甲基睪酮免疫膠體金試紙條的研制及在水產品中的應用

夏武強，胡葉軍，孫　琛，張美珍，王偉萍，桑麗雅

(1.象山縣海洋與漁業(yè)質量技術檢測中心，浙江寧波　315700；

2.杭州南開日新生物技術有限公司，杭州　310051)

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甲基睪酮免疫膠體金試紙條的研制及在水產品中的應用

夏武強1，胡葉軍2，孫琛1，張美珍1，王偉萍2，桑麗雅2

(1.象山縣海洋與漁業(yè)質量技術檢測中心，浙江寧波315700；

2.杭州南開日新生物技術有限公司，杭州310051)

摘要：通過研究膠體金免疫層析技術，建立了一種快速檢測水產品中甲基睪酮含量的方法。將待測樣品中的甲基睪酮和試紙條檢測線上包被的人工抗原(MT-BSA)競爭性結合金標結合墊上包被的膠體金-甲基睪酮單抗聚合物，根據檢測線呈現的紅色線條深淺來判定樣品的陰陽性。結果顯示：試紙條上MT-BSA抗原工作濃度為1.0 mg/mL，羊抗鼠二抗工作濃度為1.5 mg/mL，試紙條的最低檢測限達到10 μg/kg，與甲基睪酮類似物的交叉反應率低；使用甲醇提取，4倍PBST稀釋，整個檢測所需時間僅10~15 min，適用于大規(guī)模樣品篩選。

關鍵詞：甲基睪酮；膠體金；水產品；快速檢測；試紙條

甲基睪酮(Mehthy1testosterone，MT)是一種人工合成的代謝類固醇，具有增強雄性體性和蛋白同化雙重作用[1]。MT不僅能夠促進生長，提高飼料轉化率，而且在育苗期間能夠促進某些魚類(如羅非魚、青鳉等)的性別轉變[2-3]，因此廣泛用于水產養(yǎng)殖[2-5]。但高劑量甲基睪酮的攝入可產生高血壓，男性前列腺肥大、脫發(fā)，女性多毛、聲音變粗、乳腺退化等男性化現象[6-7]。歐盟自1988年已禁止使用雄性激素獸藥[8]，美國也規(guī)定與其同類的丙酸睪酮在肌肉中的最高殘留限量(MRL)為0.64 μg/mL[9]。我國農業(yè)部2001年實施的行業(yè)標準《無公害食品水產品中漁藥殘留限量》(NY5070-2001)將甲基睪酮列為禁用藥物，2003年發(fā)布的第235號文件《動物性食品中獸藥最高殘留限量》中規(guī)定丙酸睪酮、苯丙酸諾龍、甲基睪酮、群勃龍等為禁止使用的獸藥，在所有食用動物的所有可食組織中不得檢出。目前檢測甲基睪酮的方法有高效液相色譜法(HPLC)[10-11]、氣相色譜-質譜法(GC-MS)[12]、液相色譜-質譜法(LC-MS)[13]及酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)[14]。但上述方法前處理復雜，均需要配備昂貴的儀器，對檢測人員的技術要求也較高，因此在基層大規(guī)模篩選工作中很難有應用價值。本實驗運用膠體金免疫層析檢測法(GICA)建立一種靈敏度高、操作簡單的甲基睪酮快速檢測試紙條。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1試劑

硝酸纖維素膜(NC膜)、玻璃纖維：Millipore公司；甲基睪酮標準品、睪酮標準品、丙酸睪酮標準品、19-去甲睪酮標準品、1-去氫睪酮標準品、氯金酸(HAuCl4·4H2O)、羊抗鼠IgG、牛血清白蛋白(BSA)、海藻糖、Tween-20：美國Sigma；聚乙二醇20 000、檸檬酸三鈉、甲醇、乙醇、乙腈、氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫鈉、磷酸二氫鉀、疊氮鈉均為分析純：華東醫(yī)藥有限公司；甲基睪酮ELISA試劑盒：美國Reagen。

1.1.2儀器

BioJet XYZ3000型點膜儀(美國BioDot)、UV-752紫外-可見光分光光度計(美國UNICO公司)、Avanti J-26XP高速冷凍離心機(美國Beckman公司)、恒溫鼓風干燥箱(上海精宏實業(yè)設備有限公司)、切割機(杭州市恒通設備有限公司)、膠體金讀數儀(杭州南開日新生物技術有限公司)、78HW-1恒溫磁力攪拌器(杭州儀表電機有限公司)。

1.1.3試劑配制

PBS溶液(即0.01 mol/L PBS)：取8 g NaCl、0.2 g KCl、1.14 g Na2HPO4和0.27 g KH2PO4溶于800 mL去離子水中。用4 mol/L HCl調節(jié)溶液的pH值至7.4，加去離子水定容至1 L，在高溫高壓下蒸氣滅菌后保存于室溫。PBST溶液：PBS溶液中加入0.05%Tween-20試劑。標準品：使用甲醇溶解甲基睪酮干粉，稀釋成濃度100 mg/L作為標準儲備液，使用ddH2O稀釋成實際所需濃度。

1.2方法

1.2.1甲基睪酮人工抗原制備

參照高軍等人[15]的方法制得包被抗原MT-BSA及免疫抗原MT-OVA。

1.2.2甲基睪酮單克隆抗體的制備

參照姜金慶等[16]的方法制得甲基睪酮單克隆抗體，腹水效價為1∶25 600，IC50為3.24 μg/L。

1.2.3膠體金溶液配制

取0.01%氯金酸水溶液100 mL加熱2 min至沸騰，邊攪拌邊加入1%檸檬酸三鈉水溶液 1 mL，繼續(xù)煮沸10 min至溶液呈酒紅色后冷卻，加蒸餾水恢復到原體積，4 ℃保存?zhèn)溆谩４朔椒ㄖ苽涞哪z體金顆粒直徑40 nm左右，可見光最高吸收峰為525 nm[17-18]。

1.2.4金標抗體配制

標記pH的確定：使用K2CO3及HCl調整膠體金溶液pH為3~11，分別取100 μL加入到酶標板微孔中，然后加入5 μg MT 單抗，室溫靜止10 min后加入20 μL 10%NaCl溶液后室溫反應10 min離心，取上清測定525 nm的OD值，選擇OD值最高的溶液pH為標記pH。

最佳標記濃度的確定：取酶標板8孔每孔加入100 μL膠體金溶液，分別加入0~50 μg MT 單抗，室溫靜止10 min后加入20 μL 10%NaCl溶液反應10 min。MT單抗過低會使膠體金聚沉，而導致顏色由紅變藍，當MT單抗達到所需量后溶液保持紅色不變，選擇最低的MT單抗量作為最佳標記濃度。

標記過程：取1 L膠體金溶液調整至最佳pH后加入最佳標記濃度單抗，過夜穩(wěn)定后加入5%BSA至BSA最終質量分數為1%，離心純化后沉淀用0.01 mol/L PB溶液(含1%BSA和0.05%NaN3)重懸，4℃保存?zhèn)溆肹19-20]。

1.2.5T線和C線包被濃度的調試

使用PBS溶液(含3%甲醇)稀釋MT-BSA至0.1、0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL，稀釋二抗(羊抗鼠IgG)至1.0、1.5、2.0 mg/mL，分別包被到NC膜上，與金標結合墊(噴量3.0 μL/cm)組裝成試紙條后，使用PBST溶液滴板后觀察顯色并使用膠體金讀數儀讀取T/C值。選擇T/C值為1~2且顯色適中時的濃度作為工作濃度。

1.2.6試紙條干燥時間的優(yōu)化

NC膜上MT-BSA及二抗包被完成后放入37 ℃烘箱干燥，每隔一段時間后取出，使用PBST溶液滴定，觀察并記錄結果。

1.2.7試紙條的組裝

取稀釋好后的MT-BSA和羊抗鼠IgG通過點膜儀噴于NC膜上，分別形成相距0.5 cm的檢測線(T線)和質控線(C線)，37 ℃烘箱干燥30 min；將金標抗體溶液按3 μL/cm噴至玻璃纖維上作為金標結合墊，置于37 ℃烘箱干燥45 min；分別將樣品墊、金標結合墊、NC膜、吸水墊黏于PVC板上，使用切割機切成3.84 mm寬度的試紙條，裝入塑料模板中壓成試劑板(結構圖如圖1所示)。

圖1　試紙條結構示意圖

1.2.8樣本處理方法優(yōu)化

樣本處理過程：取樣本組織均漿2 g于5 mL離心管中，加入2 mL提取劑后震蕩5 min，離心取上清200 μL，加入PBST溶液稀釋后取100 μL溶液檢測。

提取劑優(yōu)化：分別使用甲醇、乙醇、乙腈、酸化乙腈、石油醚作為提取劑提取陰性樣本及陽性添標樣本(10 μg/kg)，觀察顯色。

稀釋比例優(yōu)化：取樣本組織勻漿添標至最終質量分數分別為0、5、10、20 μg/kg，每個樣本提取后取上清分別使用PBST溶液1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6稀釋后檢測，觀察并讀取T/C值。

1.2.9試紙條操作方法及結果判定

操作方法：將已壓好的試劑板水平放置于觀察者正面；用滴管吸取待檢樣品溶液，垂直滴加3滴(約100 μL)于加樣孔中，加樣后開始計時；結果應在3～5 min讀取，其他時間判讀無效。

結果判定：本試紙條采用對比法判定，若檢測線(T線)顯色淺于控制線(C線)顯色，則判定為陽性；若檢測線(T線)顯色深于控制線(C線)顯色，或者顯色一樣深，則判定為陰性；若控制線(C線)沒有顯色，檢測線(T線)無論有無顯色，均判定為無效板。

1.2.10試紙條性能測定

1.2.10.1試紙條靈敏度及檢測限

取陰性樣本組織勻漿添標至MT最終質量分數分別為0、5、10、15、20、40 μg/kg，按照優(yōu)化后的處理方法進行樣本處理及檢測，每個濃度設6個重復，滴板檢測并記錄實驗結果；分別使用PBST溶液稀釋標準品溶液至0、0.5、1、2、5、10 μg/L，每個濃度設6個重復，滴板檢測并記錄實驗結果。

1.2.10.2試紙條特異性

取MT、睪酮、丙酸睪酮、19-去甲睪酮及1-去氫睪酮標準品制成系列濃度的標準品溶液，用甲基睪酮試紙條進行檢測，計算交叉反應率。

1.2.10.3試紙條精密度

隨機抽取3個不同批次的試紙條各30條，使用PBST溶液滴板讀數并計算變異系數。

1.2.10.4試紙條檢測與ELISA的符合率

取不同來源的魚樣、蝦樣各10份，分別使用ELISA試劑盒及本試紙條檢測MT含量比較兩者的符合率。

1.2.10.5穩(wěn)定性實驗

取3個不同批次的試紙條在20~25 ℃條件下連續(xù)放置12個月，期間，于生產當天、1、2、3、6、9、12個月分別從3個批次產品中抽取檢測卡，測定檢測限、假陽性率和假陰性率。

2結果與分析

2.1人工抗原紫外特征

在200～350 nm紫外光區(qū)分別對MT、BSA和MT-BSA進行紫外掃描，結果如圖2所示。MT的最大吸收峰在249 nm，BSA的最大吸收峰在271 nm， 而MT-BSA人工抗原的特征吸收峰發(fā)生了明顯的偏移，證明偶聯(lián)成功。

圖2　BSA、MT、MT-BSA的紫外掃描圖譜

2.2抗原和二抗工作濃度

本試紙條選用對比法進行結果判定，根據經驗，當陰性溶液滴定時T/C值在1.5左右，且線條顯色適中，線條粗細0.8 mm左右，此時不僅肉眼觀察明顯可減少誤判，并且能夠減少不同樣本本底值差異造成的假陽性和假陰性率。

本試紙條T、C線上包被的MT-BSA抗原和羊抗鼠二抗?jié)舛日{試結果見表1。根據結果可知，當MT-BSA抗原濃度為1.0 mg/mL，羊抗鼠二抗?jié)舛葹?.5 mg/mL時，顯色效果最佳。

表1　抗原與二抗?jié)舛葘︼@色的影響(n=6)

2.3試紙條干燥時間的優(yōu)化結果

由圖3表明，試紙條顯色在干燥0~8 h內變化較為劇烈，而后T線顯色趨于平穩(wěn)，C線顯色緩慢上升，導致T/C值下降，24 h后趨于平穩(wěn)。結果表明MT-BSA在干燥8 h后趨于穩(wěn)定，而羊抗鼠IgG則在24 h后趨于穩(wěn)定。故大卡干燥時間定為24 h。

圖3　干燥時間對試紙條的影響

2.4樣本提取優(yōu)化

提取劑優(yōu)化：乙醇的提取效率略差于其他提取劑；甲醇、乙腈、酸化乙腈及石油醚的提取效率較高，且石油醚、甲醇的顯色效果略好于其他兩種；石油醚的毒性較其他試劑大，故最終選擇甲醇作為提取劑。

稀釋比例優(yōu)化：由圖2表明，當稀釋倍數在4時陰陽性樣本的檢測結果梯度最大。當稀釋倍數較小時，提取液及樣本雜質的含量較高，導致出現檢測液跑板緩慢、T線顯色較細的異常情況，從而影響到T/C值及梯度大小。當稀釋倍數為4倍以上時，顯色和跑板才趨于正常。但隨著抗原被稀釋的越多，必然會導致檢測靈敏度減小。故選擇稀釋倍數為4時最佳。

圖4　提取液稀釋倍數對T/C值的影響

2.5試紙條靈敏度及檢測限

根據表2和表3可知，本試紙條靈敏度為MT標準品液2 μg/L，檢測限為水產樣品中MT含量10 μg/kg。

表2　樣品檢測限實驗(n=6)

注：+表示陽性，-表示陰性，下同。

表3　試紙條靈敏度實驗(n=6)

2.6特異性試驗

本試紙條對甲基睪酮類似物睪酮、丙酸睪酮、19-去甲睪酮及1-去氫睪酮的交叉反應率見表4。

表4　試紙條特異性實驗

2.7精密度

根據3批次試紙條實驗結果(表5)，試紙條每批次變異系數分別為6%，4.1%，1.9%，試紙條批次間變異系數為5.5%?？傋儺愊禂禐?2.6%，總標準偏差為0.2，對檢測結果影響較小。

表5　試紙條精密度實驗(n=10)

2.8與ELISA法的檢測符合率

實驗結果表明，試紙條法與ELISA法的檢測符合率在90%以上(表6)。

表6　試紙條與ELISA檢測結果的符合情況

2.9穩(wěn)定性實驗

實驗結果(表7)表明，在常溫條件下(20~25 ℃)，1年內試紙條的檢測限不變，假陽性率和假陰性率均小于5%，可見試紙條保質期可達1年。

3討論

3.1提取方式

相對于色譜法，膠體金免疫層析檢測法對于提取的要求較低，所需的步驟也較為簡單。提取方法一般可分為濃縮法、稀釋法以及兩者混合使用法。濃縮法一般步驟包括提取、吹干、復溶、滴板，通過吹干復溶提高了甲基睪酮的濃度，從而提高了檢測限；稀釋法一般步驟包括提取、稀釋、滴板，方法簡單快捷。

甲基睪酮易溶于乙醇、丙酮及三氯甲烷，略溶于乙醚，微溶于植物油，不溶于水中[21]。試驗過程中，通過對濃縮法和稀釋法的比較，發(fā)現濃縮法的顯色較淺，且陰陽性梯度和稀釋法相差不大。故選擇稀釋法，并使用一些常規(guī)的水溶性提取劑進行樣本提取優(yōu)化。

3.2T、C線稀釋液及NC膜選擇

影響蛋白質結合到NC膜上的因素主要有溶解捕獲蛋白的稀釋液、NC膜、捕獲蛋白本身性質、點樣系統(tǒng)及點樣環(huán)境濕度。本研究主要涉及的可調節(jié)因素是稀釋液及NC膜。本試紙條采用常規(guī)的PBS溶液(含3%甲醇)，PBS溶液主要作用是溶解捕獲蛋白及緩沖捕獲蛋白的pH，3%甲醇作為共沉淀劑提高蛋白質的疏水性而提高與NC膜的結合能力[22]。

膠體金免疫層析法所使用的NC膜的孔徑一般在5~12 μm，NC膜孔徑越小，有效表面積越大，反應時間越長，有利于蛋白質的結合及靈敏度的提高[23]。實際情況下NC膜孔徑過小會影響跑板速度，甚至出現跑不完的現象。本試紙條選用8 μm的NC膜，跑板時間在1 min左右，靈敏度滿足檢測要求。

本研究產品甲基睪酮膠體金試紙條運用目前發(fā)展迅速的膠體金免疫層析方法，其檢測限達到10 μg/kg，和行業(yè)標準相當，符合現階段檢測靈敏度的要求；前處理簡單，對實驗操作人員的要求較低；檢測成本較低，所用試劑對人體基本無害，比較符合現階段我國水產品質量監(jiān)控要求，具有推廣價值。

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(責任編輯：鄧薇)

Development of a coloidal gold immunochromatographic strip for

methyltestosterone residue in aquatic products

XIA Wu-qiang1,HU Ye-jun2,SUN Chen1,ZHANG Mei-zhen1,WANG Wei-ping2,SANG Li-ya2

(1.XiangshanOceanandFisheryQualityandTechnicalTestingCenter,Ningbo315700,Zhejiang,China;

2.HangzhouNankaiBiotechCo.,Ltd.,Hangzhou310051,China)

Abstract：A rapid coloidal gold immunochromatographic assay for methyltestosterone (MT) residue in aquatic products was developed.The coloidal gold -MT-McAb conjugate coated on the colloidal gold conjugate pad would combine with the MT in the samples and the MT-BSA on the detective line competitively,thus indicated the result of test.The results of this article showed that working concentration of MT-BSA was 1.0 mg/mL and goat anti-mouse IgG was 1.5 mg/mL,the detection limit of the strip could be 10 μg/kg,and the cross-reactivity was low,MT was extracted by methanol,and then the extract was diluted by 4 times PBST solution,the result could be obtained in 10~15 min.Therefore the strip was suitable for the sample screening and qualitative determination.

Key words：methyltestosterone;coloidal gold;aquatic products;rapid test;strip

中圖分類號：TS207.7

文獻標識碼：A

文章編號：1000-6907-(2016)01-0093-06

作者簡介：第一夏武強(1981-)，男，工程師，碩士，研究方向為水產品檢測。 E-mail:xiawuqiang@live.cn通訊作者：胡葉軍。E-mail:hyj664@163.com

收稿日期：2014-08-02；

修訂日期：2015-07-21

資助項目：寧波市水產病害防控與安全科技創(chuàng)新團隊(2013B82012)