魚類環(huán)境DNA研究中通用引物的篩選驗(yàn)證

劉　軍，趙良杰，凡迎春，張新磊，劉其根

(上海海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上?！?01306)

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魚類環(huán)境DNA研究中通用引物的篩選驗(yàn)證

劉軍，趙良杰，凡迎春，張新磊，劉其根

(上海海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海201306)

摘要：為了篩選一個(gè)通用性和適用性良好的能夠運(yùn)用于環(huán)境DNA(eDNA)研究的魚類引物，從相關(guān)文獻(xiàn)中選取了魚類線粒體基因組部分片段的5對(duì)引物，分別對(duì)線粒體D-loop區(qū)、16S rRNA基因、COI基因以及Cytb基因部分片段進(jìn)行擴(kuò)增。對(duì)千島湖48種魚類基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增后比較發(fā)現(xiàn)，引物16s和COI均可以取得良好的擴(kuò)增效果，通用性優(yōu)于其他幾對(duì)引物。引物16s的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)均出現(xiàn)明亮的目的條帶，引物COI則有3種魚的條帶經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)亮度較暗。利用上述引物對(duì)環(huán)境樣品eDNA擴(kuò)增時(shí)發(fā)現(xiàn)，只有16s和COI的引物具有良好的擴(kuò)增效果，能夠得到明顯單一的亮帶。對(duì)該兩種引物的PCR產(chǎn)物克隆后測(cè)序比對(duì)發(fā)現(xiàn)，16s的PCR產(chǎn)物均為千島湖常見魚類物種的基因片段，COI的PCR產(chǎn)物則為細(xì)菌COI基因的部分片段。綜上，我們認(rèn)為引物16s在通用性和適用性上都更為適合作為魚類群落結(jié)構(gòu)eDNA研究的通用引物。

關(guān)鍵詞：引物篩選；線粒體標(biāo)記；環(huán)境DNA；千島湖

環(huán)境DNA(eDNA)是指從有機(jī)體脫落釋放進(jìn)入到自然環(huán)境中(如空氣、水、土壤等)的DNA，包括細(xì)胞中的DNA和細(xì)胞破碎后游離出細(xì)胞外的DNA分子。eDNA技術(shù)就是直接從水、土壤、沉積物等環(huán)境樣本中提取DNA片段后通過DNA測(cè)序和qPCR等分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)來定性或定量目標(biāo)生物，從而確定目標(biāo)生物在該環(huán)境中的分布及功能特征的研究方法[1-2]。目前eDNA在生態(tài)學(xué)方面的應(yīng)用主要包括對(duì)物種多樣性的研究[3]、動(dòng)物食性分析[4]、入侵及稀有物種調(diào)查以及生物量和分布的估測(cè)[5-7]。eDNA在水生動(dòng)物方面的應(yīng)用在國(guó)外已見一些文獻(xiàn)報(bào)道[8-9]，特別是在魚類稀有種和入侵種的監(jiān)測(cè)以及生物量估測(cè)方面eDNA技術(shù)顯示出了較傳統(tǒng)方法更簡(jiǎn)單、快捷、靈敏和低成本的諸多優(yōu)點(diǎn)。

但是，對(duì)于魚類群落結(jié)構(gòu)的eDNA研究還需要尋求到一個(gè)通用性和適用性都比較理想的通用引物。通過通用引物對(duì)于環(huán)境樣品的有效擴(kuò)增，利用克隆測(cè)序、二代測(cè)序以及凝膠電泳等方案，分析魚類群落多樣性的分子生物學(xué)信息。在以往關(guān)于魚類通用引物的研究中，研究者往往只是考慮提供擴(kuò)增單一魚類DNA模板的通用性引物，因?yàn)槟０錎NA中沒有其他生物來源的DNA組分，因此只需要考慮引物的通用性[10-11]；而環(huán)境樣品的組分是復(fù)雜的，這就要求引物的通用性是適中的：即需要對(duì)于不同的魚類物種具有通用性，又需要對(duì)于魚類物種的擴(kuò)增具有一定的特異性，不能擴(kuò)增或者過多的擴(kuò)增出其他物種的目的條帶。另外運(yùn)用eDNA對(duì)魚類進(jìn)行研究，幾乎都是在歐美或者日本開展的[6,8,12]，由于魚類區(qū)系的差異，我國(guó)是一個(gè)以鯉科為主要類群的國(guó)家[13]，水域生態(tài)系統(tǒng)中主要魚類組成為鯉科魚類，因此國(guó)外研究中提供的魚類通用引物的通用性和適用性也有待論證。

1材料與方法

1.1樣品采集和DNA提取

2014年7月在千島湖通過刺網(wǎng)捕撈、向漁民收購(gòu)，收集魚類48種(見附錄)，保存在無水乙醇中，使用改進(jìn)的酚氯仿法[15]從魚類肌肉組織中提取基因組DNA。同時(shí)在千島湖上游庫(kù)區(qū)隨機(jī)選取10個(gè)點(diǎn)采集水樣，每份樣品1 L，放入帶冰的保溫箱中帶回千島湖發(fā)展有限公司水科所實(shí)驗(yàn)室，24 h內(nèi)對(duì)水樣進(jìn)行抽濾處理，使用濾膜孔徑為1.2 μm，使用QIAGEN公司生產(chǎn)的試劑盒QIAamp DNA Micro Kit提取濾膜中的環(huán)境DNA。提取好的DNA溶于TE緩沖液中，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2實(shí)驗(yàn)引物的選擇

魚類線粒體DNA與核DNA相比具有分子小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、易于提取且是母系遺傳的特點(diǎn)，因此選擇線粒體DNA片段作為分析魚類種群結(jié)構(gòu)、物種分類鑒定的分子標(biāo)記[16]。參照文獻(xiàn)[17-21]找到5對(duì)線粒體序列的魚類通用引物，由上海生工生物工程有限公司合成，見表1。

表1　PCR所用的5對(duì)通用引物

1.3PCR擴(kuò)增及電泳

使用選取的5對(duì)通用引物分別對(duì)魚類DNA和環(huán)境DNA進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件和體系見表2。 擴(kuò)增后對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)，各取5 μL的PCR產(chǎn)物于1%的瓊脂糖凝膠中，電壓100 V，電泳60 min，用溴化乙錠染色8 min，最后在凝膠成像系統(tǒng)上拍照，并統(tǒng)計(jì)每對(duì)引物的擴(kuò)增效果。

表2　5對(duì)通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系和條件

1.4克隆測(cè)序

挑選出對(duì)魚類樣品和環(huán)境樣品都能夠良好擴(kuò)增的引物，再隨機(jī)挑選環(huán)境樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行切膠克隆測(cè)序，然后通過GENBANK進(jìn)行Blast比對(duì)，以驗(yàn)證環(huán)境樣品中擴(kuò)增出來的產(chǎn)物是否為魚類序列。克隆方法參見《Molecular Cloning:A Laboratory Manual-IV》[22]。

2結(jié)果

2.1魚類樣品的擴(kuò)增結(jié)果

按照1.3中的反應(yīng)體系和條件分別用5對(duì)引物對(duì)提取的48種魚類DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳圖像如圖1-圖5。

圖1　使用16s擴(kuò)增魚類樣品的結(jié)果

圖2　使用COI擴(kuò)增魚類樣品的結(jié)果

圖3　使用Cytb1擴(kuò)增魚類樣品的結(jié)果

圖4　使用Cytb4擴(kuò)增魚類樣品的結(jié)果

圖5　使用D-loop擴(kuò)增魚類樣品的結(jié)果

2.2環(huán)境樣品的擴(kuò)增結(jié)果

參照魚類樣品擴(kuò)增的體系和條件，用該5對(duì)引物分別對(duì)10個(gè)環(huán)境樣品進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果如圖6。

圖6　使用5對(duì)引物(16s、COI、Cytb1、Cytb4、D-loop)

由圖6可知，引物16s擴(kuò)增出了所有環(huán)境樣品中的16S rRNA基因片段，且目的條帶明亮清晰，但是在Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ泳道上相同的位置出現(xiàn)了一條暗淡的非特異性條帶。引物COI的擴(kuò)增條帶干凈清晰，無非特異性條帶，無拖帶現(xiàn)象，但是對(duì)I號(hào)環(huán)境樣品沒有擴(kuò)增。而對(duì)魚類樣品有較好擴(kuò)增效果的引物Cytb1，無法擴(kuò)增出10個(gè)環(huán)境樣品的中的目的基因。引物Cytb4的擴(kuò)增結(jié)果顯示部分泳道在1 500 ~2 000 bp間出現(xiàn)亮帶，而Cytb4的目的條帶為500 bp，說明該引物對(duì)目的基因片段沒有擴(kuò)增。至于引物D-loop的擴(kuò)增結(jié)果顯示只有4個(gè)環(huán)境樣品得到了明顯擴(kuò)增，而且雜帶較多，無法判斷目的條帶，對(duì)環(huán)境樣品的擴(kuò)增效果無法滿足后續(xù)的實(shí)驗(yàn)要求。

2.3克隆測(cè)序結(jié)果

結(jié)合魚類樣品和環(huán)境樣品的擴(kuò)增結(jié)果，可知通用引物16s和COI對(duì)魚類樣品和環(huán)境樣品都有較好的擴(kuò)增效果，目的片段清晰、明亮。為了進(jìn)一步了解它們擴(kuò)增的基因片段是否為魚類片段，將16s和COI的擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行克隆測(cè)序。測(cè)得序列在GENBANK中進(jìn)行Blast對(duì)比，對(duì)比結(jié)果顯示(見表3)引物16s的擴(kuò)增產(chǎn)物克隆測(cè)序得到15個(gè)陽(yáng)性序列，經(jīng)比對(duì)檢測(cè)出6條黃尾鲴(Xenocyprisdavidi)序列、5條藍(lán)鰓太陽(yáng)魚(Lepomismacrochirus)序列以及細(xì)鱗鲴(Plagiognathopsmicrolepis)、蒙古鲌(Chanodichthysmongolicus)、鰱(Hypophthalmichthysmolitrix)、鳙(Hypophthalmichthysnobilis)序列各1條，全部為千島湖常見魚類。而COI擴(kuò)增產(chǎn)物克隆測(cè)序得到的5條陽(yáng)性序列，經(jīng)對(duì)比發(fā)現(xiàn)均為細(xì)菌的細(xì)胞色素氧化酶第一亞基。

表3　使用引物16s和COI擴(kuò)增環(huán)境樣品產(chǎn)物的比對(duì)結(jié)果

3討論

環(huán)境DNA是直接從外界提取的總DNA，而從水樣中提取的環(huán)境DNA來源也很豐富，包括水中的微生物、水生動(dòng)物的糞便、尿液和粘液，水中動(dòng)植物死亡后的組織細(xì)胞，以及陸生動(dòng)植物遺留在水中和由于人類活動(dòng)進(jìn)入到水體中的DNA源[23]。因此本試驗(yàn)提取的環(huán)境DNA是一種成分多樣的混合DNA，同時(shí)由于承載DNA源介質(zhì)的特殊性也注定混合DNA里面存在的目的基因很微量。針對(duì)水樣中環(huán)境DNA“成分多”“濃度低”的特點(diǎn)，找到一對(duì)特異性好、適用性高的通用引物是關(guān)鍵。特異性好是指從環(huán)境DNA中只能夠擴(kuò)增出魚類的基因片段，而適用性高主要是針對(duì)魚類DNA在環(huán)境DNA中所占比例低的情況。

魚類mtDNA的D-loop區(qū)屬于遺傳高變區(qū)，進(jìn)化速度快，多態(tài)性豐富，很適合魚類種內(nèi)種群和個(gè)體間的遺傳分化研究。Jerde等[8]使用2對(duì)D-loop區(qū)特異性引物分別擴(kuò)增出了水樣DNA中鰱和鳙的基因片段，以此估測(cè)鰱和鳙在密西西比河中的入侵范圍。這與本初衷有一定的相似性，都是希望能夠擴(kuò)增出水環(huán)境DNA中的魚類基因片段用作進(jìn)一步分析，不同的是本研究是期望找到一對(duì)能夠擴(kuò)增水環(huán)境DNA中多數(shù)魚類基因的引物。本實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用的D-loop引物能夠擴(kuò)增絕大部分亞洲鯉科魚類[21]，同時(shí)從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也可以看到該引物對(duì)淡水魚類有較高的通用性，但是其對(duì)環(huán)境DNA的擴(kuò)增效率很低，且非特異性條帶出現(xiàn)較多，這可能是由于環(huán)境中其他物種來源的DNA被該引物非特異性擴(kuò)增的結(jié)果，因此不能滿足我們實(shí)驗(yàn)的擴(kuò)增要求。

另外，引物的特異性也反映出魚類間的進(jìn)化關(guān)系，一般的，在線粒體這樣的序列中，親緣關(guān)系越近的類群，由于DNA序列上面的差異小，其被同一對(duì)通用引物所擴(kuò)增出來越容易。而在我們研究中，胡瓜魚目中的銀魚，鯉形目中的鳡同時(shí)不能被Cytb1和D-loop這兩對(duì)引物擴(kuò)增出來，胡瓜魚目本就獨(dú)屬一目，所以擴(kuò)增情況可以反映出引物對(duì)于不同類群之間的通用性；而鳡作為東亞鯉科魚類的代表[13]，傳統(tǒng)的研究認(rèn)為：東亞鯉科魚類是一個(gè)單系群[26]，而這兩對(duì)引物的擴(kuò)增上面卻暗示該種在系統(tǒng)發(fā)生中存在著與鯉科其他類群的較大差異。鳡由于強(qiáng)烈的特化，已經(jīng)進(jìn)化成為兇猛的食肉性魚類，其形態(tài)與鯉科其他類群之間有著較大的差異，上述的結(jié)果，一方面提示我們鳡的進(jìn)化生物學(xué)研究是一個(gè)值得關(guān)注的領(lǐng)域，另一方面也提示我們，在進(jìn)行通用引物的篩選或設(shè)計(jì)時(shí)，要特別注意引物對(duì)于鳡的通用性。

引物COI對(duì)魚類DNA有很高的擴(kuò)增效率，Ivanova等[18]使用該引物擴(kuò)增了94種魚類DNA，有效擴(kuò)增達(dá)到了96.8%，同時(shí)對(duì)環(huán)境DNA也有較高的擴(kuò)增效率。但就本實(shí)驗(yàn)而言從克隆測(cè)序結(jié)果可知，COI從環(huán)境DNA 中擴(kuò)增出來的基因片段屬于細(xì)菌微生物細(xì)胞色素氧化酶第一亞基基因，沒有發(fā)現(xiàn)魚類基因。由此說明COI引物沒有足夠的“特異性”，在微生物基因組存在的情況下，不能用來擴(kuò)增環(huán)境DNA中的魚類片段。引物16s擴(kuò)增產(chǎn)物克隆測(cè)序結(jié)果顯示了不同種類的魚類基因，鑒定出來的物種均是千島湖的常見魚類，且結(jié)果中不僅有鯉科魚類，還存在近年來在調(diào)查中普遍較多存在的外來物種—藍(lán)鰓太陽(yáng)魚[14]，因此，該引物符合實(shí)驗(yàn)的要求。

本實(shí)驗(yàn)采用千島湖eDNA樣品的目的是為了驗(yàn)證各引物對(duì)環(huán)境樣品的擴(kuò)增效果，由于不是用于魚類群落組成的研究，因此并不需要考慮取樣點(diǎn)魚類群落的分布特點(diǎn)、種群密度、以及資源量的實(shí)際情況，但在使用所篩選的引物進(jìn)行后續(xù)的魚類群落研究時(shí)，我們還需要考慮上述問題對(duì)采樣點(diǎn)進(jìn)行設(shè)計(jì)。另外，由于各對(duì)引物對(duì)于魚類線粒體部分序列的通用性驗(yàn)證已經(jīng)通過48種魚類DNA的PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)得到檢驗(yàn)，為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述的引物對(duì)eDNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增的適用性，我們通過克隆測(cè)序?qū)DNA的PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析，目的是為了了解各組引物對(duì)于eDNA樣品中魚類DNA的擴(kuò)增效果(即確定不同引物是否在組分復(fù)雜的eDNA樣品中可以有效地?cái)U(kuò)增出魚類的線粒體基因片段，而不是為了獲取詳細(xì)的魚類群落組成信息)，因此并未大量進(jìn)行克隆測(cè)序，也使得獲得的測(cè)序結(jié)果只有48種千島湖的主要魚類物種。在后續(xù)的魚類群落研究時(shí)，我們可以采用測(cè)序深度更大的二代測(cè)序技術(shù)來替代克隆測(cè)序以此獲取更為豐富的物種組成信息。

引物16s既能擴(kuò)增全部實(shí)驗(yàn)魚類的DNA，也能在水樣DNA中擴(kuò)增出魚類基因，并且能夠通過從水樣中擴(kuò)增出來的魚類基因達(dá)到鑒別魚類種類的目的，可以滿足水樣中eDNA應(yīng)用研究的要求，這對(duì)探討水環(huán)境中魚類種類分布，種群結(jié)構(gòu)及生物多樣性具有一定現(xiàn)實(shí)意義。但是，目前水環(huán)境DNA的應(yīng)用仍處于初級(jí)階段，由于水環(huán)境DNA成分復(fù)雜、受影響因子多，因此各研究在提取時(shí)采取的方法也不盡相同[23]，不同方法對(duì)環(huán)境DNA提取造成的影響仍不清楚。另外，水環(huán)境DNA中目的基因濃度對(duì)擴(kuò)增效果的影響也制約了eDNA技術(shù)在水生動(dòng)物方面的應(yīng)用，因此引物對(duì)目的基因濃度的擴(kuò)增下限有待進(jìn)一步研究。

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(責(zé)任編輯：張瀟峮)

續(xù)附錄1

Universal primer screening and verification for

fish environment DNA research

LIU Jun,ZHAO Liang-jie,FAN Ying-chun,ZHANG Xin-lei,LIU Qi-gen

(KeyLaboratoryofFreshwaterFisheryGermplasmResources,MinistryofAgriculture,ShanghaiOceanUniversity,

Shanghai201306,China)

Abstract：In order to screen the primer of well universality and applicability for eDNA research,five pairs of universal primer of fish mitochondrial genome fragment were chosen from the previous references to amplify the partial sequences of D-loop region,16S rRNA gene,COI gene and Cytb gene.These primers were used to amplify genome of 48 species of fish in Qiandao Lake to test the universality,it was found that the 16s and COI were better than the other primers.Gel electrophoresis showed that all 16s DNA bands of the 48 species of fish was light,but 3 COI gene bands of the fish species was dark.The eDNA from Qiandao Lake were amplified by these five pairs of primer,and the electrophoretogram showed that the PCR product of 16s DNA and COI gene presented a clear bright band.According to the cloned sequencing and BLAST results,the PCR product of 16s DNA was coincident to the fragments of fishes from Qiandao Lake,but the PCR product of COI gene was in accord with the COI gene of bacteria.In summary,the primer of 16S rRNA was the most suitable universal primer to study on eDNA of fish community structure in the Qiandao Lake.

Key words：primer screening;mitochondrial marker;environment DNA;Qiandao Lake

中圖分類號(hào)：S917.4

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-6907-(2016)01-0009-09

作者簡(jiǎn)介：第一劉軍(1990-)，男，碩士研究生，專業(yè)方向?yàn)榉肿由鷳B(tài)學(xué)。E-mail:liujuncool2000@163.com通訊作者：劉其根。E-mail:qgliu@shou.edu.cn

收稿日期：2015-03-04；

修訂日期：2015-06-23

資助項(xiàng)目：公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))專項(xiàng)“湖泊水庫(kù)養(yǎng)殖容量及生態(tài)增養(yǎng)殖技術(shù)研究與示范”(201303056)；教育部博士點(diǎn)基金項(xiàng)目(20123104110002)；上海市高校知識(shí)服務(wù)平臺(tái)項(xiàng)目(ZF1206)