大麥抗紋枯病種質(zhì)資源的鑒定及遺傳分析

楚單單，崔　君，金　越，戴歡歡，李　菲，胡夢(mèng)娜，薛大偉，張曉勤

(杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310036)

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大麥抗紋枯病種質(zhì)資源的鑒定及遺傳分析

楚單單，崔君，金越，戴歡歡，李菲，胡夢(mèng)娜，薛大偉，張曉勤

(杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310036)

摘要：對(duì)31個(gè)來(lái)自不同地區(qū)的大麥品種進(jìn)行了紋枯病抗性鑒定，共篩選出9份對(duì)紋枯病抗性較強(qiáng)和4份對(duì)紋枯病幾乎無(wú)抗性的大麥.用21對(duì)SSR標(biāo)記對(duì)這31種大麥進(jìn)行遺傳多樣性分析，共擴(kuò)增81個(gè)等位變異，每個(gè)位點(diǎn)上有2~5個(gè)變異，平均每個(gè)位點(diǎn)上的變異為3.857 1；位點(diǎn)多態(tài)性信息量(PIC)變幅為0.170 5~0.686 1，平均0.473 9.聚類分析可將這些供試材料分成2個(gè)大類和5個(gè)亞類.研究結(jié)果表明，大麥種質(zhì)中抗紋枯病材料豐富且蘊(yùn)含了豐富的遺傳變異，可為大麥抗紋枯病的遺傳改良提供重要的基因資源.

關(guān)鍵詞：大麥；紋枯??；SSR；遺傳多樣性；聚類分析

大麥(HordeumvulgareL.)是禾本科作物，其種質(zhì)資源由于長(zhǎng)期的馴化栽培、自然進(jìn)化和遺傳定向改良，造成遺傳基礎(chǔ)比較單一.紋枯病是影響麥類作物產(chǎn)量的主要病害之一，能侵染27科以上的植物，包括許多重要的糧食作物如水稻、大麥、玉米等，因而被植物病理學(xué)家所廣泛關(guān)注.紋枯病作為大麥上比較嚴(yán)重的真菌病害，對(duì)其進(jìn)行研究有助于大麥的抗病性育種.大麥紋枯病一般從苗期至穗期均可發(fā)生，主要危害麥類的葉鞘，影響麥類作物的結(jié)實(shí)率和千粒重，嚴(yán)重時(shí)將會(huì)導(dǎo)致葉片早衰、植株倒伏造成大麥減產(chǎn)20%~30%[1-2].對(duì)大麥紋枯病的防治，主要采用栽培技術(shù)和藥劑防治相結(jié)合的措施[3]，但選育和推廣抗病種質(zhì)是防治大麥病害最安全、最行之有效的途徑[4].同時(shí)，大麥紋枯菌致病力及大麥抗病性的研究對(duì)其它禾本科植物的相關(guān)研究具有重要的借鑒意義，也可為尋找新的抗性相關(guān)基因提供有效途徑.遺傳多樣性研究是大麥抗病種質(zhì)資源發(fā)掘、保護(hù)和利用的重要環(huán)節(jié).SSR(simple sequence repeat)分子標(biāo)記由于具有操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好、染色體位置已知等優(yōu)點(diǎn)，在種質(zhì)和遺傳多樣性分析中廣泛運(yùn)用，已成為遺傳多樣性研究中最常用的一種方法.

本研究利用紋枯菌株對(duì)收集自不同地區(qū)的31份大麥種質(zhì)進(jìn)行接種，通過(guò)比較不同種質(zhì)間的病情指數(shù)，篩選具有一定抗性的大麥種質(zhì).同時(shí)，運(yùn)用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)不同抗性的大麥種質(zhì)進(jìn)行遺傳背景分析，明確不同抗性的大麥種質(zhì)的遺傳背景差異，為大麥紋枯病抗性育種提供理論參考.

1材料與方法

1.1　試驗(yàn)材料

供試的31份材料是來(lái)自不同地區(qū)的大麥種質(zhì)(表1)，引自浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院.鑒定所用的大麥紋枯病菌為立枯絲核菌，由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供.研究中采用PDA培養(yǎng)基對(duì)紋枯菌進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng).

表1　供試材料

1.2　抗性鑒定方法

將PDA培養(yǎng)基上的病原菌菌絲體連同培養(yǎng)基切成小塊一起置入元麥粒培養(yǎng)基中，相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)至菌絲長(zhǎng)滿元麥粒培養(yǎng)基，經(jīng)過(guò)9次擴(kuò)大培養(yǎng)獲得足夠的立枯絲核菌菌落.將待測(cè)材料播種于塑料育苗盤中，每種材料播種20粒，并設(shè)置3組重復(fù).待其生長(zhǎng)至四片真葉期，在大麥麥苗基部周圍擺入長(zhǎng)滿菌絲的元麥粒，每組6粒左右，接種后用滅菌土覆蓋，加水濕潤(rùn)后，放入人工智能培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，定期噴施營(yíng)養(yǎng)液.病菌在穿透寄主之前產(chǎn)生侵染墊、侵染圈以及單附著胞等侵染結(jié)構(gòu)菌絲，直接侵染寄主表皮后，快速在受侵細(xì)胞內(nèi)呈網(wǎng)狀擴(kuò)展，損害細(xì)胞壁，產(chǎn)生病斑[5].接種30 d后，大麥幼苗基部產(chǎn)生不同程度的侵染，統(tǒng)計(jì)病斑高度，進(jìn)行抗病性鑒定.

1.3　SSR分析方法

1.3.1DNA提取各大麥種質(zhì)幼苗葉片DNA提取參考Murray等[6]的方法.

1.3.2SSR引物的篩選從大麥的7條染色體中各選取5對(duì)相應(yīng)的引物進(jìn)行SSR分子標(biāo)記實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，每組染色體上有3對(duì)引物的標(biāo)記結(jié)果可以用于分析.因此，每種材料采用21對(duì)SSR標(biāo)記進(jìn)行擴(kuò)增.

1.3.3PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為10 μL，含2 μL引物，2 μL模板DNA和5 μL 2XMix、1 μL H2O.PCR的擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性35 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min.

1.3.4瓊脂糖凝膠電泳PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用3%的瓊脂糖凝膠電泳的方法進(jìn)行檢測(cè)，凝膠成像儀進(jìn)行拍照分析記錄.

1.3.5數(shù)據(jù)處理使用SPSS20和Excel統(tǒng)計(jì)31個(gè)大麥種質(zhì)的病斑高度數(shù)據(jù)，計(jì)算其平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差，并進(jìn)行感病程度分析.采用Anderson等[7]的方法計(jì)算等位位點(diǎn)的多態(tài)性信息量(PIC，ploymorphism information content)；采用Nei等[8]的方法計(jì)算相似系數(shù)(GS)：GS=2Nij/(Ni+Nj),其中Ni和Nj分別為i，j兩材料總基因數(shù)，Nij為i和j兩種材料同有的等位基因數(shù)，遺傳差異(GD)=1-GS.使用DPS5.02軟件計(jì)算歐氏距離，按照UPGMA(Unweighted Pair Group Method using arithmetic Averages)方法對(duì)31份供試材料進(jìn)行聚類分析.

2結(jié)果

2.1　大麥苗期紋枯病的抗性鑒定

SSR標(biāo)記技術(shù)是一種以特異引物PCR為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)，是由1～5個(gè)核苷酸為重復(fù)單位簇集而成的串聯(lián)重復(fù)序列，可分布在整個(gè)基因組的不同位置上，而且在基因組中的分布是隨機(jī)的[5].

M:Marker 1~31，表1中的31份材料.圖1　HVP93在供試材料的擴(kuò)增結(jié)果Fig. 1　The results of PCR amplification of HVP93 in test materials

本研究所選取的35對(duì)SSR標(biāo)記中，有21對(duì)在31個(gè)大麥品種中擴(kuò)增出重復(fù)性好、多態(tài)性高的條帶(圖1)，占總引物的60%，其他引物在供試大麥中無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物.利用這21對(duì)標(biāo)記，對(duì)31份大麥種質(zhì)進(jìn)行多態(tài)性研究，共檢測(cè)到81個(gè)等位變異，單個(gè)位點(diǎn)上有2～5個(gè)變異，平均每個(gè)位點(diǎn)上的變異為3.875 1.多態(tài)性最高的為HVP80、HVP172等5個(gè)標(biāo)記，有5個(gè)變異位點(diǎn)，HVP332、HVP3262標(biāo)記多態(tài)性最低，只有2個(gè)變異位點(diǎn).位點(diǎn)多態(tài)性信息量(PIC)變幅為0.170 5～0.686 1，平均為0.473 9(表2).

表2　SSR標(biāo)記名稱、所在染色體、檢測(cè)到的等位基因數(shù)目及多態(tài)信息量

植株發(fā)病后，根據(jù)病斑高度、發(fā)病部位、病斑大小以及是否侵入葉鞘和莖稈，對(duì)感病情況進(jìn)行分級(jí).目前國(guó)內(nèi)未有統(tǒng)一的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[9].本研究對(duì)31個(gè)大麥品種的幼苗進(jìn)行紋枯病抗性鑒定，并且在Ruhs的病情評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[10]基礎(chǔ)上，結(jié)合大麥紋枯病病情特征，對(duì)病情等級(jí)間的差異進(jìn)行劃分，提出了一種改進(jìn)的大麥苗期病情劃分標(biāo)準(zhǔn)(表3).結(jié)果表明不同大麥種質(zhì)對(duì)紋枯病的抗性存在顯著差異，其中有9個(gè)品種具有較高抗性，占供試材料的29%；有4個(gè)品種無(wú)抗性，占供試材料的13%，其余18個(gè)大麥品種(58%)表現(xiàn)出不同程度的抗性(表4).

表3　改進(jìn)的大麥苗期紋枯病病情調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)

表4　31份材料的病情等級(jí)

2.2　聚類分析及遺傳距離分析

圖2　31種大麥材料UPGMA聚類圖Fig. 2　UPGMA dendrogram of 31 barley varieties

為分析31份大麥材料間的遺傳背景，利用21對(duì)SSR標(biāo)記等位變異計(jì)算不同材料間的遺傳距離.31份大麥材料的平均遺傳距離為0.810 9.利用SSR遺傳距離矩陣按照UPGMA進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建各個(gè)供試材料的親緣關(guān)系圖，結(jié)果表明，在遺傳圖距為0.348的水平上31份材料被聚分為2大類、5個(gè)亞類群.如圖2所示，13、18號(hào)到4號(hào)21種大麥為第一大類群，余下10種大麥為第二大類群，其中第一大類群被聚分為3個(gè)亞類，第二大類群被聚分為2個(gè)亞類.

3討論

近年來(lái)，關(guān)于紋枯病抗性遺傳分析的研究逐漸增多，并鑒定出一些紋枯病抗性材料[11].不同種質(zhì)對(duì)紋枯病的感病程度存在明顯差異，在鑒定中也發(fā)現(xiàn)許多感病較輕材料.但是在中國(guó)各麥區(qū)生產(chǎn)上大力推廣的品種、高代新品系等種質(zhì)對(duì)紋枯病的抗性普遍較差，這也正是近年來(lái)麥類作物紋枯病大面積發(fā)生的原因[9].前人的研究表明，大麥有多種感染紋枯病的途徑，通過(guò)合理的種植和管理，也能降低大麥紋枯病的發(fā)生頻率.如，前茬為水稻的大麥田，紋枯病病株率約為43.1%，而前茬為棉花的大麥田，病株率約為18.4%.另外，早播與氮肥過(guò)量也將增加大麥紋枯病的發(fā)病率[12].而對(duì)大麥紋枯病的防治，目前主要采用栽培技術(shù)和藥劑防治相結(jié)合的綜合防治方法[3]，常見(jiàn)的防治方法還有推廣抗病種質(zhì)、農(nóng)業(yè)防治及化學(xué)防治等[13].本研究對(duì)31份大麥材料進(jìn)行了SSR分子標(biāo)記分析，在選取定位在大麥7條染色體的標(biāo)記中得到21個(gè)重復(fù)性較好、多態(tài)性較高的標(biāo)記.其中，HVP93等存在重復(fù)性較好的擴(kuò)增結(jié)果，并且存在多態(tài)性.聚類分析表明31份材料可以被聚分為2大類，5小類.13、18、4號(hào)等21種大麥為第一大類群，余下10種大麥為第二大類群，其中第一大類群被聚分為3個(gè)亞類，第二大類群被聚分為2個(gè)亞類.通過(guò)對(duì)31份大麥材料的研究，發(fā)現(xiàn)與其他種質(zhì)相比，h5、h22、h32等9個(gè)品種對(duì)紋枯病的抗性較好，占供試材料的29%，有4個(gè)品種無(wú)抗紋枯病性，占供試材料的13%.當(dāng)前中國(guó)大麥品種抗紋枯病的抗原單一、抗病性差，本研究鑒定出的大麥紋枯病抗性品種可作為紋枯病抗性基因研究的遺傳材料.

現(xiàn)代育種模式導(dǎo)致作物種質(zhì)間遺傳多樣性降低、相似系數(shù)增大，因此豐富作物育種材料是當(dāng)前農(nóng)作物育種的主要任務(wù)之一.本研究的遺傳多樣性分析和紋枯病性的鑒定進(jìn)一步證明了h5等大麥種質(zhì)攜帶豐富抗性基因，未來(lái)這些篩選出的大麥種質(zhì)資源將在大麥抗紋枯病育種中發(fā)揮重要作用.

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第15卷第1期2016年1月杭州師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)JournalofHangzhouNormalUniversity(NaturalScienceEdition)Vol.15No.1Jan.2016

Identification and Genetic Analysis of Barley Germplasm against Sheath Blight

CHU Dandan, CUI Jun, JIN Yue, DAI Huanhuan, LI Fei, HU Mengna, XUE Dawei, ZHANG Xiaoqin

(College of Life and Environmental Sciences, Hangzhou Normal University, Hangzhou 310036, China)

Abstract:In order to identify sheath blight resistance of barley germplasm, 31 barley varieties from different areas were used in this study, and 9 varieties with strong sheath blight resistance and 4 varieties with no sheath blight resistance were chosen. 21 pairs of SSR (single sequence repeat) markers were used to characterize the genetic diversity of 31 varieties, and 81 alleles were amplified, with a range of 2~5 alleles per locus, and there was an average of 3.857 4 alleles per locus. Loci polymorphism information content (PIC) ranged from 0.170 5 to 0.686 1 with an average of 0.473 9. By using cluster analysis method, the 31 barley accessions could be classified into 2 groups and 5 sub-groups. The research showed that the materials in barley germplasm against sheath blight were rich, and had abundant genetic diversity, which could provide important gene resource for the genetic improvement of sheath blight resistance of barley germplasm.

Key words:barley; sheath blight; SSR; genetic diversity; cluster analysis

文章編號(hào):1674-232X(2016)01-0025-05

中圖分類號(hào):S5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

doi:10.3969/j.issn.1674-232X.2016.01.005

通信作者：張曉勤(1976—)，女，副教授，博士，主要從事作物學(xué)研究.E-mail：xiaoqinzhang@163.com

基金項(xiàng)目：浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(LY14C130007)；杭州市科委基金項(xiàng)目(20140432B03)；浙江省大學(xué)生科技創(chuàng)新活動(dòng)暨新苗人才計(jì)劃(2014R421029)；杭州師范大學(xué)教改項(xiàng)目.

收稿日期：2015-06-03