林伍德連翹的組織培養(yǎng)技術(shù)

范淑芳， 簡大為， 羅蘭艷， 羅 峰， 李 偉

(1.荊楚理工學(xué)院 生物工程學(xué)院， 湖北 荊門 448000； 2.荊門市林業(yè)局， 湖北 荊門 448000； 3.荊門市林業(yè)科學(xué)研究所， 湖北 荊門 448000)

林伍德連翹的組織培養(yǎng)技術(shù)

范淑芳1， 簡大為2*， 羅蘭艷3， 羅 峰3， 李 偉2

(1.荊楚理工學(xué)院 生物工程學(xué)院， 湖北 荊門 448000； 2.荊門市林業(yè)局， 湖北 荊門 448000； 3.荊門市林業(yè)科學(xué)研究所， 湖北 荊門 448000)

為大規(guī)模工廠化生產(chǎn)林伍德連翹，以當(dāng)年生新枝為外植體建立無菌組培苗進(jìn)行增殖及生根培養(yǎng)試驗(yàn)。結(jié)果表明：林伍德連翹的增殖培養(yǎng)基以WPM+ZT0.5 mg/L+NAA0.01 mg/L較為適宜，生根培養(yǎng)基則以1/2WPM+IBA 0.50 mg/L較為適宜，生根移栽較適宜的基質(zhì)為泥炭土和珍珠巖的混合基質(zhì)。

林伍德連翹； 組織培養(yǎng)； 無菌苗

林伍德連翹(ForsythiaintermediaLynwood Gold)為木犀科連翹屬落葉灌木，早春時(shí)節(jié)先開花后長葉，滿枝金黃，艷麗驕人，是早春優(yōu)良的觀花灌木，在中國園林博物館室外展區(qū)有栽種[1-2]。同時(shí)連翹果實(shí)為中藥中的連翹，具有清熱止吐、清肝利膽、除濕退黃、通調(diào)三焦、暢達(dá)血脈、保肝護(hù)心等作用[3-4]，也是一種較好的中藥材。苗木繁殖多為扦插繁殖，但扦插繁殖系數(shù)低，速度慢，且扦插成活當(dāng)年芽生長緩慢[5]。近年來，關(guān)于連翹組培快繁技術(shù)的研究有較多報(bào)道，蘇榮存[5]、武翼[6]、張進(jìn)獻(xiàn)[7]、王金玲[8]、吳瀟[9]等均通過不同的基本培養(yǎng)基、不同的激素組合進(jìn)行組織培養(yǎng)并取得了成功[10]。但WPM基本培養(yǎng)基、ZT細(xì)胞分裂素對連翹的組培影響尚無報(bào)道。因此，為加速林伍德連翹在園林綠化及中藥材中的應(yīng)用，筆者以WPM為基本培養(yǎng)基，試驗(yàn)不同的ZT濃度搭配NAA對增殖培養(yǎng)的影響、不同的IBA濃度搭配活性炭對生根培養(yǎng)的影響，以建立林伍德連翹快速繁殖的工藝流程，為大規(guī)模工廠化生產(chǎn)組培苗提供理論和實(shí)踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及處理

剪取林伍德連翹當(dāng)年生新枝作為外植體，留短葉柄去除葉片后將其剪成3～5 cm長的小莖段，放入大燒杯用洗衣粉水浸泡并用軟毛刷輕輕刷洗5～6 min，用自來水沖洗1.5～2 h；在超凈工作臺上用75%的酒精振蕩40～50 s，用無菌水沖洗1～2次，放入2%的次氯酸鈉中振蕩消毒20～25 min，用無菌水沖洗4～5次，用無菌濾紙吸干枝條上水分。切除莖段兩端壞死的部分后、按每芽一段切成0.5～1.0 cm的莖段，豎接至初培培養(yǎng)基(WPM+0.5 mg/L ZT+0.1 mg/L NAA+30 g/L糖+8 g/L瓊脂，pH 5.6)上，視叢生芽誘導(dǎo)情況，初培15～30 d后將叢生苗切成0.8～1.0 cm長的莖段后接種到繼代培養(yǎng)基(WPM+0.5 mg/L ZT+0.05 mg/L NAA+30 g/L糖+8 g/L瓊脂，pH 5.6)上，每20 d繼代1次，繼代培養(yǎng)2～3次后獲得的組培苗。

試驗(yàn)中所有的組織培養(yǎng)條件均為溫度(25±2)℃、相對濕度70%、光照度2 000 Lx，每天光照14 h。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 不同激素處理組合對增殖培養(yǎng)的影響 在帶芽莖段的培養(yǎng)中采用ZT 0.5 mg/L、1.0 mg/L、2.0 mg/L與NAA 0.01 mg/L、0.10 mg/L、0.20 mg/L不同組合作為生長調(diào)節(jié)劑誘導(dǎo)芽的形成與增殖，按完全實(shí)驗(yàn)法進(jìn)行試驗(yàn)處理，其中基本培養(yǎng)基為WPM，蔗糖30 g/L，瓊脂8 g/L，pH調(diào)節(jié)到5.6。每組試驗(yàn)均選取生長一致的叢生苗，在超凈工作臺上切約0.8～1.0 cm長的小莖段，每瓶接種3株，每處理重復(fù)6次。接種后置于培養(yǎng)室，分別培養(yǎng)20 d和40 d后記錄叢生芽數(shù)量和平均芽長。

1.2.2 不同處理組合對生根培養(yǎng)的影響 當(dāng)芽增殖到足夠數(shù)量時(shí)，進(jìn)行瓶內(nèi)生根誘導(dǎo)的培養(yǎng)試驗(yàn)，采用IBA 0.10 mg/L、0.25 mg/L、0.50 mg/L分別與AC0 mg/L、1 mg/L不同組合誘導(dǎo)瓶內(nèi)生根，按完全實(shí)驗(yàn)法進(jìn)行試驗(yàn)處理，其中基本培養(yǎng)基為1/2WPM，蔗糖20 g/L，瓊脂8 g/L，pH調(diào)節(jié)到5.6。每組試驗(yàn)均選取生長一致的叢生苗，在超凈工作臺上切成2.0～2.5 cm長的小莖段，每瓶接種3株，各重復(fù)6次，接種后置于培養(yǎng)室，30 d后記錄生根株數(shù)、每株生根條數(shù)和平均根長。

1.2.3 栽培基質(zhì)對移栽的影響 選擇瓶內(nèi)生根較一致的組培苗，分別栽種到由泥炭土和珍珠巖按不同比例混合而成的基質(zhì)中，其中泥炭土∶珍珠巖分別為1∶9，3∶7，5∶5，7∶3，9∶1，以試驗(yàn)栽培基質(zhì)對移栽生根苗的影響。栽培容器為40孔/盤的穴盤，每處理4株，各10個(gè)重復(fù)。栽種完成后置于溫室，控制溫度(25±5)℃，透光率70%，通過栽培容器上搭小棚，控制棚內(nèi)空氣溫度80%～95%。栽種60 d后記錄移栽成活株數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2003和SAS 9.2軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理及分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素處理組合的增殖培養(yǎng)

由圖示、表1可知，當(dāng)ZT濃度不變時(shí)，隨著NAA濃度的升高，增殖芽數(shù)逐漸降低而平均芽長逐漸增高；當(dāng)NAA濃度不變時(shí)，隨著ZT濃度的升高，增殖芽數(shù)也逐漸降低而平均芽長逐漸增高。在增殖培養(yǎng)20 d，當(dāng)ZT濃度為0.5 mg/L，NAA濃度為0.01 mg/L時(shí)，增殖芽數(shù)為2.06，平均芽長為1.75 cm，且二者與其他處理間均無顯著性差異。隨著時(shí)間的增長，在培養(yǎng)40 d后，各處理間的增殖芽數(shù)和平均芽長均增加，當(dāng)ZT濃度為0.5 mg/L，NAA濃度為0.01 mg/L時(shí)，增殖芽數(shù)增加幅度最大，達(dá)2.61，與處理2和處理4的差異不顯著，但與其他處理存在顯著性差異。綜合考慮增殖芽數(shù)和芽長，低濃度的ZT和低濃度的NAA有利于增殖培養(yǎng)，可確定ZT 0.5 mg/L+NAA0.01 mg/L為林伍德連翹增殖培養(yǎng)中較好的激素組合。

2.2 不同處理組合的生根培養(yǎng)

由圖示、表2可知，當(dāng)活性炭濃度一定，隨著IBA濃度的增加，生根率逐漸增加，平均生根條數(shù)也增多，而平均根長逐漸降低。當(dāng)IBA濃度為0.50 mg/L，不添加活性炭時(shí)，生根率可達(dá)100%，與其他各處理的差異不顯著；平均生根條數(shù)最多，達(dá)5.39，與其他各處理的差異極顯著；而平均根長最低，為2.89，與其他各處理也存在極顯著差異。平均根長最長的處理為4號處理，但其生根率和平均生根條數(shù)均最低。綜合考慮三方面因素，可以確定IBA 0.50 mg/L為林伍德連翹生根培養(yǎng)較好的激素處理。

圖示 林伍德連翹植株生長狀況

Fig. Growth status ofF.intermediaLynwood Gold

表1 不同激素組合處理林伍德連翹的增殖培養(yǎng)

Table 1 Proliferation culture ofForsythiaintermediaLynwood Gold shoots cultured on media with different hormone combination

處理編號Serialnumber激素組合Hormonecombination芽數(shù)Numberofshoots20d40d平均芽長/cmAveragelengthofshoots20d40d1ZT0．5+NAA0．012．06±0．22a2．61±0．19a1．75±0．09b2．02±0．15d2ZT0．5+NAA0．101．72±0．26abc2．28±0．06ab1．80±0．17b2．08±0．13cd3ZT0．5+NAA0．201．44±0．16bc1．83±0．13bc1．84±0．14b2．12±0．21cd4ZT1．0+NAA0．011．94±0．20ab2．22±0．21ab1．66±0．17b2．34±0．20bcd5ZT1．0+NAA0．101．61±0．25abc1．94±0．16bc1．83±0．10b2．52±0．03abcd6ZT1．0+NAA0．201．39±0．23bc1．61±0．19c1．92±0．13ab2．81±0．21ab7ZT2．0+NAA0．011．67±0．15abc1．83±0．21bc1．92±0．09ab2．62±0．24abc8ZT2．0+NAA0．101．39±0．16bc1．72±0．19bc2．01±0．24ab2．96±0．17a9ZT2．0+NAA0．201．22±0．19c1．44±0．19c2．31±0．19a3．04±0．30a

注：同列中不同小寫字母表示差異水平達(dá)0.05(下同)。

Note：Different lowercase letters in the same column indicate significance of difference atP<0.05. The same below.

表2 不同處理組合對瓶內(nèi)林伍德連翹的生根培養(yǎng)

Table 2 Rooting culture ofF.intermediaLynwood Gold plantlets cultured on media with different hormone combination

處理編號Serialnumber處理組合(IBA+AC)/(g/L)Hormonecombination生根率/%Rootingrate平均生根條數(shù)/根Averagerootnumber平均根長/cmAveragerootlength10．10+083．33±7．45ab2．44±0．27cd3．46±0．28bc20．25+088．89±7．03ab3．17±0．11bc3．16±0．18bc30．50+0100．00±0．00a5．39±0．34a2．89±0．27c40．10+177．78±7．03b2．06±0．29d4．76±0．14a50．25+183．33±7．45ab2．50±0．28cd3．82±0．31b60．50+188．89±7．03ab3．28±0．22b3．61±0．24b

表3 不同栽培基質(zhì)移栽林伍德連翹的長勢

Table 3 Growth vigor ofF.intermediaLynwood Gold plantlets cultured on different transplanting media

基質(zhì)配比Mediumratio平均成活率/%Averagesurvivalrate長勢Growthvigor泥炭土：珍珠巖=1∶9Peatsoil∶perlite(1：9)97．5莖葉生長較差，葉片顏色淺綠，長勢一般泥炭土：珍珠巖=5∶5Peatsoil∶perlite(5：5)97．5莖葉生長較好，葉片顏色淺綠，長勢較好泥炭土：珍珠巖=7∶3Peatsoil∶perlite(7：3)100．0莖葉生長較好，葉片顏色濃綠，長勢較好泥炭土：珍珠巖=9∶1Peatsoil∶perlite(9：1)97．5莖葉生長較好，葉片顏色濃綠，長勢較好

2.3 不同栽培基質(zhì)下的移栽

由表3可知，將瓶內(nèi)生根苗移栽到不同比例的混合基質(zhì)上時(shí)，移栽成活率均達(dá)95%以上，且就移栽苗的生長狀況而言(圖示)，泥炭土占比越大，植株生長狀況越好。故林伍德連翹瓶內(nèi)生根苗的移栽易成活，但在林伍德連翹生根苗移栽的過程中，栽培基質(zhì)以泥炭土為主時(shí)移栽效果更好。

3 結(jié)論與討論

在本試驗(yàn)中，林伍德連翹增殖培養(yǎng)的較適宜培養(yǎng)基為WPM+ZT 0.5 mg/L+NAA 0.01 mg/L；生根培養(yǎng)的較適宜培養(yǎng)基為1/2WPM+IBA 0.50 mg/L；生根移栽的較適宜基質(zhì)為泥炭土和珍珠巖的混合基質(zhì)，且以泥炭土為主時(shí)有利于成活植株的生長。

在林伍德連翹增殖培養(yǎng)中，本試驗(yàn)采用前人均未使用的ZT作為細(xì)胞分裂素，結(jié)果表明，低濃度ZT和低濃度NAA組合最有利于增殖培養(yǎng)，雖然此組合的平均芽長與其他組合的平均芽長有顯著區(qū)別，但40 d后芽長也達(dá)2.02 cm，足以滿足生產(chǎn)所需，所以確定ZT 0.5 mg/L+NAA 0.01 mg/L為林伍德連翹增殖培養(yǎng)中較好的激素組合。

在林伍德連翹生根培養(yǎng)中，添加活性炭時(shí)的生根率、平均生根條數(shù)均低于不添加活性炭的處理，而只有平均根長相反。由試驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，活性炭有利于林伍德連翹根長的生長，但不利于提高生根率和生根條數(shù)，綜合考慮多因素，確定不添加活性炭、IBA 0.50 mg/L為林伍德連翹生根培養(yǎng)較好的激素處理。

在連翹的組織培養(yǎng)中，蘇榮存[5]、張進(jìn)獻(xiàn)[7]、王金玲[8]等均以MS作為基本培養(yǎng)基，6-BA作為細(xì)胞分裂素，并取得了較好的效果。而本試驗(yàn)中，以WPM作為基本培養(yǎng)基，ZT作為細(xì)胞分裂素進(jìn)行增殖及生根培養(yǎng)，取得了較好的效果。在進(jìn)一步的研究中，可以對基本培養(yǎng)基、激素組合等進(jìn)行細(xì)化篩選，以期找出更好的組培快繁培養(yǎng)基，提高生產(chǎn)效率。

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(責(zé)任編輯： 劉忠麗)

Tissue Culture Technique ofForsythiaintermediaLynwood Gold

FAN Shufang1, JIAN Dawei2*, LUO Lanyan3, LUO Feng3, LI Wei2

(1.CollegeofBiologicalEngineering,JingchuUniversityofTechnology,Jingmen,Hubei448000; 2.JingmenForestryBureau,Jingmen,Hubei448000; 3.JingmenInstituteofForestryScience,Jingmen,Hubei448000,China)

The proliferation and rooting test of asepticF.intermediaLynwood Gold plantlets cultured from new shoots ofF.intermediaLynwood Gold was conducted to produceF.intermediaLynwood Gold seedlings on a large scale. Results: The optimum media for proliferation and rooting ofF.intermediaLynwood Gold plantlets are WPM + ZT 0.5 mg/L + NAA 0.01 mg/L and 1/2WPM + IBA 0.50 mg/L separately. The survival rate ofF.intermediaLynwoodGold plantlets transplanted on the mixed substrate of peat soil and perlite can reach above 95%.

ForsythiaintermediaLynwood Gold; tissue culture; aseptic plantlet

2015-08-15； 2016-02-28修回

范淑芳(1977-)，女，講師，碩士，從事植物種子資源開發(fā)與利用。E-mail:fsf03@163.com

*通訊作者：簡大為(1977-)，男，高級工程師(林業(yè))，碩士，從事植物新品種推廣應(yīng)用。E-mail:jdw0577@126.com

1001-3601(2016)03-0134-0145-03

S567.9

A