漆酶基因異源表達及其酶活性的研究進展

劉曉慶， 那 日， 郭九峰

(1.內(nèi)蒙古大學(xué)物理科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010021；2.內(nèi)蒙古大學(xué)自治區(qū)離子束生物工程重點實驗室，內(nèi)蒙古呼和浩特 010021)

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漆酶基因異源表達及其酶活性的研究進展

劉曉慶1，2， 那 日2*， 郭九峰2

(1.內(nèi)蒙古大學(xué)物理科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010021；2.內(nèi)蒙古大學(xué)自治區(qū)離子束生物工程重點實驗室，內(nèi)蒙古呼和浩特 010021)

漆酶(laccase，Ec1.10.32)屬于含銅的多酚氧化酶，能有效降解自然界中木質(zhì)素等復(fù)雜有機物。真菌和植物中都可以分泌漆酶，少數(shù)的昆蟲和細菌也可以分泌漆酶，而真菌是漆酶的主要生產(chǎn)者。它通過獲得O2對苯酚物質(zhì)進行催化作用，而生成物中僅有水。漆酶是一種不可多得的環(huán)保型氧化酶。漆酶是參與自然界木質(zhì)素循環(huán)與利用的重要酶之一。漆酶對富含木質(zhì)素的農(nóng)作物殘渣的有效降解作用不僅可以減少秸稈焚燒帶來的環(huán)境問題，而且可以提高青貯飼料的品質(zhì)和利用率，對與木質(zhì)素結(jié)構(gòu)相似的污染物也有明顯的降解能力。據(jù)統(tǒng)計，漆酶有作用底物250多種[1]1。漆酶的底物多樣性決定了它是一種多功能氧化酶。它在工業(yè)、農(nóng)業(yè)及食品工業(yè)都有著極其廣泛的應(yīng)用。近年來研究表明，漆酶在生物技術(shù)方面也有重要的作用，可用于生物傳感器與生物檢測。然而，野生菌株的漆酶活力比較低。自然界中絕大多數(shù)能夠生產(chǎn)漆酶的真菌都受到產(chǎn)量低、不易操作、成本高等因素的限制而難以適應(yīng)商業(yè)化生產(chǎn)。漆酶高溫易失活，也阻礙了它的實際應(yīng)用。如何生產(chǎn)廉價、高效率且活力高的漆酶越來越受到國內(nèi)外眾多學(xué)者的關(guān)注。對漆酶基因進行改造，實現(xiàn)漆酶的異源高效表達是解決這一問題的有效途徑之一。筆者對近年來漆酶基因克隆異源表達及其酶活性研究的最新進展進行綜述。

1漆酶基因的克隆

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，人們對漆酶基因的研究已邁入分子水平。不同來源的漆酶基因得到克隆且進行了性質(zhì)分析及鑒定。有研究表明，多種基因克隆技術(shù)已被用于漆酶基因的克隆。漆酶基因的克隆技術(shù)有聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)、外顯子拼接技術(shù)、cDNA文庫技術(shù)、RACE技術(shù)、基因組文庫探針雜交篩選法、染色體步移技術(shù)和表達文庫抗原篩選法，其中應(yīng)用廣泛的是RT-PCR技術(shù)。RACE技術(shù)和染色體步移技術(shù)是新型的技術(shù)手段，其中RACE技術(shù)是以RNA為模板，但是RNA在試驗過程中極易被污染降解，而且由于其技術(shù)主要是PCR擴增，所以可能出現(xiàn)堿基序列突變；染色體步移技術(shù)以DNA為模板，有效地避免了RNA易被降解這一缺點[2]。鄭苗苗[3]采用簡并PCR、RT-PCR、RACE、染色體步移方法從偏腫革裥菌的成熟菌絲中克隆得到漆酶同工酶cDNA全長基因。1988年Frohman等[4]最早利用cDNA快速擴增技術(shù)將poxI基因成功克隆。隨后，很多研究者采用RT-PCR技術(shù)克隆得到漆酶基因。隨著基因克隆技術(shù)的不斷發(fā)展，很多新型基因克隆技術(shù)與策略也被用于漆酶基因的克隆。洪宇植[5]將漆酶保守序列引物擴增法與長距離反向PCR技術(shù)相結(jié)合，建立了一種漆酶基因的新型克隆體系，高效擴增出野生革耳漆酶的DNA片段的側(cè)翼序列。該方法較傳統(tǒng)的反向PCR高效、簡便、特異，能夠解決擴增片段短、假陽性多的不足[7]。也有學(xué)者將RT-PCR和RACE技術(shù)相結(jié)合，克隆到灰樹花漆酶基因[6]。不同來源的漆酶保守性較低，但是銅離子結(jié)合區(qū)相對保守。鄭邦曉等[7]通過保守引物CuI和CuIV從Cerrena spHYB07中克隆出包括CuI和CuIV保守結(jié)合位點在內(nèi)的1 587 bp的保守序列，再用TAIL-PCR方法克隆側(cè)翼序列。漆酶具有高度保守的銅離子結(jié)合區(qū)和N末端糖基化位點。路運才等[8]根據(jù)漆酶基因的這種特點，利用同源克隆技術(shù)，在玉米的基因中找到與黑麥草漆酶基因的同源片段，并且成功克隆。這為玉米漆酶全長的克隆及對飼用玉米的改良奠定基礎(chǔ)。馮寶珍等[9]利用同源克隆法，從辣椒疫酶基因組克隆了漆酶基因Pclac3。該基因與已知真菌漆酶具有較高的同源性，也具有漆酶基因的保守序列。孫靜[10]7采用大量重疊的引物，并且通過基于兩步PCR的DNA合成法(PDTS)進行GILCC全基因的合成。該方法簡單且易操作，不需要對引物進行磷酸化處理，而且可以較便利地獲得大量的引物。此外，還有很多學(xué)者通過建立基因組文庫或cDNA文庫，采取設(shè)計探針篩選基因的方法克隆基因。Coll等[11]運用基因組文庫和cDNA文庫克隆到擔子菌PM1漆酶基因。

2漆酶基因表達載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化

基因表達載體的構(gòu)建需先用同一種限制酶分別切割目的基因和質(zhì)粒，再用DNA連接酶將二者連接，形成DNA分子,然后將目的基因轉(zhuǎn)入受體細胞。常用的受體細胞有大腸桿菌、枯草桿菌、酵母菌和動植物細胞等。漆酶基因進行異源表達時通常采用微生物作為受體細胞。這是因為它繁殖快，遺傳物質(zhì)相對較少。據(jù)報道，應(yīng)用于漆酶遺傳轉(zhuǎn)化的方法有PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、電激轉(zhuǎn)化、基因槍轉(zhuǎn)化、限制性內(nèi)切酶介導(dǎo)轉(zhuǎn)化、農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化[12]。其中，最常用的為電激轉(zhuǎn)化法。該方法具有簡便、快速、轉(zhuǎn)化效率高等特點。洪玉[13]利用隨機插入策略，用瑞氏木霉的編碼基因cbh1啟動子pcbh1控制栓菌漆酶基因LacA構(gòu)建基因表達載體PCGlacA，直接隨機整合入瑞氏木霉中進行異源表達。孫靜等[10]13-14將帶有GILCCI的基因的表達載體pYM7909通過點擊轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)化進酵母細胞內(nèi)。

3漆酶基因的異源表達

近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，多種來源的漆酶基因已得到克隆，并在不同的宿主細胞中成功表達。目前為止，漆酶的異源表達宿主細胞既有原核生物又有真核生物，而真核宿主細胞占主要地位。其中，作為漆酶基因的真核宿主細胞成功表達的有畢赤酵母(Pichiapastoris)、釀酒酵母(Brewer’s yeast)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)[14]、銀耳芽孢(Tremellaspore)、絲狀真菌瑞氏木霉(Trichodermareesei)等。有學(xué)者已將漆酶基因在煙草植物中成功實現(xiàn)異源表達[15]。目前，漆酶基因在原核細胞中實現(xiàn)表達的卻只有大腸桿菌(Escherichiacoli)和乳酸菌(Lactic acid bacteria)[16]。在該試驗前期，已成功實現(xiàn)漆酶在乳酸菌中的異源表達。目前，陽性重組子的酶學(xué)和產(chǎn)酸特性的研究工作尚在進行中。

畢赤酵母表達系統(tǒng)是目前使用最為廣泛的異源蛋白真核表達系統(tǒng)。大多數(shù)漆酶基因的異源表達都在酵母中完成。該表達系統(tǒng)不僅具有原核表達系統(tǒng)操作優(yōu)點，而且具有真核表達系統(tǒng)的優(yōu)質(zhì)性[17]。由于酵母是單細胞生物，操作簡單而生長速度較快，可進行高密度發(fā)酵培養(yǎng)；酵母對培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的要求低，生產(chǎn)成本低，便于工業(yè)化生產(chǎn)；畢赤酶母表達系統(tǒng)遺傳表達的穩(wěn)定性較強；AOX啟動子控制下的外源基因能得到嚴格的高效表達；酵母不含病原體、熱原體和病毒包涵體，且具有真核細胞的翻譯后修飾功能，可對外源基因翻譯后進行正確的加工和修飾[18]。然而，畢赤酵母表達系統(tǒng)也有其局限性，如信號肽加工不完全等，但這不足以阻擋它成為最具優(yōu)勢的異源表達系統(tǒng)[19]。

大腸桿菌表達系統(tǒng)是研究最早、應(yīng)用最廣泛的原核生物表達系統(tǒng)，也是異源基因表達的重要工具。相對于真核表達系統(tǒng)，它具備以下優(yōu)勢：①宿主的遺傳背景及其生理特性比較清楚，已有不同抗性的菌種可供選擇，易于控制[20]；②繁殖能力強而快，大規(guī)模生產(chǎn)成本低，具有巨大的工業(yè)化應(yīng)用潛力。楊建強等[1]68-70首次嘗試將野生革耳漆酶基因在原核表達系統(tǒng)大腸桿菌中實現(xiàn)表達。這是首次報道真菌來源的漆酶基因在原核表達系統(tǒng)中成功實現(xiàn)表達。Salony等[21]將黑蛋巢菌屬(Cyathusbulleri)產(chǎn)生的漆酶成功地在原核宿主細胞大腸桿菌中實現(xiàn)異源表達。在密碼子偏好性使用頻率上，與枯草芽孢桿菌和畢赤酵母相比，大腸桿菌與漆酶的密碼子用法差異最小，因此大腸桿菌更適合作真菌漆酶的異源表達宿主細胞[22]。也有研究表明，在大腸桿菌系統(tǒng)中雖然能大量產(chǎn)生重組蛋白，但由于在這種系統(tǒng)中不能對重組蛋白進行二級結(jié)構(gòu)修飾，所以重組蛋白沒有經(jīng)過糖基化或空間修飾，進而失去酶活性[23]。

乳酸菌是益生菌，較其他宿主細胞而言是安全級的宿主細胞。它在表達外源基因的過程中不會產(chǎn)生內(nèi)毒素，是近年發(fā)展起來的高效食品級異源基因表達的宿主細胞。自2007年以來，很少有漆酶基因在原核宿主細胞中成功表達。2014年，杏鮑菇漆酶基因成功地在原核宿主細胞乳酸菌中實現(xiàn)異源表達，其遺傳穩(wěn)定性還有待探究。

植物也可以作為漆酶基因的異源表達載體。在植物中表達和分泌的漆酶能夠參與植物修復(fù)系統(tǒng)，而且能夠幫助土豆抵御細菌性病原體的侵害。漆酶基因在農(nóng)作物中的表達可提高農(nóng)作物抗性。2002年Li等[24]把土豆漆酶基因以35S啟動子控制接入西紅柿中，成功表達地轉(zhuǎn)基因西紅柿抗病性能明顯提高。上海生命科學(xué)研究院植物生理生態(tài)研究所實驗室將棉花的漆酶基因轉(zhuǎn)入擬南芥中實現(xiàn)過量表達。研究表明，轉(zhuǎn)基因擬南芥對酚酸類物質(zhì)的抗性得到顯著增強。越來越多的研究者在實現(xiàn)漆酶基因異源表達的同時，期望能得到轉(zhuǎn)基因的植物或轉(zhuǎn)基因工程菌，不僅能解決漆酶產(chǎn)量的問題，而且能獲得具有漆酶功能的轉(zhuǎn)基因生物，為工業(yè)化生產(chǎn)奠定理論基礎(chǔ)。表1為近年來已實現(xiàn)異源表達的部分漆酶基因。

漆酶基因的克隆及序列分析的主要目的是實現(xiàn)漆酶的高效表達。真菌漆酶培養(yǎng)時間過長、過程易污染等條件限制難以實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。利用基因工程技術(shù)獲得漆酶的高產(chǎn)菌株是實現(xiàn)漆酶高效表達的有效途徑。到目前為止，已有多種來源的漆酶成功實現(xiàn)異源表達，但還僅限于實驗室研究，未能投入到工業(yè)化生產(chǎn)。

并不是所有的漆酶基因轉(zhuǎn)入載體細胞后都能夠表達。2014年陽經(jīng)慧[31]將從草菇中分離到的6個漆酶基因分別命名為vv-lac1、vv-lac4、vv-lac5、vv-lac6、vv-lac8、vv-lac9，電轉(zhuǎn)化入畢赤酵母中，對重組子進行酶活篩選，發(fā)現(xiàn)僅帶有vv-lac6的轉(zhuǎn)化子具有酶活。轉(zhuǎn)化后的重組子可以通過含有適量的愈創(chuàng)木酚或ABTS的平板培養(yǎng)基進行初篩，成功表達的重組子在含有愈創(chuàng)木酚的培養(yǎng)基中菌落周圍會出現(xiàn)微紅棕色，而在含有ABTS的培養(yǎng)基中菌落周圍會出現(xiàn)墨綠色。對于有顏色變化的菌落，可經(jīng)過菌落PCR復(fù)篩。當PCR產(chǎn)物與目的基因相同時，表明漆酶基因成功表達。

表1　已實現(xiàn)異源表達的部分漆酶基因[25-30]

4漆酶活性的測定和分析

測定漆酶活性是評價重組子異源表達漆酶性能的常用方法。漆酶是單電子氧化酶，其作用底物非常廣泛。不同來源的漆酶對底物的親和力不同，因此漆酶作用底物有多種。按結(jié)構(gòu)，漆酶可分為酚類及其衍生物、芳胺及其衍生物、羥酸及其衍生物、生物色素、金屬有機化合物、其他非酚類底物六類。測定漆酶活力的方法有測O2法(較早的測漆酶活力方法)、高效液相色譜法(HPLC法)、測壓法、微量熱法、脈沖激光光聲法、分光光度計法、級譜法等[32]。在這些方法中，被廣泛采用的方法為分光光度計法。該方法操作簡便、快捷，近年來受到眾多學(xué)者的青睞。

分光光度計法常見的作用底物有丁香醛連氮、苯胺藍、愈創(chuàng)木酚、(2，2-聯(lián)氮基雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽)(ABTS)、鄰聯(lián)甲苯胺、二茂鐵。其中，以ABTS為底物測定漆酶的活性是目前國內(nèi)外學(xué)者最常用的方法。ABTS易溶于水且反應(yīng)只有一步，其陽離子自由基在水溶液中呈淺藍綠色且較穩(wěn)定，漆酶分解ABTS的產(chǎn)物在420 nm處的吸光系數(shù)遠大于底物ABTS[33]10，其吸光系數(shù)為3.6×104L/(mol·cm)。以愈創(chuàng)木酚為底物時反應(yīng)的時間較長，酶活力低，但反應(yīng)較穩(wěn)定。這與該反應(yīng)的米氏常數(shù)較大有關(guān)。在465 nm處測定其吸光值，摩爾消光系數(shù)為4.8×104L/(mol·cm)，目前應(yīng)用也比較廣泛。當以丁香醛連氮為底物時，酶活力較高，且由于丁香醛連氮的摩爾消光系數(shù)很大，達6.5×104L/(mol·cm)，靈敏度也很高，且抗干擾性好，但當?shù)孜锖兔敢毫枯^大時，反應(yīng)不太穩(wěn)定，需以冰浴來終止反應(yīng)，而酶活力會明顯低于不用冰浴時。 以鄰苯甲胺為底物時，酶活較低，而且該底物的水溶性不太好，故不宜采用。以二茂鐵為底物測定漆酶活性，準確度十分精準。這種檢測方法沒有多余的物質(zhì)干擾，簡單，高效，但是在國內(nèi)應(yīng)用不高，所以不常被人們用作生物酶的活性檢測。

重組漆酶的活性除了與來源有關(guān)外，還受到溫度、pH、金屬離子濃度的影響。據(jù)報道，溫度、pH影響漆酶的表達,而Cu2+影響漆酶的表達活性。真菌漆酶最適pH隨著反應(yīng)底物的不同而變化。多數(shù)真菌漆酶為酸性蛋白，最適pH一般在3.0～6.0之間。同一種來源的漆酶對不同反應(yīng)底物的最適溫度也有差異。大多數(shù)真菌漆酶的最適反應(yīng)溫度在40～60 ℃之間，但其耐熱性均較差。此外，大量研究表明，適當濃度的Cu2+對漆酶活性有較大的促進作用，而且能提高漆酶穩(wěn)定性。若濃度過大，則漆酶活性反而下降。外界條件影響漆酶活性，其生物量并沒有發(fā)生變化。其他金屬離子如Mn2+、Na+、Zn2+、Ca2+、Fe3+、K+、Ba2+、Al3+、Fe2+、Mg2+等對漆酶活性均有一定的影響，但是不同的金屬離子對不同來源真菌漆酶活性的影響有一定的差異，即使同一種金屬離子對不同來源的漆酶作用也有不同[33]35-44。漆酶來源很多，序列多變，結(jié)構(gòu)各異，導(dǎo)致不同來源的漆酶表現(xiàn)出來的催化特性如催化氧化能力、最適pH、底物專一性和穩(wěn)定性相差較大。

雖然已有多種漆酶成功實現(xiàn)異源表達，但是大多數(shù)重組漆酶的產(chǎn)量低于1.0×104U/L，依舊難以滿足工業(yè)化生產(chǎn)需求[34]。重組漆酶活性較低，可能與宿主細胞的密碼子偏好性、信號肽的作用和培養(yǎng)條件等因素有關(guān)。表2為近年來已實現(xiàn)異源表達的部分漆酶重組子的活性。

表2　部分漆酶重組子的活性[35-37]

注：-表示文獻中未研究。

Note:- stands for not research in literature.

5展望

漆酶是一種具有廣泛工業(yè)化用途的酶，是自然界中為數(shù)不多的木質(zhì)素降解酶之一。漆酶的應(yīng)用需要大量廉價且生產(chǎn)周期短的酶制劑。在自然界中，白腐真菌是漆酶的主要生產(chǎn)者，但野生型真菌的漆酶產(chǎn)量較低，培養(yǎng)周期長，因此限制了漆酶的大量生產(chǎn)和廣泛應(yīng)用，難以滿足工業(yè)化的生產(chǎn)。如何實現(xiàn)漆酶的高效表達越來越受到國內(nèi)外學(xué)者的重視。隨著分子生物技術(shù)和基因工程的快速發(fā)展，在分子水平上研究漆酶逐漸發(fā)展起來。國外對漆酶分子學(xué)研究得比較深入。很多種漆酶基因得到克隆，并且對其進行了分析和鑒定。目前，已有一些不同來源的漆酶在異源真核和原核系統(tǒng)中實現(xiàn)表達。研究漆酶異源表達，探究如何實現(xiàn)漆酶異源高表達，為漆酶大規(guī)模的生產(chǎn)和廣泛應(yīng)用提供理論依據(jù)，使得漆酶向工業(yè)化生產(chǎn)又邁進了一步。但是，目前漆酶的異源表達仍不理想，還未能真正實現(xiàn)漆酶的高效表達且達到工業(yè)化生產(chǎn)需求，還需要更進一步的研究。加強分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)鄰域的研究，更深入地了解漆酶基因的結(jié)構(gòu)、功能，進而實現(xiàn)在基因水平對漆酶進行改造和優(yōu)化，真正實現(xiàn)漆酶的高效異源表達。

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[35] 張銀波，姜瓊，江木蘭，等.金針菇漆酶基因的克隆及其在畢赤酵母中的表達研究[J].微生物學(xué)報，2004(6):775-779.

[36] 李琦.變色栓菌漆酶同工酶基因克隆表達及其在染料脫色中的應(yīng)用[D].南京：南京林業(yè)大學(xué), 2013.

摘要近年來由于漆酶在生物漂白和農(nóng)作物秸稈利用等方面具有廣闊的應(yīng)用前景，對漆酶的研究越來越受到國內(nèi)外學(xué)者的重視。然而，自然界漆酶的產(chǎn)量和酶活較低，難以適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)需求。此外，漆酶的產(chǎn)酶效率低，成本高。實現(xiàn)漆酶的異源高效表達是解決這一問題的有效途徑。目前，國內(nèi)外已有多種來源的漆酶基因被成功克隆，并在不同的宿主細胞中實現(xiàn)異源表達，但迄今為止漆酶基因異源表達結(jié)果仍然不理想，離真正實現(xiàn)漆酶的高效表達還有一定距離。

關(guān)鍵詞漆酶；宿主細胞；異源表達；基因克??；酶活性

Research Progress of Laccase Gene Heterologous Expression and Enzyme Activity

LIU Xiao-qing1,2, NA Ri2*, GUO Jiu-feng2(1.School of Physical Science and Technology, Inner Mongolia University, Hohhot, Inner Mongolia 010021; 2.Key Laboratory of Ion Beam Biotechnology, Inner Mongolia University, Hohhot, Inner Mongolia 010021)

AbstractIn recent years, due to laccase has broad application prospects in bio-bleaching and farming straw utilization, research of laccase has been paid more and more attention by domestic and foreign scholars.However, yield and enzyme activity of laccase in nature is difficult to meet the requirements of industrial production.Moreover, the production efficiency is low and cost is high, heterologous expression is an effective way for solving this problem.Currently, a variety of different sources of laccase gene are successfully cloned and expressed in different host cells.So far, the heterologous expression of laccase gene is still unsatisfactory, and there is a certain distance for realizing high efficient expression of laccase.

Key wordsLaccase; Host cells; Heterologous expression; Gene cloning; Enzyme activity

收稿日期2015-11-30

作者簡介劉曉慶(1991- )，女，山西長治人，碩士研究生，研究方向：環(huán)境生物物理。*通訊作者，教授，碩士生導(dǎo)師，從事環(huán)境生物物理方面的研究。

基金項目國家自然科學(xué)基金項目(51267014)。

中圖分類號S 188

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)01-018-04