酸度及鹽濃度對β-胸苷與牛血清白蛋白結(jié)合作用的影響

金向程， 俞小清， 邵　爽

(浙江外國語學(xué)院科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 浙江 杭州 310012)

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酸度及鹽濃度對β-胸苷與牛血清白蛋白結(jié)合作用的影響

金向程， 俞小清， 邵爽

(浙江外國語學(xué)院科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 浙江 杭州 310012)

摘要：用熒光光譜法研究了Tris-HCl緩沖溶液(pH=7.1)中β-胸苷(THMD)與牛血清白蛋白(BSA)的結(jié)合作用.分別用Stern-Volmer 方程、位點(diǎn)結(jié)合模型探討了THMD與BSA 的作用機(jī)制，考察了pH和鹽濃度對上述結(jié)合作用的影響.結(jié)果表明：THMD導(dǎo)致BSA內(nèi)源熒光猝滅；隨著溫度的升高，THMD與BSA之間的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)減??；pH對上述作用有明顯影響，過強(qiáng)的酸性或堿性均會抑制THMD與BSA的結(jié)合；體系中鹽濃度增大會導(dǎo)致THMD與BSA的結(jié)合常數(shù)減小.

關(guān)鍵詞：β-胸苷；牛血清白蛋白；pH; 鹽濃度；熒光光譜；熒光猝滅

血清白蛋白是血漿中含量最豐富的蛋白質(zhì)，具有較強(qiáng)的結(jié)合作用，可以結(jié)合外源性化合物從而起到其在體內(nèi)的儲存和運(yùn)輸作用[1].藥物從給藥部位進(jìn)入血液后，正是通過與血清白蛋白結(jié)合，到達(dá)靶部位進(jìn)而發(fā)生藥理作用的.研究藥物與血清白蛋白的結(jié)合及各種外在因素對其的影響，有助于全面了解藥物在體內(nèi)的狀態(tài)和作用機(jī)制[2].

圖1　β-胸苷分子結(jié)構(gòu)Fig. 1　Molecular structure of β-thymidine

β-胸苷(β-thymidine,THMD,分子結(jié)構(gòu)見圖1)是合成抗艾滋病藥物如齊多夫定和司他夫定等的主要原料[3-4]，無天然產(chǎn)物存在.THMD的制備主要有化學(xué)合成法、DNA酶解法、發(fā)酵法等，生物方法生產(chǎn)條件要求高、成本昂貴，一般以化學(xué)合成法為主[5].

藥物小分子與生物大分子(如BSA)的結(jié)合作用是目前化學(xué)、藥學(xué)及生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，外界因素(如共存金屬離子、溶液pH、離子強(qiáng)度以及蛋白質(zhì)變性劑的存在等)對其結(jié)

合有著廣泛而復(fù)雜的影響.在前期研究[6-8]基礎(chǔ)上，本文著重考察pH和鹽濃度兩個因素對THMD與BSA 結(jié)合作用的影響，運(yùn)用熒光法實(shí)驗(yàn)，借助理論模型處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，得到猝滅常數(shù)、結(jié)合常數(shù)、平均結(jié)合位點(diǎn)數(shù)等重要作用參數(shù)，從而為闡明環(huán)境因素對藥物小分子與BSA的結(jié)合的影響提供有用信息和數(shù)據(jù).

1儀器和試劑

1.1　儀器

熒光分光光度計(FP-6200型，日本Jasco公司)；數(shù)控恒溫槽(THCY-10,寧波天恒儀器廠)；移液器(Finnpipett，5~50 μL,上海雷勃分析儀器有限公司)；電子分析天平(AB265-S，METTER TOLEDO, Switzerland)； pH計(FE20，梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；超純水器(UPWS-10T，杭州永潔達(dá)凈化科技有限公司).

1.2　試劑及配制

THMD(原料藥)由杭州科本藥業(yè)有限公司提供(質(zhì)量符合USP29標(biāo)準(zhǔn))；BSA購自上海伯奧生物科技有限公司；三羥基氨基甲烷(Tris)(純度≥99.9%)；濃鹽酸、氯化鈉(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.5%)、磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)、檸檬酸(C6H8O7·H2O)、硼砂(Na2B4O7·10H2O)、氫氧化鈉等試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為UPWS超純水器處理的二次超純水，檢測無熒光雜質(zhì).

用0.1 mol/L NaCl溶液分別配制pH=4.0的Na2HPO4-C6H8O7緩沖液、pH=7.1的Tris-HCl緩沖液、pH=10.0的Na2B4O7-NaOH緩沖液.分別用上述不同pH的緩沖液配制1.0×10-5mol·L-1BSA 溶液及1.0×10-3mol·L-1THMD溶液備用.

配制pH=7.1的Tris-HCl緩沖溶液(分別含0.1,0.2,0.3,0.5,0.7,0.9 mol·L-1的NaCl以改變鹽濃度).分別用上述不同鹽濃度的Tris-HCl緩沖溶液配制1.0×10-5mol·L-1BSA 溶液及1.0×10-3mol·L-1THMD溶液備用.

1.3　實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1THMD對BSA熒光猝滅光譜

BSA熒光激發(fā)和發(fā)射光譜測定：移取一定濃度BSA溶液于石英比色皿中，設(shè)置發(fā)射波長為280 nm,狹縫寬度為5 nm,在298 K下掃描250~350 nm的熒光激發(fā)光譜,測得其最大激發(fā)波長；并在最大激發(fā)波長處，同樣條件下掃描其290~410 nm的熒光發(fā)射光譜，得到最大發(fā)射波長.

移取BSA溶液與不同濃度的THMD溶液(pH均為7.1)于容量瓶中，混勻后恒至指定溫度，移取2.5 mL于石英比色皿中，設(shè)置熒光激發(fā)和發(fā)射最大狹縫寬度均為5 nm，最大激發(fā)波長為282 nm.測得一系列不同濃度的THMD對BSA的熒光猝滅光譜,并記錄最大熒光強(qiáng)度.

1.3.2不同pH值時THMD對BSA的熒光猝滅光譜

分別用pH=4.0,7.1和10.0的緩沖溶液配制的BSA溶液和不同濃度的THMD溶液，按照1.3.1的方法測得不同濃度的THMD對BSA的熒光猝滅光譜,記錄最大熒光強(qiáng)度.

1.3.3不同鹽濃度時THMD對BSA的熒光猝滅光譜

分別移取含不同NaCl濃度的BSA溶液與不同濃度的THMD溶液(pH均為7.1)于容量瓶中，混勻、恒溫至298 K，移取2.5 mL于石英比色皿中，按照1.3.1的方法測得不同濃度的THMD對BSA的熒光猝滅光譜,記錄最大熒光強(qiáng)度.

2結(jié)果與討論

2.1　THMD對BSA的熒光猝滅光譜

按上述實(shí)驗(yàn)方法，在最大激發(fā)波長(282 nm)下，固定BSA的濃度，逐漸增大THMD的濃度，在298 K分別測定不同體系的熒光光譜，結(jié)果示于圖2.

從圖2可以看出，固定BSA濃度，逐漸增大THMD濃度，BSA的熒光強(qiáng)度隨之下降，產(chǎn)生熒光猝滅.以上結(jié)果說明THMD和BSA之間發(fā)生了相互作用，產(chǎn)生了能量轉(zhuǎn)移.

2.2　THMD對BSA的猝滅機(jī)制

熒光猝滅作用通?？煞譃閯討B(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅兩種機(jī)制.動態(tài)猝滅過程遵循Stern-Volmer方程[9]：

F0/F=1+Kqτ0[D]=1+KSV[D].

(1)

T=298 K,pH=7.1, λex=282 nm, [NaCl]=0.1 mol·L-1,[BSA]=1.0×10-6mol·L-1，[THMD](mol·L-1),1→10:0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.2, 1.4, 1.6, 1.8.圖2　THMD對BSA熒光光譜的影響Fig. 2　Effect of THMD on fluorescence spectrum of BSA

式中F0為未加入猝滅劑時熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度,F為猝滅劑濃度等于[D]時熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度，Kq為雙分子猝滅速率常數(shù)，τ0為沒有猝滅劑存在下熒光分子的平均壽命(取10-8s)，KSV稱為Stern-Volmer 猝滅常數(shù).

以最大發(fā)射波長345 nm處BSA熒光強(qiáng)度按式(1)將F0/F對[THMD]進(jìn)行線性回歸，結(jié)果列于表1.該結(jié)果表明此猝滅過程與Stern-Volmer方程較相符，隨溫度的升高，KSV減小.在不同溫度下，THMD對BSA的Kq在1012L·(mol·s)-1數(shù)量級，遠(yuǎn)大于各種猝滅劑對生物大分子的最大動態(tài)猝滅速率常數(shù)(通常Kq=2×1010L·(mol·s)-1[10])，可推斷THMD對BSA的猝滅主要是靜態(tài)猝滅，二者形成了具有一定穩(wěn)定性的復(fù)合物.

表1　THMD與BSA結(jié)合的KSV,Kq及相關(guān)系數(shù)R2

注：T=298 K,pH=7.1.

2.3　位點(diǎn)模型及處理

表2THMD與BSA結(jié)合的KA,n及相關(guān)系數(shù)R2

Tab. 2KA,nandR2between THMD and BSA

T/KKA/(104L·mol-1)nR22981.731.000.9983100.300.860.995

注：T=298 K,pH=7.1.

設(shè)THMD與BSA形成n個結(jié)合位點(diǎn)的復(fù)合物,且這種復(fù)合物無熒光,可得求算結(jié)合常數(shù)KA和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n的公式[11]:

lg[(F0-F)/F]=lgKA+nlg[D].

(2)

將實(shí)驗(yàn)結(jié)果(298和310K溫度下)按式(2)處理，即lg[(F0-F)/F]對lg[D]進(jìn)行線性回歸，結(jié)果列于表2.從表2可以看出溫度對THMD與BSA結(jié)合作用的影響,即溫度升高，THMD與BSA的KA, n 均減小.這是因?yàn)闇囟鹊纳呒觿×朔肿娱g的熱運(yùn)動，從而導(dǎo)致復(fù)合物穩(wěn)定性下降.此結(jié)果同時也進(jìn)一步為THMD對BSA的靜態(tài)猝滅提供了證據(jù).

2.4　pH對THMD-BSA結(jié)合作用的影響

按1.3.2方法測得不同pH下THMD-BSA的熒光猝滅光譜，按式(2)進(jìn)行線性擬合，結(jié)果示于表3.

結(jié)果表明：pH對結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n影響不大，但對結(jié)合常數(shù)KA影響較大，較強(qiáng)的酸性或堿性均導(dǎo)致KA顯著減小.這與文獻(xiàn)報道[12]一致，較強(qiáng)酸性會增強(qiáng)蛋白質(zhì)中Trp殘基微環(huán)境的疏水性, 從而降低其局部表面的疏水性；而較強(qiáng)的堿性會增強(qiáng)蛋白質(zhì)中Phe殘基微環(huán)境的極性.上述兩種情況均會促使蛋白質(zhì)分子充分伸展，導(dǎo)致能量傳遞的有效性差，抑制了蛋白質(zhì)與小分子的結(jié)合.

表3　不同pH下THMD與BSA結(jié)合的KA, n及相關(guān)系數(shù)R2

注：T=298 K, [NaCl]=0.1 mol·L-1.

2.5　鹽濃度對THMD-BSA結(jié)合作用的影響

T=298 K,pH=7.1,[BSA]=1.0×10-6mol·L-1,[THMD]=0.2×10-5mol·L-1, [NaCl]/(mol·L-1),1→6: 0.1,0.2,0.3,0.5,0.7,0.9.圖3　不同 [NaCl]時THMD-BSA的猝滅光譜Fig. 3　Quenching spectra of THMD-BSAat different [NaCl]

按1.3.3將不同鹽濃度下THMD與BSA的熒光猝滅光譜按式(2)進(jìn)行線性擬合，結(jié)果示于表4.將不同NaCl濃度時THMD與BSA的熒光猝滅譜線繪圖示于圖3.

結(jié)果表明：1)鹽濃度增大，導(dǎo)致THMD對BSA的熒光猝滅強(qiáng)度減小，但最大發(fā)射峰位置未發(fā)生明顯變化(圖3)，表明鹽濃度不改變THDM-BSA復(fù)合物的結(jié)構(gòu)；2)隨著鹽濃度的增加， THMD與BSA的結(jié)合作用(KA)減小，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)(n)變化不大(表4).上述規(guī)律與文獻(xiàn)報道一致，主要原因可歸結(jié)為以下兩個方面：鹽濃度的增加，離子強(qiáng)烈屏蔽蛋白質(zhì)分子與結(jié)合分子之間的靜電引力，從而減小了二者之間的結(jié)合作用[13]；同時NaCl的加入，造成較高的離子氛，降低了兩者的親和力[14].

表4　不同鹽濃度下THMD與BSA結(jié)合的KA,n及相關(guān)系數(shù)R2

注：T=298 K, pH=7.1.

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第15卷第1期2016年1月杭州師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)JournalofHangzhouNormalUniversity(NaturalScienceEdition)Vol.15No.1Jan.2016

第15卷第1期2016年1月杭州師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)JournalofHangzhouNormalUniversity(NaturalScienceEdition)Vol.15No.1Jan.2016

Effects of pH and Salt Concentration on the Interaction of

β-thymidine with Bovine Serum Albumins

JIN Xiangcheng, YU Xiaoqing, SHAO Shuang

(School of Science and Technology, Zhejiang International Studies University, Hangzhou 310012， China)

Abstract:The interaction betweenβ-hymidine(THMD) and bovine serum albumin (BSA) in Tris-HCl buffer solution is studied by fluorescence spectrum. The interaction mechanism between THMD and BSA is discussed using the Stern-Volmer equation and site binding model respectively. The effects of ionic strength and pH on the system are also investigated. The results show that the fluorescence intensity of BSA is quenched when THMD is added. The binding constant and the number of binding sites decrease, as the temperature grows. pH has obvious influence on the above, a strong acidic or alkaline all can inhibit the combination of THMD and BSA. With the increasing of salt concentration, the binding constant between THMD and BSA decreases.

Key words:β-thymidine(THMD)；bovine serum albumin(BSA)；pH；salt concentration； fluorescence spectrum；fluorescence quenching

文章編號:1674-232X(2016)01-0046-04

中圖分類號:O657; O647

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

doi:10.3969/j.issn.1674-232X.2016.01.009

通信作者：邵爽(1962—)，男，教授，博士，主要從事熱力學(xué)、化學(xué)生物學(xué)研究.E-mail:shuangshao701@163.com

收稿日期：2015-07-22