傳染性造血器官壞死病毒微型基因組表達干擾素對病毒的抑制效應(yīng)

王會英，蔣　燁，趙麗麗，唐麗杰，喬薪瑗，姜艷平，崔　文，李一經(jīng)，劉　敏

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院,哈爾濱　150030;

2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,哈爾濱　150030)

?

傳染性造血器官壞死病毒微型基因組表達干擾素對病毒的抑制效應(yīng)

王會英1，蔣燁2，趙麗麗1，唐麗杰1，喬薪瑗1，姜艷平1，崔文1，李一經(jīng)1，劉敏2

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院,哈爾濱150030;

2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,哈爾濱150030)

摘要：為構(gòu)建傳染性造血器官壞死病毒(IHNV HLJ-09)微型基因組并表達虹鱒IFN，采用RT-PCR擴增IHNV HLJ-09株的N、P、L、G和NV蛋白基因并亞克隆入真核表達載體pCI中，構(gòu)建輔助質(zhì)粒pCI-N、pCI-P、pCI-L、pCI-G和pCI-NV；將擴增獲得的IHNV基因組兩末端序列、增強型綠色熒光蛋白(EGFP)報告基因、虹鱒I型干擾素(IFN)基因克隆到真核表達載體pCI中構(gòu)建出表達EGFP的IHNV微型基因組pCI-LFGT和表達IFN的IHNV微型基因組pCI-LFIT；將pCI-LFIT質(zhì)粒轉(zhuǎn)染已接種IHNV HLJ-09毒株的EPC細胞，實時熒光定量PCR法測定細胞中IHNV G基因RNA。結(jié)果顯示：構(gòu)建的微型基因組不論與輔助病毒還是與5個輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，外源基因均能正確表達；pCI-LFIT質(zhì)粒轉(zhuǎn)染已接種病毒的EPC細胞組與對照組相比其中的病毒核酸顯著減少。

關(guān)鍵詞：傳染性造血器官壞死病毒；輔助質(zhì)粒；虹鱒I型干擾素；微型基因組

傳染性造血器官壞死病(Infectious Hematopoietic Necrosis,IHN)是由彈狀病毒科諾拉彈狀病毒屬的傳染性造血器官壞死病毒(Infectious Hematopoietic Necrosis Virus,IHNV)感染鮭科的魚類引起的一種急性病毒性高度傳染性疾病。IHNV是魚類彈狀病毒的典型代表，致死率高，危害魚種類范圍廣，能感染鮭魚科的所有品種。目前此病廣泛流行于北美、歐洲、亞洲的各國，給鮭鱒養(yǎng)殖業(yè)帶來重大經(jīng)濟損失。自20世紀80年代中期IHNV傳入我國，該病已在局部地區(qū)流行。目前，針對IHNV尚無有效的防治方法，需要我們進一步研究。

IHNV基因組為單股負鏈不分節(jié)段RNA，大小約為11 kb，基因組排列方式為3 Leader-N-P-M-G-NV-L-Trailers 5，分別編碼核衣殼蛋白(N)、磷酸化蛋白(P)、基質(zhì)蛋白(M)、表面糖蛋白(G)、非結(jié)構(gòu)蛋白(NV)和聚合酶蛋白(L)。病毒基因組RNA不穩(wěn)定和易降解，在對其體外操作及研究時比較困難。到上世紀的90年代初，出現(xiàn)了一種反向遺傳操作技術(shù)[1]，這一問題得到了較好的解決。利用該方法能夠為構(gòu)建RNA病毒的感染性分子克隆奠定基礎(chǔ)，更好地研究病毒的基因組及相關(guān)蛋白的功能，而且能夠表達外源蛋白，實現(xiàn)抗病毒。2000年，Biacchesi等[2]將表達T7聚合酶的牛痘病毒和表達CAT蛋白的IHNV微型基因組共轉(zhuǎn)染宿主細胞，并孵育IHNV病毒，在細胞中檢測到CAT蛋白的表達。此外，微型基因組一般都缺少自我復(fù)制所必需的蛋白，因此構(gòu)建IHNV反向遺傳體系需要將含有IHNV微基因組、N、P、L等的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染宿主細胞[3-5]。

本試驗通過構(gòu)建IHNV HLJ-09株反向遺傳系統(tǒng)所需的輔助質(zhì)粒pCI-N、pCI-P、pCI-L、pCI-G、pCI-NV以及表達EGFP的IHNV微型基因組pCI-LFGT和表達IFN的IHNV微型基因組pCI-LFIT，通過免疫熒光等方法驗證其功能，以期為IHNV HLJ-09株反向遺傳系統(tǒng)的構(gòu)建以及其基因組的研究奠定基礎(chǔ)，并且為抗IHNV感染研究提供新的方法和思路。

1材料與方法

1.1細胞、病毒、抗體

鯉魚上皮瘤細胞(EPC)由深圳出入境檢驗檢疫局劉葒惠贈；傳染性造血器官壞死病毒IHNV HLJ-09株由本試驗室從黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院渤海試驗站暴發(fā)急性疾病的死亡虹鱒組織分離并保存；抗IHNV N蛋白兔血清、抗IHNV dG蛋白兔血清、抗虹鱒IFN蛋白鼠血清均由本試驗室制備；FITC標記的山羊抗兔IgG購自Sigma公司。

1.2質(zhì)粒與菌株

真核轉(zhuǎn)錄載體pCI由中國農(nóng)科院哈爾濱獸醫(yī)研究所田志軍研究員贈與；感受態(tài)細胞TG1和pMD18-Tsimple、pGEM-T載體購自大連Takara公司；感受態(tài)細胞DH5α由本試驗室保存。

1.3IHNV HLJ-09株輔助質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)IHNV HLJ-09株的全基因組序列，用primer5.0設(shè)計針對N、G、P、NV、L蛋白的特異性引物(表1)；編碼L蛋白的核酸片段較長，所以選擇L基因內(nèi)的單一酶切位點Hind III將其分2段進行擴增。結(jié)合真核表達載體pCI的特點，在引物的5′末端添加了限制性酶切位點。

表1　擴增反向遺傳系統(tǒng)中輔助質(zhì)粒序列的引物

注：斜體加粗為酶切位點，下劃線部分為Kozak序列。

RT-PCR擴增IHNV HLJ-09病毒株各片段cDNA序列。擴增條件：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性40 s，退火，延伸，20個循環(huán)(退火及延伸參數(shù)見表2)，72 ℃終延伸10 min。4 ℃終止反應(yīng)。1%瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果。產(chǎn)物經(jīng)純化回收后N、G、P、NV、L2段PCR產(chǎn)物連接到為pMD18-T simple克隆載體，L1段PCR產(chǎn)物連接到為pGEM-T載體上，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，命名為pT-N，pT-G，pT-P，pT-NV，pT-L2，pGEM-T-L1，并對構(gòu)建的重組菌提取質(zhì)粒，進行酶切，PCR和測序鑒定；然后將L1，L2片段以相同的酶切位點相連，獲得全長的L片段；最后將目的片段分別亞克隆到pCI中。重組質(zhì)粒用酶切和PCR方法鑒定，陽性克隆送上海生物工程公司測序。

表2　HLJ-09株基因組各片段PCR反應(yīng)條件

1.4IHNV HLJ-09株微型基因組(pCI-LFGT)的構(gòu)建

以pMD18-T-EGFP質(zhì)粒為模板擴增EGFP序列，將HdvRz+Leader序列進行PCR擴增，引入KpnⅠ酶切位點；同樣HamRz+Trailer序列引入NheⅠ酶切位點。將PCR產(chǎn)物HdvRz+Leader、EGFP、HamRz+Trailer序列純化回收后克隆于pMD18-T simple Vector，轉(zhuǎn)化，重組質(zhì)粒鑒定正確后測序。

將EGFP通過融合PCR反向插入到HdvRz+Leader和HamRz+Trailer兩個片段之間，PCR經(jīng)純化回收連接，轉(zhuǎn)化，經(jīng)鑒定正確后測序驗證，重組質(zhì)粒命名為pMD18-T-LFGT；然后亞克隆至pCI真核表達載體，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，重組質(zhì)粒鑒定正確后測序。

1.5IHNV HLJ-09株輔助質(zhì)粒在細胞中的表達

用LipofectamineTMLTX and PLUSTMReagents (Invitrogen,Carlsbad,CA) 將鑒定正確的pCI-N、pCI-P、pCI-L、pCI-G質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染于EPC細胞，轉(zhuǎn)染過程中設(shè)陰性對照。間接免疫熒光(IFA)檢測蛋白表達：從培養(yǎng)箱中取出24孔培養(yǎng)板，用預(yù)冷的4%多聚甲醛固定；0.2%的Triton穿孔；3%BSA封閉；分別加入3%BSA稀釋的一抗：pCI-N孔加入的兔抗IHNV-N蛋白血清(1∶500)；pCI-P和pCI-L孔加入兔抗IHNV全病毒血清(1∶500)；pCI-G孔加入兔抗IHNV-dG蛋白血清(1∶500)孵育；加入3%BSA稀釋FITC標記羊抗兔IgG(1∶200)孵育，同時設(shè)陰性對照，熒光顯微鏡觀察。

1.6IHNV HLJ-09株微型基因組和輔助質(zhì)粒功能鑒定

將生長狀態(tài)良好的EPC細胞鋪于24孔板，待細胞密度達到80%左右時進行轉(zhuǎn)染。細胞洗滌后每孔感染100TCID50的IHNV HLJ-09，16 ℃孵育1 h，按轉(zhuǎn)染試劑說明書要求將1 μg pCI-LFGT質(zhì)粒加入到轉(zhuǎn)染試劑混合液中，加入細胞，16 ℃培養(yǎng)48 h后熒光顯微鏡下觀察EGFP的表達情況，陰性對照孔不感染IHNV。

輔助質(zhì)粒鑒定孔轉(zhuǎn)染時不添加輔助病毒，pCI-LFGT質(zhì)粒與pCI-N、pCI-P、pCI-NV、pCI-L、pCI-G質(zhì)粒的添加比例為10∶5∶5∶2∶1∶1，陰性對照孔中不含輔助質(zhì)粒pCI-L，16 ℃培養(yǎng)48 h后熒光顯微鏡下觀察EGFP的表達情況。

1.7攜帶虹鱒干擾素的IHNV微型基因組的構(gòu)建、鑒定及應(yīng)用

虹鱒攻毒IHNV HLJ-09后第10 d取脾臟研磨后加適量PBS，利用Trizol法提取RNA，以：IFN1 F28a 5′GAATTCTGTGACTGGATCCGA 3′(含有EcoRⅠ酶切位點)；IFN1 R28a：IFN 5′CTCGAGTCAGTACAT-CTGTG 3′(含有XholⅠ酶切位點)為上下游引物RT-PCR擴增IFN序列(471 bp)。PCR產(chǎn)物純化回收后測序鑒定。將IFN基因反向插入到HdvRz+Leader和HamRz+Trailer兩個片段之間，PCR產(chǎn)物純化回收后克隆入pMD18-T simple中,并進行鑒定，鑒定正確后亞克隆入pCI載體中，命名為pCI-LFIT。

將pCI-LFIT與5種輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染EPC細胞，同時設(shè)轉(zhuǎn)染pCI-LFGT對照及細胞對照。16 ℃培養(yǎng)72 h，收集并超聲破碎細胞，用SDS-PAGE 2×上樣緩沖液處理后，-20 ℃保存?zhèn)溆?。樣品進行SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，經(jīng)5%脫脂乳封閉，以抗虹鱒IFN蛋白鼠血清(1∶100)為一抗，羊抗鼠HRP-IgG(1∶4000)為二抗，通過DAB底物顯色進行Western blot鑒定。

pCI-LFIT與輔助質(zhì)粒pCI-N、pCI-P、pCI-NV、pCI-L共轉(zhuǎn)染24 h之前已接種100TCID50IHNV HLJ-09毒株的EPC細胞，同時設(shè)空載體轉(zhuǎn)染對照和接種病毒的細胞對照，每組設(shè)兩個平行，48 h后提取各孔RNA，SYBR Green real-time RT-PCR擴增G基因序列，檢測引物如下：上游引物：5′ GGAGAAATACGTCGCC-CAGTA 3′，下游引物：5′ AACAGCAAGGAGGAGAACCAG 3′ ；擴增β-actin內(nèi)參控制序列，檢測引物如下：上游引物：5′ GATGGACTCTGGTGATGGTGTGAC 3′，下游引物：5′ TTTCTCTTTCGGCTGTG-GTGGTG 3′。運用7500 Sy-stem Software實時PCR 檢測系統(tǒng)進行數(shù)據(jù)采集和數(shù)據(jù)分析。

2結(jié)果

2.1IFA檢測輔助質(zhì)粒pCI-N、pCI-G、pCI-P、pCI-L在細胞中的表達

熒光顯微鏡下觀察各轉(zhuǎn)染孔IFA結(jié)果，發(fā)現(xiàn)各轉(zhuǎn)染孔均出現(xiàn)特異性的綠色熒光(圖1)，但熒光亮度不同，其中pCI-N轉(zhuǎn)染孔熒光量最多，pCI-L轉(zhuǎn)染孔熒光量最少，pCI-G較pCI-N差些，各質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率可能是影響不同蛋白表達量的重要因素。

圖1　重組質(zhì)粒pCI-N、pCI-P、pCI-L、pCI-G和pCI在EPC細胞中表達產(chǎn)物間接免疫熒光結(jié)果(100×)

A：pCI-N轉(zhuǎn)染的EPC細胞；B：pCI-P轉(zhuǎn)染的EPC細胞；C：pCI-L轉(zhuǎn)染的EPC細胞；D：pCI-G轉(zhuǎn)染的EPC細胞；E：pCI轉(zhuǎn)染的EPC細胞對照

2.2IHNV HLJ-09株微型基因組pLFGT的功能鑒定

利用IHNV HLJ-09株作為輔助病毒與微型基因組共轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染后72 h觀察發(fā)現(xiàn)IHNV HLJ-09株感染孔在熒光顯微鏡下可見特異性的綠色熒光，而對照孔呈現(xiàn)陰性，結(jié)果見圖2。

圖2　IHNV微型基因組的功能鑒定(100×)

2.3IHNV HLJ-09株輔助質(zhì)粒的功能鑒定

pLFGT與輔助質(zhì)粒pCI-N、pCI-P、pCI-L、pCI-NV和pCI-G共轉(zhuǎn)染，熒光顯微鏡下觀察其結(jié)果，發(fā)現(xiàn)檢測孔出現(xiàn)特異性的綠色熒光，而缺少pCI-L質(zhì)粒的對照孔無熒光出現(xiàn)，結(jié)果見圖3。

圖3　IHNV輔助質(zhì)粒的功能鑒定(100×)

2.4攜帶虹鱒干擾素的IHNV微型基因組的功能鑒定及應(yīng)用

Western blot檢測微型基因組表達的IFN，結(jié)果可知：添加pCI-LFIT孔在27 kDa目的位置處左右出現(xiàn)了特異性條帶，而添加pCI-LFGT孔及細胞對照孔無條帶產(chǎn)生，表明攜帶IFN的IHNV微型基因組得到表達。結(jié)果見圖4。

圖4　Western Blot檢測pCI-LFIT在EPC細胞中的表達

1.預(yù)染蛋白 Marker；2.pCI-LFIT轉(zhuǎn)染EPC；3.pCI-LFGT轉(zhuǎn)染EPC；4.EPC細胞

Real-time PCR擴增IHNV-HLJ-09株病毒的G基因和內(nèi)參基因，分別得到IHNV G基因216 bp及β-actin基因167 bp，與預(yù)期目的條帶大小相符。結(jié)果見圖5。

圖5　IHNV G和IFN基因?qū)崟rPCR擴增產(chǎn)物

1,4.DNA Marker 2000bp；2.IHNV G擴增結(jié)果；5.鯉β-actin基因擴增結(jié)果；3,6.引物PCR對照；

運用7500 System Software實時PCR檢測系統(tǒng)定量分析接種IHNV-HLJ-09株的EPC細胞的病毒感染量。結(jié)果顯示與未轉(zhuǎn)染組相比，pCI-LFIT質(zhì)粒轉(zhuǎn)染EPC細胞孔中病毒RNA拷貝數(shù)與空載體及未轉(zhuǎn)染孔相比呈減少趨勢且差異極顯著(P<0.01)，病毒的復(fù)制效率降低，因此可以認為干擾素起到了明顯的抗病毒作用，結(jié)果見圖6。

圖6　SYBR Green real-time RT-PCR檢測EPC中

3討論

傳染性造血器官壞死病毒(IHNV)繁殖時主要遵循負鏈RNA病毒的復(fù)制原則，而且病毒侵染細胞和脫衣殼都是在RdRp的指導(dǎo)下完成[6-9]。另外，負鏈RNA病毒本身不具有感染性，感染周期必須通過轉(zhuǎn)錄mRNA方能啟動[10]。本試驗采用的RNA pol II轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)對于小基因組的RNA病毒具有高的轉(zhuǎn)錄效率，并且不需要再添加T7 RNA聚合酶，既節(jié)省了篩選穩(wěn)定表達T7 RNA聚合酶的復(fù)雜過程又避免了病毒對細胞的病變效應(yīng)，而且此系統(tǒng)對多種細胞系有廣泛的應(yīng)用性，如A/J鼠源的293T、BHK-21、NA細胞等[12]。

本研究采用的微型基因組反向遺傳學(xué)技術(shù)除了要提供輔助蛋白或者病毒，還要涉及基因組復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的示蹤基因，因此采用增強型綠色熒光蛋白(EGFP)作為報告基因。另外，基因組5′末端和3′末端非翻譯區(qū)序列對病毒的拯救成敗和效率有重大影響。LeMercier等[13]發(fā)現(xiàn)，之所以依賴錘頭狀核酶(HamRz)和丁型肝炎核酶(HdvRz)能實現(xiàn)病毒基因組RNA從5′-3′的精確轉(zhuǎn)錄，是因為多余的病毒基因組末端序列會導(dǎo)致病毒的拯救的效率。切割作用主要利用底物間的互補作用而形成空間結(jié)構(gòu)來完成,而在3′端的附近存在切割位點[14]；HdvRz包含順式和反式切割兩種結(jié)構(gòu)，反式活性結(jié)構(gòu)的HdvRz通過基因組的5′端的切割位點，可以切割外源的RNA片段[15]。分析這兩種酶的結(jié)構(gòu)特性，能夠形成一個可以將病毒基因組包起來的三明治結(jié)構(gòu)，從而得到一個完整的IHNV基因組RNA。

本試驗通過SOE-PCR法將IHNV HLJ-09株基因組3′端的Leader序列和N基因5′端的非編碼區(qū)、增強型綠色熒光蛋白(EGFP)基因、L基因3′端非編碼區(qū)和5′端Trailer序列的片段依次連接[16]，該片段在反向克隆入RNA pol II啟動子與丁型肝炎病毒的核酶裂解位點之間構(gòu)建了微型基因組[17]。IHNV直接感染EPC細胞時轉(zhuǎn)染微型基因組，報告基因得到表達，表明此微型基因組RNA可被輔助病毒提供的N、P、L等蛋白翻譯組以及表達的基因具有IHNV特異性；將所構(gòu)建的5個輔助質(zhì)粒pCI-N、pCI-P、pCI-L、pCI-G和pCI-NV與微型基因組共轉(zhuǎn)染時，報告基因得到表達，證明這些輔助質(zhì)粒具有輔助其病毒的功能基因。

轉(zhuǎn)染過程中質(zhì)粒的濃度及純度非常重要，質(zhì)粒均要達到轉(zhuǎn)染級標準，濃度在100 ng/μL以上，純度也要在(OD260nm或OD280nm)1.8~2.0之間。轉(zhuǎn)染前宿主細胞自身的狀態(tài)良好是病毒拯救的前提，一般選用傳10代以內(nèi)的細胞用于轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時細胞的生長狀態(tài)比較好且密度要在80%長滿左右[18]，本試驗在轉(zhuǎn)染后每隔幾個小時鑒定熒光表達量，48 h后綠色熒光蛋白表達量較高。為了使質(zhì)粒的純度和濃度均達到轉(zhuǎn)染級別要求，需要去除內(nèi)毒素及其它雜質(zhì)的影響，搖菌時間范圍應(yīng)在12~16 h，以保證得到充足的菌體且細菌又不能釋放出大量內(nèi)毒素而污染。各轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的用量要根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑使用說明書的參考和細胞板的體積選擇相應(yīng)用量。轉(zhuǎn)染效率也與轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的質(zhì)量和比例有關(guān)。本試驗經(jīng)優(yōu)化后選擇5個輔助質(zhì)粒pCI-N、pCI-P、pCI-L、pCI-G和pCI-NV的使用比例為5∶5∶2∶1∶1，報告基因得到較好表達。而且對短復(fù)制體進行分析或基因突變的操作要比對整體基因組的操作要更簡便。

干擾素系統(tǒng)具有廣譜的抗病毒和調(diào)節(jié)細胞免疫活性，靶向表達于病毒感染細胞將會提高治療的效率，并有可能降低副作用。經(jīng)誘導(dǎo)劑(病毒或dsRNA)誘導(dǎo)魚類機體或細胞產(chǎn)生魚類I型干擾素不但含有抗病毒性，而且非體內(nèi)重組表達的I型IFN也擁有該活性[19]。本研究在構(gòu)建IHNV微型基因組基礎(chǔ)上，將干擾素作為外源基因反向插入IHNV微型基因組構(gòu)建表達質(zhì)粒pCI-LFIT，轉(zhuǎn)染EPC細胞后轉(zhuǎn)錄為具有功能性的RNA，后者在IHNV復(fù)制酶復(fù)合物作用下生成負鏈RNA，從而啟動干擾素的表達。經(jīng)鑒定，干擾素特異性表達于EPC細胞中，并且能夠靶向抑制病毒的復(fù)制。綜上所述，本研究構(gòu)建的含有干擾素的微型基因組能在細胞水平上一定程度抑制IHNV復(fù)制，但抑制效率還不十分理想，原因可能是與質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染效率及表達水平有關(guān)。

參考文獻：

[1]Moudy R M，Harmon S B，Sullender W M，et al.Variations in transcription termination signals of human respiratory syncytial virus clinical isolates affect gene expression[J].J Virol，2003，313(1)：250-260.

[2]Biacchesi S，Yu YX，Béarzotti M，et al.Rescue of synthetic salmonid rhabdovirus minigenomes[J].J Gen Virol，2000，81(8):1941-1945.

[3]Rokenes T P，Larsen R，Robertsen B.Atlantic salmon ISG15：Expression and conjugation to cellular proteins in response to interferon，double-stranded RNA and virus infections[J].Mol Immunol，2007，44(5)：950-959.

[4]Kurath G，Ahern K G，Pearson G D，et al.Molecular cloning of the six mRNA species of infectious hematopoietic necrosis virus，a fish rhabdovirus，and gene order determination by R-loop mapping[J].J Virol，1985，53(2)：469-476.

[5]Kurath G，Leong J C.Characterization of infectious hematopoietic necrosis virus mRNA species reveals a nonvirion rhabdovirus protein[J].J Virol，1985，53(2)：462-468.

[6]Kuo L，F(xiàn)earns R，Collins P L.Analysis of the gene start and gene end signals of human respiratory syncytial virus：quasi-templated initiation at position 1 of the encoded mRNA[J].J Virol，1997，71(7)：4944-4953.

[7]Schutze H，Enzmann P J，Kuchling R，et al.Complete genomic sequence of the fish rhabdovirus infectious haematopoietic necrosis virus[J].J Gen Virol，1995，76(10)：2519-2527.

[8]Martin A，Staeheli P，Schneider U.RNA polymerase II-controlled expression of antigenomic RNA enhances the rescue efficacies of two different members of the Mononegavirales independently of the site of viral genome replication[J].J Virol，2006，80(12)：5708-5715.

[9]Liuzzi M，Mason S W，Cartier M，et al.Inhibitors of respiratory syncytial virus replication target cotranscriptional mRNA guanylylation by viral RNA-dependent RNA polymerase[J].J Virol，2005，79(20)：13105-13115.

[10]Fijan N，Sulimanovc′ D，Bearzotti M，et al.Some properties of the Epithelioma papulosum cyprini(EPC)cell line from carp cyprinus carpio [C]//Annales de L'institut Pasteur/Virologie.Elsevier Masson，1983，134(2)：207-220.

[11]Hu C Y，Zhang Y B，Huang G P，et al.Molecular cloning and characterisation of a fish PKR-like gene from cultured CAB cells induced by UV-inactivated virus[J].Fish Shellfish Immun，2004，17(4)：353-366.

[12]Hinzman E E，Barr J N，Wertz G W.Identification of an upstream sequence element required for vesicular stomatitis virus mRNA transcription[J].J Virol，2002，76(15)：7632-7641.

[13]Garcin D，Pelet T，Calain P，et al.A highly recombinogenic system for the recovery of infectious Sendai paramyxovirus from cDNA：generation of a novel copy-back nondefective interfering virus[J].Embo J，1995，14(24)：6087.

[14]尹湘艷，胡國斌，張建業(yè)，等.魚類干擾素系統(tǒng)的研究進展[J].生命科學(xué)儀器，2009，(7)：11-15.

[15]Kuzmin I V，Novella I S，Dietzgen R G，et al.The rhabdoviruses：biodiversity，phylogenetics and evolution[J].Infect Genet Evol，2009，9(4)：541-553.

[16]Zou J，Tafalla C，Truckle J，et al.Identification of a second group of type I IFNs in fish sheds light on IFN evolution in vertebrates[J].J Immunol，2007，179(6)：3859-3871.

[17]劉文華，王志亮，包靜月，等.小反芻獸疫病毒分離株China/Tib/07輔助質(zhì)粒及微型基因組的構(gòu)建及鑒定[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2011，42(10)：1497-1502.

[18]王健楠.傳染性胰腺壞死病毒VP2抗原表位區(qū)間接免疫熒光方法的建立[D].哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

[19]戴偉，許梓榮.魚類干擾素系統(tǒng)研究進展[J].水產(chǎn)科學(xué)，2008，27(5)：266-270.

(責(zé)任編輯：鄧薇)

Infectious haemopoietic necrosis virus minigenome expressing IFN

and its inhibiting effect on virus

WANG Hui-ying1，JIANG Ye2，ZHAO Li-li1，TANG Li-jie1，QIAO Xin-yuan1，

JIANG Yan-ping1，CUI Wen1，LI Yi-jing1，LIU Min2

(1.CollegeofAnimalMedicine，NortheastAgriculturalUniversity，Harbin150030，China;

2.CollegeofAnimalScienceandTechnology，NortheastAgriculturalUniversity，Harbin150030，China)

Abstract：This study constructed and identified the minigenome of infectious haemopoietic necrosis virus,which expressing rainbow trout IFN-Ⅰ.First,the N,P,L,G and NV protein genes of IHNV HLJ-09 were subcloned into the pCI eukaryotic expression vector by using RT-PCR method,this research constructed pCI-N,pCI-P,pCI-L,PCI-G and pCI-NV support plasmids.Amplifying the both ends of IHNV genome sequences and EGFP reporting genes，rainbow trout type Ⅰ IFN genes,which were cloned into the eukaryotic expression vector pCI to build pCI-LFIT and pCI-LFGT.Transfect pCI-LFGT into EPC cell which was infected by IHNV HLJ-09,the real-time PCR assay was used to detect IHNV G gene RNA replication level and total proteins were extracted for Western blot.The reporter genes in the building minigenome could express correctly both with support virus and co-transfect with five support plasmids.The minigenome containing inverted IFN could specifically be expressed in EPC cell lines infected IHNV,the viral replication level was significantly decreased to a certain extent by real-time PCR detection.

Key words：infectious haemopoietic necrosis virus;support plasmids;rainbow trout IFN-Ⅰ;minigenome

中圖分類號：S917.4

文獻標識碼：A

文章編號：1000-6907-(2016)01-0003-06

作者簡介：第一王會英(1988-)，女，碩士研究生，專業(yè)方向為預(yù)防獸醫(yī)學(xué)。E-mail：huiy_wang@163.com通訊作者：劉敏，E-mail：liumin-707@163.com；李一經(jīng)，E-mail：yijingli@163.com

收稿日期：2015-03-28；

修訂日期：2015-07-22

資助項目：國家自然科學(xué)基金(31372568)；東北農(nóng)業(yè)大學(xué)博士啟動基金項目(2012RCB66)