confocal mode (B), a pinhole aperture is placed in conjugate plane of the focus. It rejects out of the focus light and allows in focus light to be detected and results in a sharp image (D). Panel C and D are autofluorescence images from the same region of a flower bud cross section of Chrysanthemum. Arrow and arrowheads indicated the same region. Notice in wide field mode (C), details are lost due to out of the focus lights. Zeiss LSM710 CLSM with 63X/1.4 oil lens. Scale bar 10 μm.

2共焦激光掃描顯微鏡的缺點(diǎn)

激光共聚焦顯微鏡的點(diǎn)掃描特性注定該技術(shù)有一個(gè)缺點(diǎn)，圖像是由單個(gè)像素掃描形成的，共聚焦顯微鏡是部相對(duì)緩慢的儀器。一幅典型的1 024*1 024像素的圖像，用一個(gè)常用的2微秒每個(gè)像素點(diǎn)停留時(shí)間，形成一幅圖像的時(shí)間長(zhǎng)達(dá)超過(guò)2秒。此外，為了在一個(gè)合理的時(shí)間框架內(nèi)得到一幅圖像，共聚焦顯微鏡使用一個(gè)強(qiáng)大的激光光源，以減少像素點(diǎn)停留時(shí)間。這種光的強(qiáng)度通常比一個(gè)典型的寬場(chǎng)熒光顯微鏡熒光燈強(qiáng)度超過(guò)1 000倍以上。因此，光漂白是共聚焦顯微鏡的一個(gè)主要問(wèn)題。通常一個(gè)合適的儀器參數(shù)的調(diào)整是這些因素的綜合結(jié)果，我們將在接下來(lái)的幾節(jié)詳細(xì)討論。

3高質(zhì)量圖象的判斷

在討論共聚焦顯微鏡圖像采集之前，我們需要首先討論如何定義一幅“好的圖像”。對(duì)于科學(xué)的影像，它必須滿足一些最基本的標(biāo)準(zhǔn)：豐富的科學(xué)內(nèi)涵，是具有代表性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，沒(méi)有缺陷和具有科學(xué)意義。雖然這些都是很難量化的硬標(biāo)準(zhǔn)， 但是一幅“好”的科學(xué)圖片應(yīng)該有：a)噪聲低，圖像的亮度是線性的而且沒(méi)有飽和的像素 ；b)沒(méi)有標(biāo)記的區(qū)域應(yīng)該盡可能接近黑色。對(duì)圖像質(zhì)量的一個(gè)非常簡(jiǎn)單的評(píng)估方法是通過(guò)檢查圖像的直方圖(圖中的像素的數(shù)目與像素強(qiáng)度值)。一幅好的圖像其像素的強(qiáng)度會(huì)分布在最低和最高的像素值之間，而不是集中在最低端或最高端(即沒(méi)有飽和或截?cái)嘞袼貜?qiáng)度現(xiàn)象)。

4共聚焦顯微鏡樣品的制備

共聚焦顯微鏡是可以用來(lái)采集各種不同熒光標(biāo)記的樣品圖像的， 所以每臺(tái)共聚焦顯微鏡是由各種不同的物鏡和激光波長(zhǎng)組合而成。這些都是在樣品標(biāo)記之前需要知道的共聚焦顯微鏡的重要參數(shù)，很少有博士生或博士后可以指定一個(gè)儀器的規(guī)格。因此，在樣品標(biāo)記之前，最重要的是要知道可用的共聚焦顯微鏡激光波長(zhǎng)，這決定了可用于標(biāo)記樣品染色的熒光染料。表1提供了一個(gè)常見(jiàn)的共聚焦顯微鏡激光波長(zhǎng)及其可以激發(fā)的一些常見(jiàn)的熒光染料。另外一個(gè)要考慮的因素是實(shí)驗(yàn)的要求以及光穩(wěn)定性。一般來(lái)說(shuō)，多色標(biāo)記熒光染料應(yīng)該有不同的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)并且有高的光穩(wěn)定性。大多數(shù)現(xiàn)代染料(如Cyanine, Alexa染料系列)比以前的(如FITC)更明亮、更穩(wěn)定。

表1常見(jiàn)的激光共聚焦顯微鏡激光激發(fā)波長(zhǎng)和可以激發(fā)的常見(jiàn)熒光染料

Table 1Common CLSM laser lines and the fluorophores which the laser line could be used to excite the dyes

激光波長(zhǎng)/nmLaserwavelength/nm常見(jiàn)熒光標(biāo)記物Commonfluorescentlabels405BFP,DAPI,Hoechst,Alexa405440CFP,Cerulean480EGFP,Alexa488,FITC514YFP,Rhodamine561DsRed,Tritc,Cy3;Alexa568594Texasred,mCherry,mRFP,633Cy5,Alexa647

“垃圾進(jìn)，垃圾出”，這在任何生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中都一樣，對(duì)共聚焦顯微鏡更是如此，共聚焦顯微鏡對(duì)其樣品的質(zhì)量要求尤其嚴(yán)格。首先，共聚焦顯微鏡的樣品必須做熒光標(biāo)記，像其他任何生物學(xué)實(shí)驗(yàn)一樣，樣品標(biāo)記也需要做一些基本的對(duì)照實(shí)驗(yàn)，比如對(duì)使用的抗體試劑的抗原驗(yàn)證，標(biāo)記濃度的優(yōu)化和對(duì)照實(shí)驗(yàn)都必須在共聚焦顯微鏡觀察之前進(jìn)行；此外，由于共聚焦顯微鏡采用針孔成像，圖像質(zhì)量尤其容易受其制樣質(zhì)量的影響，樣品不但應(yīng)該有高信噪比的標(biāo)記，更重要的是使用與顯微鏡物鏡設(shè)計(jì)匹配的折射率的包埋物和使用適當(dāng)厚度的蓋玻片。大多數(shù)顯微鏡物鏡設(shè)計(jì)的光學(xué)矯正蓋玻片是1.5 號(hào)蓋玻片，其厚度是0.17 mm，蓋玻片厚度對(duì)干鏡和浸泡物鏡尤其重要。包埋介質(zhì)是顯微鏡的光學(xué)通路的一部分，在圖像形成中起著關(guān)鍵的作用。表2給出了一些常用的包埋介質(zhì)及其光學(xué)特性，用戶可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)選擇合適的一種。 一般而言，硬化的包埋介質(zhì)方便并可以長(zhǎng)期儲(chǔ)存(幾星期至數(shù)月)，但由于其單體的聚合過(guò)程，經(jīng)常會(huì)有明顯的樣品萎縮，這對(duì)三維重建會(huì)有負(fù)面影響。以甘油為基礎(chǔ)的包埋介質(zhì)是暫時(shí)的，但它常常提可以通?？梢蕴峁└玫娜S形態(tài)。一種光學(xué)特性比較好的包埋介質(zhì)是2,2’-硫基二乙醇(2,2’-Thiodiethanol)。它不需要脫水并且是一種非常有效的防褪色劑也與浸油折射率匹配。然而它不是永久性的，而且它不與DIC或相差顯微技術(shù)兼容。在大多數(shù)情況下，在包埋介質(zhì)中還要加一些防褪色劑。 商業(yè)產(chǎn)品包埋介質(zhì)如 FluoraGold或Vectorsheild已經(jīng)包含一些防褪色劑。如果實(shí)驗(yàn)室自己做配制包埋介質(zhì)，需要加一些防褪色劑。表3列出了一些常見(jiàn)的防褪色劑及其使用濃度。

表2　共聚焦顯微鏡樣品制備常用的樣品包埋介質(zhì)及其光學(xué)特性

注： PVA，Prolong Gold， DPX， Permount 都可以固化。

Note：PVA，Prolong Gold， DPX， Permount can be solidified.

表3　熒光顯微鏡 樣品包埋常見(jiàn)的防褪色劑及其使用濃度

5激光共聚焦顯微鏡的成像設(shè)置

任何共聚焦顯微鏡，包括不同的品牌的儀器或配置，基本的工作流程如下：

5.1　定位樣品-選擇合適的物鏡以及定位感興趣的區(qū)域

共聚焦顯微鏡是一個(gè)取樣的過(guò)程。比如，典型密度的培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，在一張22 mm×22 mm的蓋玻片上大概有25~100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞。激光共聚焦顯微鏡圖像采集僅獲得這些細(xì)胞中的幾十到幾百個(gè)有代表性細(xì)胞的圖像。如果要得到有代表性的圖像，最重要的是要做先期觀察，在使用激光共聚焦顯微鏡前花一些時(shí)間在熒光顯微鏡下觀察標(biāo)本，這比共聚焦顯微鏡觀察要快得多。

大多數(shù)的顯微鏡使用者都知道他們需要觀察他們的樣本的放大倍數(shù)。然而，很少有人問(wèn)及物鏡的數(shù)值孔徑(NA)是什么。事實(shí)上數(shù)值孔徑是考慮共聚焦顯微鏡成像的最重要的因素，該參數(shù)定義了透鏡的光收集能力 (信號(hào)強(qiáng)度)，它也是確定圖像分辨率的一個(gè)最重要的參數(shù)。顯微鏡的分辨率被定義為d= 0.61×λ/NA，其公式中是沒(méi)有放大倍數(shù)這個(gè)因子的。共聚焦顯微鏡是一個(gè)掃描儀器，其縮放因子確定掃描區(qū)域和最終放大倍數(shù)。

在物鏡的選擇上，只要有可能，選擇最高的數(shù)值孔徑的物鏡，而且保證該物鏡的視野大小允許觀察樣本的感興趣區(qū)域。用另外一個(gè)方式講， 樣品的大小決定了物鏡的放大倍數(shù)。一般而言，物鏡的放大倍數(shù)越高視野越小。共聚焦顯微鏡應(yīng)選擇最高的NA物鏡。 這不僅使采集的圖像的高分辨率更高， 也會(huì)因?yàn)殓R頭收集光量的增加使圖像有更好的信噪比。 這是因?yàn)槲镧R采集的信號(hào)強(qiáng)度與數(shù)值孔徑的平方成正比的：

信號(hào)強(qiáng)度I∝NA4/MAG2

對(duì)于微弱熒光染色，提高信號(hào)強(qiáng)度的最有效的方法是使用一個(gè)高數(shù)值孔徑的物鏡。

5.2　設(shè)置掃描系統(tǒng)參數(shù)

5.2.1濾光片配置

共聚焦激光掃描顯微鏡一般用來(lái)處理不同的成像要求以及盡可能多的熒光染料樣品的組合。因此，使用激光共聚焦顯微鏡成像的第一步是建立對(duì)特定樣品染料組合的掃描系統(tǒng)的配置。幸運(yùn)的是，這通常是最不令人擔(dān)憂的一步，因?yàn)榇蠖鄶?shù)生產(chǎn)廠商或核心設(shè)施操作員已經(jīng)建立了類似的應(yīng)用程序庫(kù)，需要使用的時(shí)候把相應(yīng)的配置調(diào)出來(lái)就可以了。如果不清楚應(yīng)該使用哪個(gè)設(shè)置， 請(qǐng)?jiān)兦髢x器操作員的幫助。這些設(shè)置通常需要對(duì)儀器以及熒光顯微鏡技術(shù)有更深層次的了解，超出了本文討論范圍。此外，還有一些關(guān)于多顏色樣品的圖像采集的特殊的注意事項(xiàng)，我們將在稍后(第7部分)討論。

5.2.2針孔孔徑大小和掃描速度的設(shè)置

激光共聚焦顯微鏡使用針孔阻斷聚焦平面以外的光，所以設(shè)置的第一個(gè)因素是針孔孔徑的大小。這通常是設(shè)置為1 Airy 單位，一般情況下1 Airy 單位適用于大多數(shù)的激光共聚焦顯微鏡的成像狀況，僅在一些特殊情況下需要調(diào)整針孔孔徑的大小。針孔的大小不僅僅影響一個(gè)共聚焦顯微鏡光學(xué)切片的厚度，而且還對(duì)檢測(cè)器的信號(hào)的強(qiáng)度有非常大的影響[5]，尤其在樣品折射率不匹配的情況下，需要調(diào)節(jié)針孔孔徑來(lái)補(bǔ)償因?yàn)榍蛎嫦癫疃鸬男盘?hào)衰減。比如用一個(gè)40X/NA 1.3的油鏡聚焦到10 μm深的活細(xì)胞的水溶液樣品中，共聚焦顯微鏡針孔的能量水平(即圖像整體亮度)會(huì)下降到50%。在這樣的情況下，針孔可以被設(shè)置為大于1 Airy單位，用以補(bǔ)償因?yàn)檎凵渎什黄ヅ涠鸬男盘?hào)衰減。另外，當(dāng)樣品熒光信號(hào)太弱或者漂白現(xiàn)象過(guò)于嚴(yán)重的情況下，也可以調(diào)節(jié)針孔孔徑的大小來(lái)增加信號(hào)強(qiáng)度。

共聚焦顯微鏡是一部點(diǎn)式掃描儀器，掃描速度決定了每個(gè)像素的積分時(shí)間，縮短單個(gè)像素的停留時(shí)間會(huì)導(dǎo)致減少每個(gè)像素成像的光子數(shù)。通常，掃描速度設(shè)置為單個(gè)像素的停留時(shí)間1~2 μs。 更慢的掃描速度將不僅僅增加圖像采集需要的時(shí)間，而且會(huì)加重光漂白現(xiàn)象。

5.3　圖像空間分辨率的設(shè)置

共聚焦顯微鏡的圖像最終的空間分辨率通常是由圖像幅的大小(圖像的像素?cái)?shù))和縮放因子的大小(掃描的區(qū)域)兩個(gè)設(shè)置決定的，這兩個(gè)參數(shù)是彼此相關(guān)的， 增加像素的數(shù)目和(或)減少的掃描區(qū)域?qū)?huì)增加共聚焦顯微鏡圖像的最終分辨率。然而，分辨率的增加是有限制的，超過(guò)一定的分辨率，增加更多的像素或縮小更小的掃描區(qū)域?qū)⒉粫?huì)再提高分辨率，這是因?yàn)楣鈱W(xué)顯微鏡分辨率是有限的。超越某個(gè)臨界點(diǎn)的縮放因子會(huì)產(chǎn)生一種稱為空放大的情況。在這種情況下，除了需要更多的時(shí)間來(lái)獲取圖像之外，熒光顯微鏡的光漂白現(xiàn)象會(huì)嚴(yán)重得多。這是因?yàn)楣馄姿俾适桥c縮放因子的平方成正比的：

光漂白速率=R∝k(縮放因子)2

因此，在共聚焦顯微鏡空間分辨率的設(shè)置中關(guān)鍵的目標(biāo)是要捕獲到顯微鏡可以提供的最高分辨率并且同時(shí)沒(méi)有達(dá)到空放大狀態(tài)。這個(gè)設(shè)置對(duì)共區(qū)域化分析這樣的實(shí)驗(yàn)尤其重要，這是因?yàn)槠浞治鼋Y(jié)果在很大程度上取決于圖像的分辨率(見(jiàn)第6部分)。大多數(shù)的現(xiàn)代共聚焦顯微鏡會(huì)自動(dòng)提供一個(gè)最佳的像素大小的值(即每個(gè)像素所代表樣品的空間大小的最佳尺寸)。這個(gè)值通常是根據(jù)顯微鏡的理論分辨率，用Nyquist-Shannon采樣率計(jì)算而來(lái)。為了保持圖像的信息內(nèi)容，Nyquist-Shannon采樣定率要求圖像數(shù)字化后像素的尺寸(即每個(gè)像素所代表樣品的空間大小)至少小于光學(xué)系統(tǒng)的分辨率極限的2.3倍。比如，用一個(gè)20X/NA 0.8物鏡收集一個(gè)用Alexa 488染料標(biāo)記的樣品，掃描系統(tǒng)使用的收集發(fā)射波長(zhǎng)為505 nm長(zhǎng)通濾光片。該儀器的理論分辨率可以根據(jù)Abbe定律計(jì)算：

d=0.61×505 nm/0.8=385 nm

使用Nyquist-Shannon因子2.5(請(qǐng)注意Nyquist初始值為2.3，但是這個(gè)值可以延伸到3。通常，一個(gè)2.5的值是比較實(shí)用和適合于成像的)，每個(gè)像素的最佳值為：

d像素=385 nm/2.5=154 nm

最后的像素尺寸應(yīng)該通過(guò)調(diào)整縮放因子和圖像幅的大小(圖像的像素?cái)?shù))達(dá)到這個(gè)值，該值確保了圖像的最高的分辨率，但是尚未達(dá)到空放大狀態(tài)，具體的設(shè)置方式取決于樣本和實(shí)驗(yàn)要求。通常最終圖像發(fā)表出版印刷時(shí)，一幅1 024*1 024的圖像以300 dpi的圖像被打印出來(lái)大體在半頁(yè)左右。所以一般圖像像幅不應(yīng)該低于1 024*1 024。有些人喜歡使用固定的圖像像幅大小而改變縮放因子大小來(lái)調(diào)節(jié)，以達(dá)到最終Nyquist-Shannon采樣率。而其他人(主要是組織研究成像領(lǐng)域)更喜歡先設(shè)置掃描區(qū)域大小(即縮放因子)，后使用增加或減少像素?cái)?shù)來(lái)調(diào)整到Nyquist-Shannon采樣率。對(duì)于三維重組成像，共聚焦顯微鏡圖像需要不僅僅在XY 平面, 而且需要在Z軸以Nyquist-Shannon采樣率采樣的： 即軸向的像素尺寸應(yīng)該是軸向分辨率除以2.5。

5.4　圖像對(duì)比度和亮度的設(shè)置

空間分辨率設(shè)置完成后，圖像的對(duì)比度和亮度需要根據(jù)樣品的染色情況調(diào)整。 這取決于：(1)染色的強(qiáng)度；(2)激光激發(fā)強(qiáng)度；(3)檢測(cè)器的靈敏度(在大多數(shù)情況下是光電倍增管(Photo multiplier tube, PMT)；(4)系統(tǒng)的放大系數(shù)。最終的目標(biāo)是數(shù)字文件圖像應(yīng)該具有完整的動(dòng)態(tài)范圍， 沒(méi)有飽和像素或被截止的信號(hào)。通常激光共聚焦顯微鏡會(huì)用一種特殊的查找表(LUT，有時(shí)稱為范位指示器(range indicator)或發(fā)光規(guī)模指示器(glowing scale) )把極端強(qiáng)度的像素用假彩色(peudocolors)顯示出來(lái)(如紅色顯示飽和像素，藍(lán)色顯示值為0的像素)，像素的極端值之間的像素用灰度顯示。儀器使用者應(yīng)該詢問(wèn)儀器操作員或廠家如何把圖像顯示用這個(gè)特殊的查找表顯示出來(lái)以方便調(diào)整圖像的對(duì)比度和亮度，因?yàn)檫@是調(diào)節(jié)圖像的兩個(gè)重要參數(shù)的唯一可靠的方法。一般共聚焦顯微鏡的顯示器并沒(méi)有被校準(zhǔn)過(guò)。而且人視覺(jué)感受敏感度是會(huì)因?yàn)榄h(huán)境照明條件和使用彩色而變化的，所以不能根據(jù)操作員的感覺(jué)來(lái)調(diào)整圖像的對(duì)比度。

在以下描述的對(duì)圖像對(duì)比度亮度調(diào)節(jié)的一般指導(dǎo)方法里，熒光探測(cè)器需要一些初始和定期的性能評(píng)估。一般而言，共聚焦顯微鏡的操作人員應(yīng)該已經(jīng)為每個(gè)熒光探測(cè)器測(cè)繪了一幅噪聲水平與所施加的檢測(cè)器電壓的相關(guān)圖 (通常是在探測(cè)器無(wú)光條件下所得到的圖像的標(biāo)準(zhǔn)偏差)。這幅圖會(huì)估計(jì)該探測(cè)器在不同電壓下的噪聲水平。更重要的是，這會(huì)給使用者一個(gè)PMT電壓的有效使用范圍，電壓太高會(huì)使圖像中的噪聲超標(biāo)，太低則可能使用了不必要高的激發(fā)光光量。

設(shè)置圖像對(duì)比度和亮度的一般準(zhǔn)則：(1) 改變圖像顯示查找表(LUT)為范圍指示器(或有時(shí)稱為發(fā)光規(guī)模指示器)。(2) 設(shè)置系統(tǒng)放大增益為1(有的系統(tǒng)沒(méi)有這個(gè)設(shè)置)和調(diào)整增益/PMT電壓有少量的飽和像素。如果增益太高(在圖像中的擴(kuò)噪音太大)，則做以下的一個(gè)或其組合：①增加系統(tǒng)放大增益和降低PMT電壓到合理的水平(在有用的范圍內(nèi)); ②如果允許的話，打開(kāi)針孔孔徑(即使擴(kuò)展到2到3個(gè)Airy單位也能得到合理的共聚焦圖像); ③調(diào)整(增加)激光強(qiáng)度。但是染料飽和點(diǎn)(大部分染料分子被招募到發(fā)射熒光的激發(fā)光強(qiáng)度)決定了熒光信號(hào)的上限。在超過(guò)一定范圍的激光強(qiáng)度的增加只會(huì)增加熒光標(biāo)記物的漂白速度。這時(shí)激光強(qiáng)度的增加并不能增加信號(hào)的強(qiáng)度，但是會(huì)使熒光標(biāo)記物的漂白發(fā)生得更快。如果增益太低(非常低的PMT電壓， 一般PMT低于500 V)或如果發(fā)生過(guò)度漂白現(xiàn)象，則降低激光強(qiáng)度和調(diào)整(增加)PMT電壓。 (3)調(diào)整圖像的亮度。在圖像中有幾個(gè)黑色像素 (像素值為零)。(4) 檢查直方圖的最終圖像的結(jié)果，以確保沒(méi)有飽和或切斷像素值。如果需要的話，微調(diào)增益設(shè)置。(5) 如果樣本是多顏色標(biāo)記， 對(duì)每個(gè)色彩重復(fù)(1)~(4)步。

5.5　圖像的優(yōu)化

如果圖像對(duì)比度和亮度是按如上所述部分設(shè)置的話，則大多數(shù)情況下不需要任何圖像優(yōu)化步驟。然而通常一個(gè)典型的共聚焦顯微鏡圖像包含大量的噪聲，這是由于在衍射極限斑點(diǎn)內(nèi)的光子強(qiáng)度是有限的，而且共聚焦顯微鏡采用光電倍增管作為探測(cè)器，過(guò)度放大情況下光電倍增管自己會(huì)產(chǎn)生大量噪聲，當(dāng)時(shí)間分辨率允許的時(shí)候，平均是最有效的減噪方法，這是以犧牲獲取圖像的時(shí)間為代價(jià)的。此外，增加激光的功率或打開(kāi)針孔孔徑也可以提高探測(cè)器的光信號(hào)水平，從而獲得一個(gè)更好的信噪比圖像。圖2顯示了平均對(duì)圖像的影響。

圖2　激光共聚焦顯微鏡成像的平均的效果體外培養(yǎng)的HeLa細(xì)胞核DAPI的標(biāo)記Fig.2　Effect of averaging. Cultured Hela cells labelled with DAPI and imaged with a CLSM.　　注：圖像的上半部平均16次可以觀察到一些核結(jié)構(gòu)的細(xì)節(jié);而下半部沒(méi)有平均的成像的區(qū)域因?yàn)闄z測(cè)器的噪聲完全觀察不到核染色的細(xì)節(jié)。Zeiss LSM710激光共聚焦顯微鏡， 63X/1.4油鏡， 刻度條10 μm。Note:The top half of the image was averaged 16X time where some nuclear structure details are visible while the bottom half was imaged without averaging. Noises from the detector totally abolished the staining details. Scale bar 10 μm.

5.6　獲取并保存圖像

激光共聚焦顯微鏡所有參數(shù)設(shè)置好后，掃描圖像，待掃描結(jié)束后將獲得的圖像保存于電腦中。

6多彩色熒光顯微鏡成像問(wèn)題

多色熒光成像在激光共聚焦顯微鏡設(shè)置每個(gè)顏色通道的總的指導(dǎo)思想是和單色成像一樣，多色熒光成像有其自身的問(wèn)題值得討論：第一個(gè)問(wèn)題是熒光分子的光譜重疊的問(wèn)題，大多數(shù)熒光物質(zhì)具有廣譜性，即其激發(fā)和發(fā)射光譜分布在幾十甚至上百納米范圍內(nèi)。這些包括交叉激發(fā)以及發(fā)射重疊兩方面的問(wèn)題。通過(guò)順序掃描(如獲得單獨(dú)的顏色的圖像后再掃描另外一個(gè)熒光信號(hào))，可以有效地消除發(fā)射波譜重疊問(wèn)題。但另一方面，交叉激發(fā)在激光共聚焦顯微鏡非常普遍， 這是由共聚焦顯微鏡使用強(qiáng)大的激發(fā)光和熒光分子的相對(duì)較寬的激發(fā)光譜造成的，只能用單獨(dú)標(biāo)記的樣品對(duì)照樣品來(lái)監(jiān)測(cè)以確保沒(méi)有發(fā)生這種情況，尤其在共區(qū)域化分析中特別重要。

另一個(gè)多色彩共區(qū)域化分析的題是色差，色差是物鏡對(duì)不同波長(zhǎng)的光聚焦不在同一點(diǎn)上。所以第一需要了解所使用的物鏡的特性， 不是所有的物鏡對(duì)所有的波長(zhǎng)都做色差校正的。 第二， 即使物鏡對(duì)所使用的波長(zhǎng)做了色差校正，由于樣品的折射率不匹配所造成的球面像差也會(huì)引起色差。一些共聚焦顯微鏡配備準(zhǔn)直器允許某些波長(zhǎng)在軸向的移動(dòng)，色差對(duì)共區(qū)域化分析實(shí)驗(yàn)非常重要，確保共區(qū)域信號(hào)是真正來(lái)自同一結(jié)構(gòu)，這可以通過(guò)使用低于光學(xué)分辨率的多彩珠子(0.1~0.2 μm)并觀察其三維圖像來(lái)驗(yàn)證。如果有色差，可以通過(guò)調(diào)節(jié)準(zhǔn)直器消除或者消除色差因素(如調(diào)節(jié)包埋介質(zhì)折射率或使用適當(dāng)厚度的蓋玻片)或在共區(qū)域化分析之前對(duì)圖像使用適當(dāng)?shù)能浖M(jìn)行前期處理。

7激光共聚焦顯微鏡的擴(kuò)展應(yīng)用

提供一些常見(jiàn)的激光共聚焦顯微鏡擴(kuò)展技術(shù)應(yīng)用例子。大多數(shù)著重于共聚焦顯微鏡圖像采集方面的討論。

7.1　多色彩共區(qū)域化分析

多色彩共區(qū)域化分析是共聚焦顯微鏡最常見(jiàn)的應(yīng)用， 將檢測(cè)到的兩個(gè)或更多的信號(hào)定位在相同的像素或體素(三維)，共聚焦顯微鏡圖像特別適合做這樣的分析，因?yàn)槠鋱D像的高清晰度提供了進(jìn)行這種分析的基礎(chǔ)。 對(duì)這種分析最關(guān)鍵是高分辨率的圖像采集和系統(tǒng)性能的監(jiān)測(cè)(例如色差誤差)。多色彩共區(qū)域化分析有許多發(fā)表的算法[6,7]。此外，這種分析中的共聚焦顯微鏡圖像采集的另一個(gè)最重要因素是噪聲，提高標(biāo)記的信噪比和使用更多的平均可以有效地減少噪聲。圖像的空間分辨率應(yīng)在XY和Z軸方向都遵循Nyquist-Shannon采樣率。

7.2　三維重組

激光共聚焦顯微鏡不僅可以獲得多彩色的2維圖像，也可以實(shí)現(xiàn)對(duì)較厚 (>10 μm)生物樣品的快速三維重建。這是共聚焦顯微鏡最主要的技術(shù)優(yōu)勢(shì)。但是如果樣品厚度僅幾微米，使用激光共聚焦顯微鏡沒(méi)有明顯的優(yōu)勢(shì)。在這種情況下，一個(gè)寬領(lǐng)域的熒光顯微鏡將可以做類似的工作而且更經(jīng)濟(jì)。圖3為一個(gè)果蠅幼蟲(chóng)大腦中5羥色胺神經(jīng)元的共聚焦顯微鏡的三維重建。該樣本總體厚度將近250 μm。 可以看到單個(gè)光學(xué)切片是不可能反映其神經(jīng)結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性的。只有在三維重建之后才可以對(duì)其神經(jīng)的總體概況有全面的了解。在正交圖像中，可以觀察其三維內(nèi)部結(jié)構(gòu)。

7.3　連續(xù)拍攝

使用綠色熒光蛋白標(biāo)記(GFP)或其他活體熒光標(biāo)記物的樣本(例如鈣活動(dòng)指示劑等)，激光共聚焦顯微鏡可以連續(xù)拍攝圖像?？梢允褂眉す夤簿劢癸@微鏡來(lái)觀察和研究生物活動(dòng)。雖然共聚焦顯微鏡是工作過(guò)程相對(duì)比較緩慢，但是還是可以足夠快對(duì)許多生物學(xué)事件進(jìn)行觀察。即使是單點(diǎn)掃描激光共聚焦顯微鏡，一些制造商將共振掃描儀結(jié)合在掃描光路，這項(xiàng)技術(shù)可以把激光共聚焦顯微鏡的掃描速度的提高到視頻速率(每秒30幀)。此外，可以限制區(qū)域的掃描(甚至降低成像到一個(gè)單線掃描)，這允許激光共聚焦顯微鏡對(duì)更快的事件進(jìn)行研究(時(shí)間分辨率可以達(dá)到毫秒范圍內(nèi))。而且較新的儀器采用更靈敏的探測(cè)器，它允許使用更短的像素掃描時(shí)間來(lái)提高時(shí)間分辨率。 一般來(lái)說(shuō)對(duì)激光共聚焦顯微鏡的活細(xì)胞成像，最重要的是減少光漂白導(dǎo)致的光毒性，可以使用最小的激光強(qiáng)度、最高靈敏度的探測(cè)器、降低縮放因子和減少平均等幾個(gè)措施來(lái)減少光毒性。

圖3　果蠅幼蟲(chóng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)抗5-羥色胺抗體標(biāo)記的激光共聚焦顯微鏡成像(25X/NA 0.8, 油鏡)Fig.3　A Drosophila larvae Central nervous system labelled with anti-serotonin antibody and imaged with a CLSM (25X/NA 0.8 multi immersion oil)　　注：一幅單一的激光共聚焦顯微鏡光學(xué)切片(A)演示了染色的細(xì)節(jié)。然而，標(biāo)記的完整視圖只體現(xiàn)在127幅激光共聚焦顯微鏡光學(xué)切片的最大強(qiáng)度投影重建( B)。 C正交切片相同的幼蟲(chóng)可以通過(guò)虛擬切片詳細(xì)檢查。Note:A single CLSM optical section (panel A) demonstrates staining details. However, the complete view of the labelling is only evident in the Maximum intensity projection reconstruction of 127xxx CLSM optical sections in Panel B. Panel C showing orthogonal sections of the same larvae where the labelling could be examined in detail by virtual sectioning. In this case, the structure could be viewed in 3 directions.

此外，還有更多的方式提高激光共聚焦顯微鏡技術(shù)的時(shí)間分辨率。其中的一種叫做旋轉(zhuǎn)盤激光掃描共聚焦顯微鏡，它通過(guò)尼普科夫圓盤(Nipkow disk)將激光光束分為幾千個(gè)小的光束。通過(guò)檢測(cè)幾千個(gè)共焦針孔的同時(shí)掃描和陣列探測(cè)器如CCD攝像頭進(jìn)行圖像采集。因此，圖像不是通過(guò)單點(diǎn)掃描，而是通過(guò)一個(gè)平行的掃描/檢測(cè)系統(tǒng)得到一個(gè)更高的成像速度。高于視頻速率(>30幀·秒-1)共聚焦可以通過(guò)這樣的儀器實(shí)現(xiàn)。這類儀器的針孔孔徑是固定的， 它往往是優(yōu)化于某個(gè)數(shù)值孔徑的物鏡的。

7.4　分子間的相互作用和動(dòng)力學(xué)的技術(shù)探討

與基因編碼的熒光探針如綠色熒光蛋白(GFP)結(jié)合，激光共聚焦顯微鏡可以很容易地用于活細(xì)胞生物動(dòng)力學(xué)研究。其中一個(gè)方法就是所謂的FRAP(熒光漂白恢復(fù))，用強(qiáng)激光束漂白了感興趣的區(qū)域(ROI)。ROI恢復(fù)的速度可以提供許多關(guān)于熒光分子生物學(xué)意義的信息，如擴(kuò)散系數(shù)、分子的區(qū)域化、結(jié)合與未結(jié)合的組分等。圖4顯示一個(gè)典型的FRAP實(shí)驗(yàn)， 在EGFP標(biāo)記的組蛋白在方框內(nèi)被漂白后，在連續(xù)攝影的續(xù)幀中顯示出熒光分子的不同程度的恢復(fù) (B，C)。 圖E為ROI的恢復(fù)曲線，由此可以計(jì)算出半恢復(fù)時(shí)間。 FRAP技術(shù)可以用于做不同藥物處理或可能影響分子的結(jié)合特性的分子基因突變的檢測(cè)。

圖4　典型的激光共聚焦顯微鏡FRAP(熒光漂白后恢復(fù))實(shí)驗(yàn)——EGFP蛋白標(biāo)記的HeLa細(xì)胞的組蛋白Fig.4　A typical FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) experiment using CLSM. A Hela cell nucleus labelled with EGFP histone.　　注：A對(duì)感興趣要漂白的區(qū)域進(jìn)行繪制(方塊區(qū)域)和 強(qiáng)激光照射漂白(圖B)導(dǎo)致ROI內(nèi)熒光信號(hào)的消失。繼續(xù)攝影監(jiān)測(cè)(圖C和D)漂白區(qū)域的熒光信號(hào)的恢復(fù)。 熒光恢復(fù)程度提供分子的流動(dòng)性的信息。之后從熒光恢復(fù)曲線可以對(duì)圖像做量化分析得到半恢復(fù)期時(shí)間(E)。Note:A Region of interest were draw (box in Panel A) and photobleached with strong laser illumination (Panel B) and notice the ROI are fluorescence signal disappeared. Continuing timelapse observations (panel C and D) of the recovery of the fluorescence in the ROI could provide mobility information of the molecules. Then a fluorescence recovery curve would be calculated from timelapse images. The recovery half-life (thalf) could be obtained.

雖然激光共聚焦顯微鏡是一個(gè)光學(xué)顯微鏡技術(shù)，其分辨率是一般大約是其使用光的波長(zhǎng)的一半(Abbe定律)，最佳情況下只不過(guò)200 nm。然而激光共聚焦顯微鏡是可以用來(lái)檢測(cè)分子間的相互作用的。 通過(guò)一種FRET的技術(shù)(熒光共振發(fā)射轉(zhuǎn)移)，對(duì)熒光供體分子與受體分子通過(guò)偶極相互作用的測(cè)量， 可以測(cè)量供體分子與受體分子之間的距離，有許多種方法可以測(cè)量FRET信號(hào)強(qiáng)度。激光共聚焦顯微鏡可以很容易地實(shí)現(xiàn)受體漂白導(dǎo)致的供體熒光的恢復(fù)程度來(lái)測(cè)量FRET信號(hào)強(qiáng)度。此外， 雖然大多數(shù)的共聚焦顯微鏡采用連續(xù)波激光作為光源，有些可以用脈沖激光實(shí)現(xiàn)。在適當(dāng)?shù)挠布M合下，共聚焦顯微鏡可以測(cè)量熒光壽命。當(dāng)FRET發(fā)生時(shí)，供體熒光分子壽命縮短。這種縮短是獨(dú)立于熒光物質(zhì)的濃度的。 因此熒光壽命的測(cè)量是一種更為可靠的FRET測(cè)量方法。

7.5　沒(méi)有熒光標(biāo)記樣品的激光共聚焦顯微鏡成像

雖然共聚焦顯微鏡的設(shè)計(jì)主要是針對(duì)熒光標(biāo)記的樣品的，但該系統(tǒng)也可以通過(guò)反射式成像或樣品的自發(fā)熒光來(lái)實(shí)現(xiàn)非熒光樣品的成像。這尤其對(duì)植物樣品或如昆蟲(chóng)一樣具有外骨骼的樣品有特殊的應(yīng)用價(jià)值。

8結(jié)論

共聚焦顯微鏡無(wú)疑是許多熒光顯微鏡實(shí)驗(yàn)的首選工具。然而，對(duì)于系統(tǒng)的合理設(shè)置還需要一些顯微鏡的基本知識(shí)和對(duì)該技術(shù)的基本原理的理解才能更熟練高效地使用這項(xiàng)技術(shù)。該文總結(jié)了共聚焦顯微鏡圖像采集的一些重要影響因素?？傊?，

圖像采集要遵循Nyquist-Shannon采樣率以得到最佳的圖像空間分辨率。 而設(shè)置圖像的對(duì)比度和

亮度需要用適當(dāng)?shù)腖UT指標(biāo)以確保適當(dāng)?shù)膭?dòng)態(tài)信息的獲得。在此基礎(chǔ)上我們進(jìn)一步討論了一些常見(jiàn)的先進(jìn)熒光共焦顯微鏡的應(yīng)用。

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(編輯：馬榮博)

Confocal laser scanning microscopy，a general guideline and its applications

Sun Xuejun1,2, Yan Xizhong1, Hao Chi1*

(1.CollegeofAgriculture,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu, 030801，China； 2.DepartmentofExp.Oncology,UniversityofAlberta,CrossCancerInstitute,Edmonton,T6G1Z2Canada)

Abstract:Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM) is one of the most versatile fluorescence microscopy tools available in biological researches. Its popularity is mostly because of its remarkable optical sectioning and 3-Dimension (3-D) reconstruction capabilities. A CLSM could obtain sharp optical sections without out-of-focus blurs from a relatively thick biological specimen in a short period of time. A perfectly registered 3-D image stack from a CLSM allows extraordinary virtual visualization of the specimen. This technology review paper is intended for graduate students as well as young researchers to have some basic knowledge of the technology and intended to provide some guidelines for proficient usage of the equipment.

Key words:Fluorescence; Confocal; Microscopy; Imaging; 3-dimension reconstruction

中圖分類號(hào)：TH742.64

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1671-8151(2016)01-0001-09

基金項(xiàng)目：山西省“百人計(jì)劃”項(xiàng)目(201144)；山西省“131”領(lǐng)軍人才項(xiàng)目；山西省自然科學(xué)基金(2015011072)；山西農(nóng)業(yè)大學(xué)引進(jìn)人才科研啟動(dòng)項(xiàng)目(2014ZZ08)

通訊作者：*郝赤，教授，博士生導(dǎo)師。Tel：0354-6287289； E-mail: chihao99@yahoo.com

作者簡(jiǎn)介：孫學(xué)俊(1963-)，男(漢)，山西大同人，研究員，博士，研究方向：細(xì)胞影像、神經(jīng)生物學(xué)。

收稿日期：2015-11-03