Eaf2基因敲除對(duì)紫外線誘導(dǎo)的鼠白內(nèi)障形成的影響

姜艷華，張勁松

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Eaf2基因敲除對(duì)紫外線誘導(dǎo)的鼠白內(nèi)障形成的影響

姜艷華，張勁松

Effects of Eaf2 gene knockout on cataract induced by ultraviolet irradiation in mice

Yan-Hua Jiang，Jin-Song Zhang

Citation:Jiang YH, Zhang JS.Effects of Eaf2 gene knockout on cataract induced by ultraviolet irradiation in mice.GuojiYankeZazhi(IntEyeSci) 2016;16(2):228-230

摘要

目的：分析Eaf2基因敲除對(duì)紫外線誘導(dǎo)的小鼠白內(nèi)障形成的影響。

方法：將15只野生型(WT)小鼠作為對(duì)照組，10只Eaf2基因敲除(Eaf2 KO)小鼠作為實(shí)驗(yàn)組。兩組均取14周齡左右的小鼠作為研究對(duì)象。進(jìn)一步分組為：WT-nonUV、WT-UV、Eaf2 KO-nonUV、Eaf2 KO-UV，共4組。使用裂隙燈顯微鏡觀察小鼠白內(nèi)障程度，利用晶狀體混濁分類系統(tǒng)Ⅱ(LOCSⅡ)對(duì)小鼠白內(nèi)障進(jìn)行分級(jí)。然后斷頸處死小鼠，摘取晶狀體進(jìn)行暗視野顯微鏡照相，利用Image J軟件對(duì)晶狀體混濁程度進(jìn)行分析，并將各測量結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

結(jié)果：裂隙燈顯微鏡和暗視野顯微鏡的結(jié)果一致：WT-UV組及Eaf2 KO-UV組晶狀體混濁程度明顯高于WT-nonUV組及Eaf2 KO-nonUV組，其中WT-UV組明顯高于Eaf2 KO-UV組，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

結(jié)論：紫外線輻射能夠?qū)е滦∈蟀變?nèi)障的形成，Eaf2蛋白質(zhì)具有促進(jìn)紫外線所致的小鼠白內(nèi)障形成的作用。

關(guān)鍵詞：Eaf2；基因敲除；白內(nèi)障；晶狀體上皮細(xì)胞；紫外線

引用：姜艷華，張勁松.Eaf2基因敲除對(duì)紫外線誘導(dǎo)的鼠白內(nèi)障形成的影響.國際眼科雜志2016;16(2):228-230

0 引言

白內(nèi)障是晶狀體透明度降低或者顏色改變所導(dǎo)致的視覺障礙[1]，目前已成為世界范圍內(nèi)主要的致盲眼病[2-3]。波長為290~320nm的中波紫外線可以穿過角膜、房水被晶狀體吸收，這促進(jìn)了年齡相關(guān)性白內(nèi)障的形成[4-5]。晶狀體上皮細(xì)胞主要位于晶狀體前囊下，在保護(hù)整個(gè)晶狀體的透明度和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定上起著不可或缺的重要作用[3]。對(duì)晶狀體上皮細(xì)胞的非程序DNA合成進(jìn)行測定，結(jié)果提示白內(nèi)障是繼發(fā)于晶狀體上皮細(xì)胞DNA損傷后未修復(fù)或錯(cuò)誤修復(fù)的結(jié)果[6]。Eaf2為一個(gè)潛在的腫瘤抑制因子，能夠與ELL(Elevennineteen Lysine-rich Leukemia)相互作用增強(qiáng)RNA聚合酶Ⅱ的活性而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的作用[7-8]。已有研究表明，Eaf2能夠參與眼睛的發(fā)育，并提示Eaf2在調(diào)控晶狀體發(fā)育和成熟中發(fā)揮重要功能[9]。有研究證實(shí)，Eaf2蛋白質(zhì)對(duì)紫外線誘導(dǎo)的晶狀體上皮細(xì)胞凋亡具有促進(jìn)作用[10]，我們提出疑問：Eaf2基因敲除對(duì)紫外線誘導(dǎo)的小鼠白內(nèi)障的形成是否存在影響呢？

表1　各組小鼠晶狀體混濁程度分級(jí)情況眼

圖1裂隙燈顯微鏡照相結(jié)果A：WT-UV組；B：Eaf2 KO-UV組；C：WT-nonUV組；D：Eaf2 KO-nonUV組。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1藥品復(fù)方托吡卡胺滴眼液(日本參天制藥株式會(huì)社)。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)用Eaf2基因敲除小鼠和對(duì)照小鼠由中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院眼科晶狀體實(shí)驗(yàn)室提供，基因敲除鼠和對(duì)照鼠均由Bm12小鼠構(gòu)建，按照ARVO聲明飼養(yǎng)。

1.1.3主要儀器紫外線燈(Spectroline XX-15N/F，Spectronice Corporation)；紫外線能量測試儀(UVX Radiometer，UVP)；裂隙燈顯微鏡(Topcon，日本)；暗視野顯微鏡(Olympus BX40，日本)。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及飼養(yǎng)將15只野生型(WT)小鼠作為對(duì)照組，10只Eaf2基因敲除(Eaf2 K.O.)小鼠作為實(shí)驗(yàn)組。兩組均取14周齡左右的小鼠作為研究對(duì)象。按照ARVO聲明飼養(yǎng)小鼠，定時(shí)觀察小鼠精神、飲食和排便等情況。紫外線照射第3wk，WT-UV組有一只小鼠角膜混濁，無法觀察晶狀體混濁情況，剔除實(shí)驗(yàn)。因此進(jìn)一步分組為：WT-UV(14眼)為A組，Eaf2 KO-UV(10眼)為B組，WT-nonUV(15眼)為C組，Eaf2 KO-nonUV(10眼)為D組，共4組。

1.2.2紫外線輻射晶狀體紫外線照射前，裂隙燈檢查所有小鼠，剔除已經(jīng)患有白內(nèi)障的小鼠。實(shí)驗(yàn)所用紫外線波長為302nm，強(qiáng)度為200W/cm2，將紫外透射光源用錫箔紙覆蓋，只留有一個(gè)直徑5mm的小孔。紫外線照射時(shí)，不對(duì)小鼠進(jìn)行麻醉，直接照射。只對(duì)每只小鼠的右眼進(jìn)行照射，左眼作為對(duì)照，不進(jìn)行紫外線的照射。于紫外線照射前5min，對(duì)每只小鼠的右眼進(jìn)行復(fù)方托吡卡胺散瞳。紫外線照射每周進(jìn)行兩次，每次持續(xù)100s，共照射3wk(總共1200mJ/cm2)，最后一次照射48h后，裂隙燈檢查小鼠晶狀體混濁程度。利用晶狀體混濁分類系統(tǒng)Ⅱ(lens opacities classification system Ⅱ，LOCS Ⅱ)對(duì)晶狀體混濁程度進(jìn)行分級(jí)：晶狀體皮質(zhì)完全透明為0級(jí)；少量點(diǎn)狀混濁為1級(jí)；點(diǎn)狀混濁擴(kuò)大，瞳孔區(qū)出現(xiàn)少量點(diǎn)狀混濁為2級(jí)；車輪狀混濁，超過兩個(gè)象限為3級(jí)；車輪狀混濁擴(kuò)大，瞳孔區(qū)約50%的混濁為4級(jí)；瞳孔區(qū)90%的混濁為5級(jí)。然后斷頸處死小鼠摘取晶狀體以進(jìn)行暗視野顯微鏡照相，根據(jù)所拍攝的圖像，利用Image J軟件對(duì)白內(nèi)障區(qū)域比例進(jìn)行分析，白內(nèi)障區(qū)域比例(cataract area ratio)=白內(nèi)障區(qū)域面積/前囊膜(anterior capsules)區(qū)域面積。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：應(yīng)用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)對(duì)不同組別的裂隙燈檢查小鼠晶狀體混濁程度分級(jí)和暗視野顯微鏡拍照的白內(nèi)障面積比例進(jìn)行分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1裂隙燈顯微鏡觀察小鼠白內(nèi)障的形成裂隙燈顯微鏡觀察晶狀體混濁程度的小鼠眼球前節(jié)照相：A組和B組晶狀體均可見明顯晶狀體皮質(zhì)混濁，C組和D組可見少量點(diǎn)狀晶狀體皮質(zhì)混濁。根據(jù)LOCS Ⅱ?qū)铙w混濁程度進(jìn)行分級(jí)，A圖為4級(jí)，B圖為3級(jí)，C圖及D圖為1級(jí)(圖1)。所有樣本進(jìn)行秩和檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果為：WT-UV組及Eaf2 KO-UV組晶狀體混濁程度明顯高于WT-nonUV組及Eaf2 KO-nonUV組，其中WT-UV組明顯高于Eaf2 KO-UV組，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=11.31，P<0.05，表1)。

2.2暗視野顯微鏡觀察小鼠白內(nèi)障的形成暗室野顯微鏡觀察晶狀體混濁面積：圖中可見A組和B組晶狀體可見明顯晶狀體皮質(zhì)混濁，C組和D組未見明顯晶狀體皮質(zhì)混濁(圖2)，其中圖A中白內(nèi)障的面積占整個(gè)前囊膜面積比例的59.2%，B圖為25.4%，C圖為0%，D圖為0%。WT-UV組及Eaf2 KO-UV組晶狀體混濁面積明顯高于WT-nonUV組及Eaf2 KO-nonUV組，其中WT-UV組明顯高于Eaf2 KO-UV組，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=12.84，P<0.05)。

3 討論

胚鼠和成熟鼠體內(nèi)均可發(fā)現(xiàn)Eaf2的表達(dá)[11-12]，利用基因重組和雜交技術(shù)人們構(gòu)建了Eaf2基因敲除小鼠[12]，以便于進(jìn)行Eaf2基因調(diào)控和蛋白質(zhì)功能的研究。雖然Eaf2被認(rèn)為是一種重要的腫瘤抑制物，但研究顯示在生后4mo內(nèi)，該基因敲除小鼠和其野生型之間的生存率是沒有差異的，而且直到24mo基因敲除鼠組內(nèi)未見明顯的機(jī)體異常表現(xiàn)。國內(nèi)目前尚未有對(duì)小鼠Eaf2基因的研究，國外的研究主要集中在腫瘤組織的分子生物學(xué)方面的研究。雖然基因敲除小鼠在6~12mo沒有觀察到腫瘤的發(fā)生，但卻出現(xiàn)了心肌細(xì)胞和前列腺上皮細(xì)胞的肥大和增生，這表明作為腫瘤抑制劑的Eaf2有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和形態(tài)的功能；同時(shí)在18~24mo的Eaf2純合子和雜合子個(gè)體出現(xiàn)了自然發(fā)生的腫瘤，這包括：肺腺癌、B細(xì)胞淋巴瘤、肝癌和前列腺上皮內(nèi)瘤樣增生。在該模型中Eaf2敲除的致癌作用是緩慢的，肉眼可見的腫瘤多發(fā)生在較年長的動(dòng)物個(gè)體內(nèi)。因此Eaf2基因敲除小鼠的腫瘤發(fā)生近似于大多數(shù)人類腫瘤的形成，為這些類型腫瘤的治療方法研究提供了動(dòng)物模型基礎(chǔ)[12]。

圖2暗視野顯微鏡照相結(jié)果A：WT-UV組；B：Eaf2 KO-UV組；C：WT-nonUV組；D：Eaf2 KO-nonUV組。

自然界中的紫外線可分為波長為200~280nm的短波紫外線、280~320nm的中波紫外線和320~400nm的長波紫外線，本實(shí)驗(yàn)使用波長為302nm的中波紫外線成功建立了紫外線誘導(dǎo)的小鼠白內(nèi)障模型。紫外線導(dǎo)致晶狀體上皮細(xì)胞損傷，并誘發(fā)細(xì)胞凋亡，細(xì)胞脫落、移行，使細(xì)胞密度降低，影響晶狀體纖維的生長和生長質(zhì)量，并導(dǎo)致晶狀體纖維滲透壓失衡，其完整性和透明性受損[13]。白內(nèi)障是各種原因造成晶狀體蛋白變性致使晶狀體混濁，與晶狀體上皮細(xì)胞生理機(jī)能和病理改變有密切關(guān)系，目前認(rèn)為晶狀體上皮細(xì)胞凋亡是各種非先天性白內(nèi)障形成的共同細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。我們的實(shí)驗(yàn)中，Eaf2基因敲除的小鼠白內(nèi)障的嚴(yán)重程度明顯較野生組減低，其可能的作用機(jī)制是Eaf2蛋白對(duì)紫外線誘導(dǎo)的晶狀體上皮細(xì)胞的凋亡具有促進(jìn)作用，也有研究顯示，Eaf2很可能在某種條件下與p53存在相互作用，并影響p53的轉(zhuǎn)錄活性[14]。Eaf2蛋白也許可以提高晶狀體上皮細(xì)胞對(duì)于紫外線輻射損傷的敏感度，使異常的細(xì)胞及早被發(fā)現(xiàn)，并通過凋亡機(jī)制將其清除，以保證晶狀體的功能不被這些異常細(xì)胞所干擾。從這一角度來說，Eaf2蛋白在維持晶狀體上皮細(xì)胞“新陳代謝”方面具有積極的意義。但是過度紫外線輻射可能會(huì)導(dǎo)致廣泛的晶狀體上皮細(xì)胞凋亡進(jìn)而誘發(fā)白內(nèi)障的發(fā)生。紫外線誘導(dǎo)晶狀體上皮細(xì)胞凋亡在白內(nèi)障的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。目前白內(nèi)障的主要治療手段仍是手術(shù)摘除+人工晶狀體植入，缺乏有效的藥物治療方法。由白內(nèi)障導(dǎo)致的視力障礙以及手術(shù)治療所需的高額費(fèi)用，給患者、家庭以及社會(huì)都帶來了巨大的壓力和負(fù)擔(dān)。盡管前人已對(duì)白內(nèi)障進(jìn)行了大量的研究，但人們對(duì)白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)制仍未達(dá)成完全共識(shí)，目前晶狀體上皮細(xì)胞的凋亡及DNA損傷修復(fù)成為了白內(nèi)障的研究熱點(diǎn)，因此阻斷晶狀體上皮細(xì)胞的凋亡途徑，提高晶狀體上皮細(xì)胞DNA損傷后的修復(fù)能力，將給白內(nèi)障的預(yù)防及治療帶來新的希望。從細(xì)胞凋亡角度出發(fā)，通過Eaf2基因敲除小鼠模型對(duì)白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)制進(jìn)一步深入研究，并據(jù)此開發(fā)新的、經(jīng)濟(jì)有效的藥物治療方法，通過藥物抑制晶狀體上皮細(xì)胞凋亡而達(dá)到預(yù)防白內(nèi)障的目的，將對(duì)提高患者生活質(zhì)量，減輕患者精神和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，促進(jìn)社會(huì)醫(yī)療資源的優(yōu)化和合理配置起到巨大作用。

參考文獻(xiàn)

1 Wormstone IM, Collison DJ, Hansom SP,etal. A focus on the human lensinvitro.EnvironToxicolPharmacol2006;21(2):215-218

2 Moghaddam MS, Kumar PA, Reddy GB,etal. Effect of Diabecon on sugar-induced lens opacity inorgan culture: mechanism of action.JEthnopharmacol2005;97(2):397-403

3 張婧，陳垠衫，王思玲.白內(nèi)障動(dòng)物模型的建立及評(píng)價(jià)參數(shù)的研究進(jìn)展.沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào) 2008；25(8):674-678

4 Hayashi LC, Hayashi S, Yamaoka K,etal. Ultraviolet exposure and type of lens opacity in ophthalmic patients in Japan.SciTotalEnviron2003；302(123):53-62

5 Dong X, Lofgren S, Ayala M,etal.Maximum tolerable dose for avoidance of cataract induced by ultraviolet radiation-B for 18 to 60 week old rats.ExpEyeRes2005；80(4):561-566

6 Li WC, Kuazak JR, Dunn K,etal. Lens epithelial cell apoptosis appears to be a common cellular basis for non-congenital cataract development in humans and animals.JCellBiol1995；130(1):169-181

7 Simone F, Luo RT, Polak PE,etal. ELL-associated factor 2 (EAF2), a functional homolog of EAF1 with alternative ELL binding properties.Blood2003；101(6):2355-2362

8 Kong SE, Banks CA, Shilatifard A,etal. ELL-associated factors 1 and 2 are positive regulators of RNA polymerase II elongation factor ELL.ProcNatlAcadSciUSA2005;102(29):10094-10098

9 Maurus D, Heligon C, Burger-Schwarzler A,etal. Noncanonical Wnt-4 signaling and EAF2 are required for eye development in Xenopus laevis.EMBOJ2005;24(6):1181-1191

10 Li M, Wu X, Zhuang F,etal. Expression of murine ELL-associated factor 2 (Eaf2) is developmentally regulated.DevDyn2003;228(2): 273-280

11 Xiao F, Zhang JS, Zhao JY,etal. Regulation of Eaf2 in mouse lens cells apoptosis induced by ultraviolent radiation.IntJOphtalmol2012；5(5):571-575

12 Xiao W, Zhang Q, Habermacher G,etal. U19/Eaf2 knockout causes lung adenocarcinoma, B-cell lymphoma, hepatocellular carcinoma and prostatic intraepithelial neoplasia.Oncogene2008;27(11):1536-1544

13 Berthoud VM, Beyer EC. Oxidative stress, lens gap junctions, and cataracts.AntioxidRedoxSignal2009;11(2):339-353

14 Su F, Pascal LE, Xiao W,etal. Tumor suppressor U19/EAF2 regulates thrombospondin-1 expression via p53.Oncogene2010;29(3):421-431

·實(shí)驗(yàn)研究·

Foundation item:the National Natural Science Foundation of China(No.81270988)

Department of Ophthalmology, the Fourth Affiliated Hospital of China Medical University, the Eye Hospital of China Medical University, the Key Laboratory of Lens Research of Liaoning Province, Shenyang 110005, Liaoning Province, China

Correspondence to:Jin-Song Zhang. Department of Ophthalmology, the Fourth Affiliated Hospital of China Medical University, the Eye Hospital of China Medical University, the Key Laboratory of Lens Research of Liaoning Province, Shenyang 110005, Liaoning Province, China. cmu4h-zjs@126.com

Received：2015-07-09Accepted：2016-01-18

Abstract

?AIM:To evaluate the effects of Eaf2 gene knockout on cataract in mice induced by ultraviolet irradiation.

?METHODS:Fifteen wild type mice were used as the control group, and 10 Eaf2 KO mice were used as the experimental group. The 14-week mice were taken as the research objects in the two groups. So the subgroups were: WT -nonUV, WT -UV, Eaf2 KO-nonUV and Eaf2 KO-UV, a total of 4 groups. Observe the lens of miceinvivowith slit lamp microscope, grade the lens opacity with Lens Opacities Classification System II (LOCSII). Then the mice were sacrificed by breaking the neck, the lens were removed and were observed by dark field microscopy. According to the captured images, the proportion of cataract region was analyzed using Image J software. The data of the two groups were statistically analyzed.

?RESULTS: The results detected by the two methods were similar. In WT-UV group and Eaf2 KO-UV group, the degree of lens opacity was significantly higher than those of WT-nonUV group and Eaf2 KO-nonUV group. The lens opacity of WT-UV group was significantly higher than that in Eaf2 KO-UV group, and the difference was statistically significant (P<0.05).

?CONCLUSION: Ultraviolet radiation can lead to the formation of cataract in mice. Eaf2 protein can promote the formation of cataract in mice caused by ultraviolet.

KEYWORDS:?Eaf2; gene knockout; cataract; lens epithelial; ultraviolet

DOI:10.3980/j.issn.1672-5123.2016.2.07

收稿日期：2015-07-09 修回日期： 2016-01-18

通訊作者：張勁松，教授，博士研究生導(dǎo)師，遼寧省醫(yī)學(xué)會(huì)眼科分會(huì)主任委員，研究方向：白內(nèi)障的基礎(chǔ)與臨床.cmu4h-zjs@126.com

作者簡介：姜艷華，在讀博士研究生，主治醫(yī)師，研究方向：白內(nèi)障。

基金項(xiàng)目：作者單位：(110005)中國遼寧省沈陽市，中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院眼科 中國醫(yī)科大學(xué)眼科醫(yī)院 遼寧省晶狀體學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室