滲透脅迫對(duì)小桐子幼苗脯氨酸積累及其代謝途徑的影響*

鄧?guó)P飛，楊雙龍，龔明

(云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，生物能源持續(xù)開發(fā)利用教育部工程研究中心，

云南省生物質(zhì)能與環(huán)境生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南　昆明650500)

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滲透脅迫對(duì)小桐子幼苗脯氨酸積累及其代謝途徑的影響*

鄧?guó)P飛，楊雙龍，龔明

(云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，生物能源持續(xù)開發(fā)利用教育部工程研究中心，

云南省生物質(zhì)能與環(huán)境生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明650500)

摘要：植物在滲透脅迫下，積累脯氨酸以降低滲透勢(shì)是重要的抗逆境調(diào)節(jié)途徑。本研究以聚乙二醇(PEG 6000)不同濃度的溶液模擬滲透脅迫，研究了其對(duì)小桐子幼苗脯氨酸積累及其代謝途徑的影響。結(jié)果表明，PEG 6000處理可顯著提高小桐子幼苗的脯氨酸含量及脯氨酸合成代謝關(guān)鍵酶Δ1-吡咯琳-5-羧酸合成酶(P5CS)和鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶(OAT)的活性，而降低了脯氨酸脫氫酶(ProDH)的活性。RT-PCR分析也顯示，10 %PEG 6000處理顯著上調(diào)了P5CS和OAT基因的表達(dá)水平，但抑制了ProDH基因的表達(dá)，表明滲透脅迫可通過(guò)活化脯氨酸合成的兩條途徑和抑制其降解途徑促使小桐子積累大量的脯氨酸。

關(guān)鍵詞：小桐子；脯氨酸；滲透脅迫；代謝途徑

小桐子(Jatrophacurcas)又名小油桐、麻瘋樹等，屬大戟科(Euphorbiaceae)麻瘋樹屬(Jatropha)重要能源植物，廣布于世界熱帶地區(qū)，在中國(guó)主要生長(zhǎng)于云南、四川、海南等地[1～3]。其所具備的適應(yīng)范圍廣、生物產(chǎn)量大、耐貧瘠等特性使之成為綠化荒山、水土保持的先鋒樹種[2～3]。此外，小桐子種子可入藥，也是開發(fā)新藥的理想資源。特別是其種子含油量高，油質(zhì)近似柴油，是一種理想的可再生石油植物，受到了廣泛的關(guān)注[3～6]。小桐子作為熱帶起源的樹種，一般認(rèn)為其應(yīng)具有較強(qiáng)的耐旱能力[4～6]。但有不少證據(jù)表明，小桐子對(duì)滲透脅迫很敏感，干旱和半干旱地區(qū)的小桐子生長(zhǎng)狀況遠(yuǎn)不如降雨豐富地區(qū)[7]。

滲透脅迫是影響植物生長(zhǎng)的主要因素之一，是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要自然災(zāi)害，是植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中最易受到的逆境脅迫，它對(duì)植物的傷害表現(xiàn)在:抑制生長(zhǎng)、光合作用下降、產(chǎn)生過(guò)量的活性氧等[8～9]。植物在滲透脅迫下，通過(guò)降低細(xì)胞滲透勢(shì)以適應(yīng)水分脅迫環(huán)境[7～9]，其中積累一定量的相容滲透劑(Compatible osmolyte)以降低水勢(shì)是一種主要途徑[8～9]。作為植物細(xì)胞內(nèi)合成的有機(jī)滲透調(diào)節(jié)劑，脯氨酸是分布最廣的一種。植物體內(nèi)脯氨酸的積累通過(guò)合成的增加與降解的減少而實(shí)現(xiàn)[9～14]，其中，Δ1-吡咯琳-5-羧酸合成酶(Δ1-pyrroline-5-carboxylate synthetase，P5CS)、谷氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase，GDH)與鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ornithine aminotransferase，OAT)、精氨酸酶(Arginase)分別是脯氨酸合成中谷氨酸和鳥氨酸途徑的限速酶[8,11]，而脯氨酸脫氫酶(proline dehydrogenase，ProDH)是脯氨酸降解途徑的關(guān)鍵酶[11～14]。

Kumar 等[14]和陳凱、許鎖鏈等[15～16]的研究表明滲透和干旱脅迫可誘導(dǎo)小桐子體內(nèi)積累大量脯氨酸，但對(duì)其具體調(diào)控機(jī)理還報(bào)道較少。本研究通過(guò)檢測(cè)滲透脅迫下小桐子幼苗脯氨酸含量、代謝關(guān)鍵酶活性及基因表達(dá)的變化，以初步闡明滲透脅迫誘導(dǎo)小桐子幼苗脯氨酸積累的機(jī)理，為下一步小桐子抗?jié)B透脅迫的相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1　材料及培養(yǎng)

小桐子種子采自云南省元謀縣，室溫避光儲(chǔ)存。參照李忠光等[17]的方法用1.5 %(W/V)的硫酸銅溶液消毒30 min，蒸餾水浸種24 h后，播于墊有7層濕濾紙的白磁盤中。26℃下暗萌發(fā)7天，將萌發(fā)后的種子于1/2 Hogland營(yíng)養(yǎng)液、26/20 ℃(晝/夜)、16 h的光照〔強(qiáng)度300 μmol/(m2·s)〕、75 %的相對(duì)濕度的人工氣候培養(yǎng)箱中砂培生長(zhǎng)15天。

1.2　PEG模擬滲透脅迫

將上述培養(yǎng)22天的小桐子幼苗置于以1/2 Hogland營(yíng)養(yǎng)液配制的不同濃度(2 %、4 %、6 %、8 %、10 %、15 %、20 %、25 %)PEG 6000溶液(模擬滲透脅迫環(huán)境)中，26℃、16 h的光照 (光照強(qiáng)度同上)、75 %的相對(duì)濕度的人工氣候箱中脅迫4 天，對(duì)照以1/2 Hogland營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)，之后測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。

1.3　測(cè)定方法

1.3.1脯氨酸含量及其代謝關(guān)鍵酶活性的測(cè)定

脯氨酸含量及其代謝關(guān)鍵酶活性的測(cè)定均以小桐子幼苗葉片為材料。脯氨酸含量按Bates 等[18]的酸性茚三酮法測(cè)定；P5CS和OAT的活性測(cè)定參照楊雙龍[19～21]的方法進(jìn)行，以單位時(shí)間內(nèi)吡咯琳-5-羧酸(pyrroline-5-carboxylate，P5C)的生成量表示；ProDH活性測(cè)定參考Sanchez等[22]的方法，以單位時(shí)間內(nèi)NAD+消耗量表示。 蛋白質(zhì)的測(cè)定按照Bradford[23]方法進(jìn)行，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)樣品。

1.3.2RNA提取和RT-PCR分析

利用兩步裂解法[24]分別提取正常培養(yǎng)(對(duì)照)與10 % PEG 6000處理的小桐子葉片總RNA，并利用DNase I消化基因組DNA使之得以純化。然后以隨機(jī)引物逆轉(zhuǎn)錄，利用TransScript Two-Step RT-PCR SuperMix合成第一鏈cDNA(購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司)。以18S rRNA(GeneBank登錄號(hào)：AY823528)為內(nèi)參進(jìn)行JcP5CS(GenBank登錄號(hào)：GU358610)、OAT(參照小桐子轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果CL5177.contig1[25])、ProDH(GenBank登錄號(hào):KF879446) 的RT-PCR表達(dá)分析(引物序列見表1)。

18S rRNA的擴(kuò)增條件為：94℃ 5 min→[94℃ 30 s，51℃ 30 s，72℃ 30 s]26→72℃ 10 min；JcP5CS和OAT基因的擴(kuò)增采用touch-down PCR條件：94℃ 5 min→{94℃ 30 s，[60℃→48℃ 30 s]，72℃ 30 s}→[94℃ 30 s，47℃ 30 s，72℃ 30 s]26→ 72℃ 10 min}；ProDH基因的擴(kuò)增條件為，94℃ 5 min→[94℃ 30 s，51℃ 30 s，72℃ 30 s]26→72℃ 10 min。反應(yīng)完畢后取5 μL體系進(jìn)行1.2 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，以18 SrRNA為內(nèi)參進(jìn)行各基因表達(dá)的差異性分析。

表1　試驗(yàn)中用到的引物

1.4　數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS13.0進(jìn)行方差分析。統(tǒng)計(jì)結(jié)果用Sigmaplot 10.0作圖，圖中的數(shù)據(jù)均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。

2結(jié)果與分析

2.1　最佳聚乙二醇濃度的篩選

為了確定適宜的PEG 6000處理濃度，分別用0、2 %、4 %、6 %、8 %、10 %、15 %、20 %及25 %的PEG 6000溶液處理小桐子幼苗4 天，葉片的脯氨酸含量測(cè)定結(jié)果見圖1。

圖1　不同濃度PEG 6000處理對(duì)小桐子葉片

由圖1可知，隨著PEG 6000處理濃度的增加，小桐子葉片中脯氨酸含量逐漸升高，處理濃度在10 %和15 %時(shí)脯氨酸含量相對(duì)較高，與對(duì)照相比，脯氨酸含量分別上升了212.1 %(P<0.01)和184.1 %(P<0.01)，之后脯氨酸含量逐漸降低，但仍顯著高于對(duì)照。綜合考慮，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用10 %和15 %的PEG 6000溶液來(lái)處理小桐子幼苗并進(jìn)行脯氨酸代謝關(guān)鍵酶活性的測(cè)定。

2.2　10 %和15 % PEG 6000處理對(duì)小桐子葉片脯氨酸含量的影響

圖2為10 %和15 % PEG 6000處理4天對(duì)小桐子幼苗脯氨酸含量變化的影響。由圖可知，與對(duì)照相比，10 %與15 % PEG 6000處理下小桐子葉片中脯氨酸的積累呈逐步上升趨勢(shì)。15 % PEG 6000處理下小桐子葉片脯氨酸的含量在0-2天內(nèi)增加較10 %處理快，2 天以后減緩，而10 % PEG 6000處理下小桐子葉片脯氨酸的含量則一直升高。推測(cè)可能是15 % PEG 6000相對(duì)脅迫強(qiáng)度較大，對(duì)小桐子幼苗造成了一定程度的生理傷害，從而影響了其脯氨酸代謝途徑，降低了脯氨酸的積累量。

圖2　10 %和15 %PEG 6000處理下小桐子葉片

2.3　10 %和15 %PEG 6000處理對(duì)小桐子葉片脯氨酸代謝關(guān)鍵酶活性的影響

P5CS和OAT分別是脯氨酸合成的谷氨酸途徑和鳥氨酸途徑的關(guān)鍵酶[8,11]。圖3的結(jié)果表明，10 %與15 % PEG 6000處理均可提高P5CS的活性。與對(duì)照相比，PEG 6000處理后第4 天小桐子葉片P5CS的活性分別升高了114.3 %(P<0.01)和93.0 %(P<0.01)。在0-2 天，15 % PEG 6000處理，小桐子葉片P5CS活性升高速度較快，3-4 天后其上升幅度明顯減緩，而在10 % PEG 6000處理下，P5CS活性卻一直保持上升趨勢(shì)，且超過(guò)了15 % PEG 6000處理。因此，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，10 % PEG 6000誘發(fā)的P5CS活性增強(qiáng)效應(yīng)更好，這與幼苗中脯氨酸含量的變化趨勢(shì)基本一致(圖2)。

圖3　10 %和15 %PEG 6000處理下小桐子葉片

圖4顯示，10 %與15 % PEG 6000處理均可顯著提高OAT酶的活性，且在處理的0-3天，15 %PEG 6000誘發(fā)的OAT酶活性增強(qiáng)效應(yīng)略好于10 % PEG 6000，但第3天以后10 % PEG 6000誘發(fā)的OAT酶活性增強(qiáng)效應(yīng)有超越15 % PEG 6000處理的趨勢(shì)。

圖4　10 %和15 %PEG 6000處理下小桐子葉片

植物體內(nèi)脯氨酸的積累由合成代謝與分解代謝的綜合結(jié)果決定，而控制降解途徑的關(guān)鍵酶是ProDH[11～14]。10 %與15 % PEG 6000處理均可降低ProDH的活性。在0-2 天，15 % PEG 6000處理下，小桐子葉片ProDH活性下降速度較快，之后3-4天下降幅度減緩，而10 % PEG 6000處理下的幼苗葉片，ProDH活性呈持續(xù)下降趨勢(shì)，并在PEG處理的第2天以后明顯低于15 %PEG 6000處理。到了第4 天，小桐子葉片中ProDH的活性分別下降了60.6 %(P<0.01)和50.5 %(P<0.01)(圖5)。上述結(jié)果表明，10 % PEG 6000處理對(duì)小桐子葉片ProDH的抑制效應(yīng)優(yōu)于15 % PEG 6000處理(P<0.05)。

圖5　10 %和15 % PEG 6000處理下小桐子葉片

2.4　10 %PEG 6000處理下小桐子幼苗脯氨酸代謝關(guān)鍵酶基因的表達(dá)差異

綜合評(píng)價(jià)后，我們?cè)僖?0 % PEG 6000處理小桐子幼苗，通過(guò)半定量RT-PCR分析脯氨酸代謝關(guān)鍵酶基因的表達(dá)情況，結(jié)果表明，P5CS、OAT、ProDH在滲透脅迫下，存在明顯的基因表達(dá)特異性。P5CS基因的表達(dá)表現(xiàn)出上調(diào)—下調(diào)—上調(diào)的的變化趨勢(shì)，與對(duì)照相比，在處理的第2天與第4天表達(dá)量上調(diào)達(dá)到極顯著水平；OAT基因的表達(dá)呈現(xiàn)持續(xù)上調(diào)的趨勢(shì)，到第2天時(shí)達(dá)到最高表達(dá)量，之后又開始緩慢下降，但其表達(dá)量仍顯著高于對(duì)照；而ProDH基因則表現(xiàn)為整體持續(xù)下調(diào)的變化趨勢(shì)(圖6)。

注：CK為對(duì)照 (正常生長(zhǎng)材料)；1d為10 % PEG 6000 處理第1天；2d為10 % PEG 6000 處理第2天；3d為10 % PEG 6000 處理第3天； 4d為10 % PEG 6000 處理第4天。

圖610 %PEG 6000 對(duì)小桐子葉片JcP5CS、OAT及ProDH基因表達(dá)的影響

Fig.6Effect of 10 % PEG 6000 on the expression ofJcP5CS，OATandProDHgenes in

J.curcasleaves.RT-PCR analysis;BRelative quantities analysis

3討論

植物在受到干旱、低溫、高鹽、重金屬等非生物脅迫時(shí)，都會(huì)直接或間接地發(fā)生滲透脅迫(水分脅迫)。植物會(huì)在短時(shí)間內(nèi)，通過(guò)積累如脯氨酸、甜菜堿等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，以增強(qiáng)其對(duì)逆境的抵抗能力[26]。脯氨酸作為一種理想的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，因其分子量小、極易溶于水等特性，在植物抗?jié)B透脅迫中發(fā)揮重要作用[27]。黃靜等[28]通過(guò)30 % PEG 6000處理發(fā)現(xiàn)，小桐子幼苗脯氨酸含量呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢(shì)；另外，許鎖鏈等[16]的研究表明，滲透及干旱脅迫均可誘發(fā)小桐子的脯氨酸積累，但其具體機(jī)理并不清楚。本研究也表明， 經(jīng)過(guò)10 %與15 % PEG 6000處理可促進(jìn)小桐子葉片脯氨酸的大量積累(圖1~2)，與上述報(bào)道一致。同時(shí)，合成與降解代謝關(guān)鍵酶的活性(P5CS和OAT升高、ProDH下降)與基因表達(dá)量(P5CS和OAT上調(diào)、ProDH下調(diào))的變化趨勢(shì)基本一致，其中，以10 % PEG 6000處理誘導(dǎo)的脯氨酸的積累效應(yīng)最為顯著。這些結(jié)果表明，滲透脅迫可通過(guò)活化脯氨酸的合成和抑制其降解促使小桐子體內(nèi)積累大量的脯氨酸。

脯氨酸合成的2條途徑(谷氨酸途徑和鳥氨酸途徑)對(duì)滲透脅迫下脯氨酸積累的貢獻(xiàn)還存在較多的爭(zhēng)議[29～30]。本研究結(jié)果表明，滲透脅迫可誘發(fā)谷氨酸途徑關(guān)鍵酶P5CS活性和鳥氨酸途徑關(guān)鍵酶OAT活性的大幅上調(diào)，但從基因表達(dá)變化來(lái)看，JcP5CS基因的表達(dá)呈一定的波動(dòng)性，而OAT基因則呈持續(xù)高表達(dá)狀態(tài)(圖6)，表明PEG 6000模擬的滲透脅迫下，兩條合成途徑在脯氨酸積累中都發(fā)揮了重要作用。因此，滲透脅迫誘導(dǎo)的小桐子幼苗脯氨酸積累實(shí)際上是脯氨酸合成的谷氨酸和鳥氨酸途徑被活化及降解途徑被抑制的綜合結(jié)果(圖1~6)。

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Effect of Osmotic Stress on Proline Accumulation and

Metabolic Pathways of Jatropha curcas Seedlings

DENG Feng-fei,YANG Shuang-long,GONG Ming

(School of Life Sciences under Yunnan Normal University，Engineering Research Center of Sustainable Development and

Utilization of Biomass Energy under Ministry of Education，Kunming Key Laboratory of Biomass Energy and

Environmental Biotechnology of Yunnan Province，Kunming Yunnan 650500，P.R.China)

Abstract:Under osmotic stress，plants could accumulate proline to reduce the osmotic potential，which is an important anti-stress regulatory pathway.The effect of osmotic stress generated by polyethylene glycol (PEG 6000) on proline accumulation and metabolic pathways inJatrophacurcasseedlings was investigated in this study.The results showed that PEG 6000 stress could lead to a significant accumulation of proline，a rapid increase of activities of the key enzymes Δ1-pyrroline-5-carboxylate synthetase (P5CS) and ornithine aminotransferase (OAT) of proline biosynthesis，and a decrease of the activity of the key enzyme proline dehydrogenase (ProDH) of proline degradation.The RT-PCR analysis revealed that 10 % PEG 6000 stress activated the expression ofP5CSandOATgenes，but inhibited the expression ofProDHgene inJ.curcasseedlings，and that means that the osmotic stress-induced proline accumulation in theJ.curcasseedlings might be a combined result of the activation of glutamate pathway and ornithine pathways of proline biosynthesis and inhibition of proline degradation pathway.

Key words:Jatrophacurcas; proline;osmotic stress;metabolic pathway

通訊作者簡(jiǎn)介：龔明(1963-)，男，教授，博士，研究方向?yàn)橹参锬婢成飳W(xué)。E-mail:gongming63@163.com

作者簡(jiǎn)介：第一鄧?guó)P飛(1992-)，女，碩士生，研究方向?yàn)橹参锷锘瘜W(xué)與分子生物學(xué)。E-mail: dengfengfei163@163.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(31260169)，國(guó)家自然科學(xué)基金(31260064)。

*收稿日期：2015-06-25

中圖分類號(hào)：Q 945.78

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1672-8246(2016)01-0031-06