2021 年南通市某養(yǎng)老機(jī)構(gòu)胃腸炎暴發(fā)疫情中諾如病毒分子分型分析*

陳 璐，季霄雷，虞 瑩

(江蘇省南通市疾病預(yù)防控制中心微生物檢驗(yàn)科，南通 226007)

諾如病毒屬于杯狀病毒科諾如病毒屬，是一種無包膜單股正鏈RNA 病毒，可以通過污染的水或食物傳播，極微量的病毒顆粒(約100 個(gè))即可發(fā)生感染[1]，是引起人類急性非細(xì)菌性胃腸炎的主要病原體，約50%的急性胃腸炎由該病毒引起[2]。其基因組全長7 000～7 700 bp，包括3 個(gè)開放閱讀框(open reading frames,ORFs)：ORF1 編碼包括依賴RNA 的RNA 聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp)在內(nèi)的非結(jié)構(gòu)蛋白；ORF2 編碼主要衣殼蛋白VP1；ORF3編碼次要衣殼蛋白VP2[3]。根據(jù)VP1 區(qū)全基因組核苷酸序列的不同，可將其分為5 個(gè)基因組，其中GⅠ、GⅡ和GⅣ可感染人類，GⅡ感染最常見，而GⅡ.4一直是病毒性胃腸炎的主要基因型[4]。

2021 年2 月，南通市某養(yǎng)老機(jī)構(gòu)發(fā)生一起急性胃腸炎暴發(fā)疫情，多名患者及工作人員出現(xiàn)惡心、嘔吐、腹瀉、腹痛等胃腸道癥狀，通過現(xiàn)場流行病學(xué)調(diào)查，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果，證實(shí)是由諾如病毒重組株感染引起的。本研究通過核酸檢測，核酸擴(kuò)增，測序和進(jìn)化分析，了解南通地區(qū)諾如病毒流行的分子分型，為今后的疫情防控提供資料。

1 對象與方法

1.1 標(biāo)本來源 使用含無菌保存液的病毒采樣管，采集發(fā)病患者肛拭子20 份，為查找傳染源，同時(shí)采集無癥狀工作人員肛拭子10 份。無菌采樣后均置于病毒保存管內(nèi)冷鏈條件下4 h 送檢南通市疾病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室。

1.2 標(biāo)本處理和核酸提取 送到即檢，將標(biāo)本充分渦旋振蕩后離心，取上清液300 μL，使用上海之江全自動(dòng)核酸提取儀(型號(hào)：EX 3600)和上海之江核酸提取試劑(批號(hào)：P20210106)提取核酸RNA，洗脫液為60 μL，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR) 檢測 使用中山達(dá)安諾如病毒核酸測定試劑盒(批號(hào)：20201202)，按照試劑盒說明書配置反應(yīng)體系(25 μL)，檢測儀器是ABI 7500 PCR 儀，反應(yīng)條件為：50 ℃，15 min；95 ℃，15 min；94 ℃，15 s，55 ℃，45 s，40 個(gè)循環(huán)。循環(huán)數(shù)≤38，曲線呈S 型且有明顯指數(shù)增長的判讀為陽性。

1.4 目的基因擴(kuò)增與測序 采用可同時(shí)擴(kuò)增RdRp區(qū)和VP1 區(qū)的正向引物Mon431：5'-TGGACIAGRGGICCYAAYCA-3'，反向引物G2-SKR：5'-CCRCCNGCATRHCCRTTRTACAT-3'。逆轉(zhuǎn)錄PCR 使用上海生工Takara One-step RT-PCR 試劑盒(型號(hào)：RR055)一步法擴(kuò)增諾如特征基因RdRp/VP1 區(qū)基因片段，目的片段長度為557 bp，擴(kuò)增反應(yīng)條件為：50 ℃30 min；94 ℃2 min；94 ℃30 min，65 ℃30 min，72 ℃1 min，35 個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，將有陽性條帶的產(chǎn)物送上海生工生物科技有限公司測序。

1.5 序列分析 將所測序列提交諾如病毒基因分型網(wǎng)站，獲得其基因型別。再與GenBank 中的諾如病毒參考序列進(jìn)行比對，Blast 尋找相似度最高的序列，使用MEGA 7.0 軟件中的neighor-joining(NJ)-P距離法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析采用1 000 個(gè)序列組。

2 結(jié)果

2.1 疫情概況 本起暴發(fā)疫情發(fā)生地為南通市某養(yǎng)老機(jī)構(gòu)，人員相對密集，暴發(fā)時(shí)間為2021 年2 月。首發(fā)病例為調(diào)查前1 d(2021 年2 月2 日)14:00 左右，其余病例的發(fā)病時(shí)間集中在17:00～20:00 時(shí)，年齡跨度比較大，59～104 歲，平均(80±20)歲，均為中老年人；男8 例，女12 例；其中合并糖尿病18 例，高血壓16 例，高血脂15 例，免疫力較差，生活習(xí)慣不良。

2.2 諾如病毒檢出結(jié)果 通過RT-qPCR 檢測，諾如病毒陽性檢出率為83.3%(25/30)，且均為GⅡ，其中患者檢出率為100.0%(20/20)，無癥狀工作人員為50.0%(5/10)。選取Ct 值≤30 的20 份標(biāo)本，提取的核酸經(jīng)普通RT-PCR 擴(kuò)增后，產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，18 份標(biāo)本在557 bp 處可見特異性片段，大小與預(yù)期相符，部分?jǐn)U增陽性標(biāo)本見圖1。

圖1 部分?jǐn)U增陽性條帶

2.3 序列分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析 將RT-qPCR 檢出的18 份標(biāo)本的產(chǎn)物進(jìn)行測序，測序成功16 條，諾如病毒在線分型工具結(jié)果顯示引起此次疫情暴發(fā)的型別有兩種：GⅡ.P16-GⅡ.4 Sydney2012(68.75%，11/16)和GⅡ.3-GⅡ.P12(31.25%，5/16)；同源性分析發(fā)現(xiàn)，各條序列間核苷酸同源性高達(dá)98%。將16 條序列與從GenBank 數(shù)據(jù)庫下載的諾如病毒參考株進(jìn)行比對，分別建立RdRp 區(qū)和VP1 區(qū)進(jìn)化樹，表明11 條GⅡ.P16 與MT501844.1(西班牙株)同源性較高，屬于同一個(gè)進(jìn)化分支，5 條GⅡ.P12 與MT127358.1 GⅡ(韓國株)處于同一分支，親緣性較高，見圖2；11條GⅡ.4 Sydney2012 與MW205667.1(北京株)同源性較高；5 條GⅡ.3 與MH842259.1(浙江臺(tái)州株)處在同一分支，見圖3。

圖2 南通地區(qū)16 株諾如病毒與10 條參考株(國外)RdRp 區(qū)進(jìn)化樹

圖3 南通地區(qū)16 株諾如病毒與10 條參考株(國內(nèi))VP1 區(qū)進(jìn)化樹

3 討論

諾如病毒主要通過糞口途徑傳播，傳染性極強(qiáng)，主要發(fā)生在人口密集的公共場所或半封閉環(huán)境，如學(xué)校、養(yǎng)老院、托幼機(jī)構(gòu)。全年均可發(fā)病，但具有較明顯的季節(jié)性，寒冷季節(jié)高發(fā)，因此又被稱為“冬季嘔吐病”，北半球高發(fā)時(shí)間為10 月～次年3 月，南半球是4～9 月。人群普遍易感，可累及任何年齡，尤其是免疫力低的兒童和老年人?；颊?、隱型感染者、健康帶菌者均可成為傳染源。此次諾如病毒暴發(fā)疫情，經(jīng)現(xiàn)場流行病學(xué)調(diào)查，排除水源性和食源性感染的可能，考慮傳播方式為人與人近距離接觸和氣溶膠傳播。由該病毒導(dǎo)致的急性胃腸炎多呈自限性，成人多數(shù)表現(xiàn)為腹瀉，兒童表現(xiàn)為嘔吐。

在眾多的基因型中，GⅡ.4 依靠自身較強(qiáng)的變異能力以及高變區(qū)位于病毒衣殼表面多變的免疫識(shí)別受體相互作用的功能，屬于Nov 優(yōu)勢基因型，其不同的變異亞型在各自的變異環(huán)境中具有更高的感染性[5]。該型別常引起世界范圍的大暴發(fā)，每隔2～3 年出現(xiàn)1 個(gè)新的變異株，并在世界范圍內(nèi)引起大流行[6]。GⅡ.4 Sydney2012 是2012 年首次在澳大利亞悉尼被發(fā)現(xiàn)的，隨后在我國多省份被相繼報(bào)道并成為主要流行亞型，充分說明了GⅡ.4 全球流行的特點(diǎn)和持續(xù)突變的適應(yīng)能力[7]。最近的研究[8-9]表明GⅡ.P16-GⅡ.4 Sydney2012 是由GⅡ.2 型和GⅡ.4 Sydney2012 株重組后形成的新的重組株，重組發(fā)生在GⅡ.P16 RdRp 基因。GⅡ.P16 在人群中具有低傳播的優(yōu)勢，可以逃脫固有免疫而達(dá)到在人群中廣泛流行的目的[10]。

本次調(diào)查中，在采集的10 份無癥狀感染中檢出諾如病毒陽性5 份，基因型均為GⅡ.P12-GⅡ.3，但均未表現(xiàn)出明顯的胃腸道癥狀，這可能與中青年免疫力相對較強(qiáng)有關(guān)。GⅡ.P12-GⅡ.3 屬于常見的重組類型，在江蘇鎮(zhèn)江、無錫均有報(bào)道，是引起北京和武漢兒童腹瀉病檢測中最多的重組類型，分別占非GⅡ.4 重組類的54.2%和54.9%[11-12]。該型別主要出現(xiàn)在亞太地區(qū)，如日本、韓國、中國等[13]，本研究也發(fā)現(xiàn)了這種重組類型且與韓國株同源。GⅡ.3-GⅡ.P12毒株在2009—2015 年均有發(fā)現(xiàn)且多發(fā)生在青少年群體中。機(jī)構(gòu)工作人員社會(huì)活動(dòng)面廣，人員接觸多，流行病學(xué)調(diào)查時(shí)其中一名工作人員回憶后說自家小孩在數(shù)日前出現(xiàn)嘔吐、腹瀉癥狀，但未引起注意，也未有效處理嘔吐物導(dǎo)致自身感染，也是造成本重組株暴發(fā)的直接原因。

諾如病毒的基因組經(jīng)常在ORF1 區(qū)和ORF2 區(qū)發(fā)生重組，這導(dǎo)致諾如病毒的遺傳分化更大，因此，RdRp 和衣殼蛋白的基因型可能因重組而不同。諾如病毒易變異，存在多種抗原類型和基因型，出現(xiàn)的重組株更表現(xiàn)出抗原的多樣性，易引起疫情暴發(fā)。2014年之前，全球范圍內(nèi)諾如病毒暴發(fā)的基因型多為GⅡ.4 型，近年來主要流行亞型為GⅡ.4 Sydney2012，本次調(diào)查檢出11 條該型別且已經(jīng)形成獨(dú)立的分支，未來很有可能繼續(xù)流行，應(yīng)加強(qiáng)監(jiān)測。

近年來，由諾如病毒引起的急性胃腸炎病例報(bào)道逐漸增多，這可能與諾如病毒抗原漂移和基因重組的方式進(jìn)化有關(guān)[14]，本次測序結(jié)果顯示在一起暴發(fā)疫情中檢出兩種重組基因型，充分說明了諾如病毒變異頻繁的特點(diǎn)。

由諾如感染引起的急性暴發(fā)疫情多數(shù)是由于嘔吐物未得到及時(shí)有效的處理，造成氣溶膠傳播。本次調(diào)查的是發(fā)生在養(yǎng)老機(jī)構(gòu)的暴發(fā)疫情，首例患者嘔吐后未第一時(shí)間消毒，而僅做簡單的清掃拖地處理，給病毒傳播創(chuàng)造了條件，同時(shí)也與老年人免疫力低下、衛(wèi)生習(xí)慣不良以及環(huán)境封閉有關(guān)，應(yīng)加強(qiáng)人員管理，減少流動(dòng)，加強(qiáng)健康宣傳教育。