逆灸“天樞”穴干預(yù)大鼠結(jié)腸組織基因表達(dá)譜的實(shí)驗(yàn)研究

黃 艷 顧沐恩 翁志軍 張建斌 施 茵 馬 喆竇傳字 劉慧榮, 吳煥淦, 王曉梅 李 璟

(1 上海中醫(yī)藥大學(xué)上海市針灸經(jīng)絡(luò)研究所，上海，200030； 2 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，上海，200437； 3 南京中醫(yī)藥大學(xué)，南京，210023)

逆灸“天樞”穴干預(yù)大鼠結(jié)腸組織基因表達(dá)譜的實(shí)驗(yàn)研究

黃 艷1顧沐恩2翁志軍1張建斌3施 茵1馬 喆1竇傳字1劉慧榮1,2吳煥淦1,2王曉梅1李 璟2

(1 上海中醫(yī)藥大學(xué)上海市針灸經(jīng)絡(luò)研究所，上海，200030； 2 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，上海，200437； 3 南京中醫(yī)藥大學(xué)，南京，210023)

目的：探討逆灸“天樞”穴干預(yù)對(duì)健康大鼠結(jié)腸組織基因表達(dá)譜的影響，本文首次從轉(zhuǎn)錄組學(xué)的角度探討逆灸的作用機(jī)制。方法：16只成年的雄性SD大鼠隨機(jī)分成2組，正常組(NC)、正常+隔藥灸組(NM)，采用隔藥灸天樞穴(雙側(cè))7 d，在2%戊巴比妥鈉麻醉下獲取結(jié)腸組織。從大鼠的一般狀況、體重、結(jié)腸組織病理學(xué)，觀察隔藥灸天樞穴對(duì)健康的正常大鼠的效應(yīng)。每組各取3只提取總RNA，采用RNA-seq的高通量測(cè)序的方法檢測(cè)結(jié)合生物信息學(xué)，分析結(jié)腸組織的mRNA表達(dá)譜。結(jié)果：與NC組比較，隔藥灸不導(dǎo)致的健康大鼠體重降低，不影響結(jié)腸組織病理學(xué)形態(tài)觀察。與NC組比較，NM組的結(jié)腸組織差異表達(dá)基因有866個(gè)，其中上調(diào)604個(gè)，下調(diào)262個(gè)。差異表達(dá)基因涉及的基因本體(GO)主要與細(xì)胞周期、免疫分子和蛋白質(zhì)生物過(guò)程相關(guān)，基因通路(Pathway)主要與機(jī)體免疫和蛋白質(zhì)代謝相關(guān)。結(jié)論：艾灸“天樞”穴不損傷健康成年大鼠的結(jié)腸組織的形態(tài)，或能通過(guò)影響結(jié)腸組織的差異表達(dá)基因的生物學(xué)過(guò)程及通路，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能而發(fā)揮艾灸保健與養(yǎng)生的作用。

逆灸；結(jié)腸組織；基因表達(dá)譜；炎癥性腸病；免疫

炎癥性腸病(Inflammatory Bowel Disease，IBD)是一種慢性非特異性腸道炎性反應(yīng)性疾病，包括克羅恩病(Crohn′s Disease，CD)和潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative Colitis，UC)，因慢性炎性反應(yīng)不易治愈，易復(fù)發(fā)，影響機(jī)體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，一直是消化道疾病中亟待解決的問(wèn)題[1]。腸道黏膜感染和正常的吸收和傳輸障礙，使IBD患者的胃腸傳輸與健康人不同[2]。結(jié)腸是IBD的好發(fā)部位，伴有腸道的慢性炎性反應(yīng)及微生物紊亂[3]。由于IBD發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，迄今為止，IBD在臨床上主要采取藥物控制和手術(shù)為主的治療方法，尚缺乏有效的防治措施。

“逆灸”即用灸法保健防病，是針灸“治未病”的主要預(yù)處理方法之一。明·高武在《針灸聚英》里說(shuō):“無(wú)病而先針灸曰逆，逆，未至而迎之也?！敝嗅t(yī)古籍記載了大量關(guān)于“逆灸”防病保健的案例與方法，這種艾灸療法被現(xiàn)代醫(yī)家和百姓用以養(yǎng)生，既可預(yù)防疾病發(fā)生又可既病防變。艾灸激發(fā)經(jīng)絡(luò)之氣，扶助正氣，提高機(jī)體抵御各種致病因子和應(yīng)變的能力，調(diào)節(jié)免疫功能[4]。筆者所在團(tuán)隊(duì)前期研究表明，艾灸“天樞”穴可緩解炎癥性腸病，調(diào)節(jié)免疫炎性反應(yīng)因子[5-8]。本實(shí)驗(yàn)采用系統(tǒng)生物學(xué)研究方法——轉(zhuǎn)錄組學(xué)，以雄性SD成年健康大鼠為研究對(duì)象，觀察艾灸“天樞”穴對(duì)機(jī)體的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠，體重(180±20)g，由上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SCXK(京)2012-0001。飼養(yǎng)條件：清潔級(jí)，12 h晝夜節(jié)律交替(上午7點(diǎn)—下午7點(diǎn)照明)，室內(nèi)溫度(20±2)℃，室內(nèi)濕度50%～70%，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開(kāi)始正式實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用指南執(zhí)行，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的處置遵循科技部頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》規(guī)定。

1.2 主要試劑與儀器 NanoDrop-2000(Wilmington，DE，USA)；TRIzol試劑(Life Technologies，Carlsbad，USA)；TapeStation 2200(Agilent Technologies Inc.，Santa Clara，CA，USA)；Illumina TruSeqTM RNA Sample Prep Kits(Illumina，San Diego，CA，USA)；Illumina HiSeq 2000 sequencer(Illumina，San Diego，CA，USA)；TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS(Illumina，San Diego，CA，USA)；RNase inhibitor(ThermoFisher Scientific，Rockford，IL，USA)；實(shí)驗(yàn)用小艾條(蘄艾，湖北)。

1.3 艾灸干預(yù) NM組：取天樞穴(雙)，穴位的定位參考《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)，李忠仁》。藥餅由中藥粉(黃連、附子、肉桂、木香、紅花、丹參和當(dāng)歸)結(jié)合黃酒混合攪拌成厚糊狀，采用模具做成直徑1 cm，厚0.45 cm的藥餅；采用模具做成直徑和高分別為0.6 cm的艾柱，重90 mg。采用固定器固定好大鼠，暴露天樞穴(雙)，提前1 d將天樞穴的鼠毛剔除，將做好的艾柱放在藥餅的上面，然后將藥餅放置天樞穴位上(雙)，點(diǎn)燃艾絨，每個(gè)穴位每次2個(gè)艾柱，每天上午艾灸1次，共干預(yù)7次。采用與NM組固定相同的方法NC組的大鼠固定，固定時(shí)間相同。

1.4 樣本采集 隔藥灸干預(yù)7 d后，所有大鼠在2%戊巴比妥鈉(30～40 mg/kg)麻醉下，在距離肛門(mén)1 cm處采集6～8 cm的遠(yuǎn)端結(jié)腸，每個(gè)結(jié)腸分成2部分，一部分用4%多聚甲醛固定，另一部分剪碎后置于凍存管中，用液氮凍存1 h后保存在-80 ℃冰箱備用。

1.5 結(jié)腸的組織病理學(xué)觀察 將固定于多聚甲醛的24 h的結(jié)腸組織取出，清潔修片后脫水包埋，切成4 μm薄片，采用HE染色在光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)腸的組織病理學(xué)變化。

1.6 總RNA抽提、質(zhì)控及文庫(kù)構(gòu)建 每組取3只結(jié)腸組織采用Trizol的方法提取結(jié)腸組織的總RNA，采用Nanodrop2000檢測(cè)其純度和濃度，采用安捷倫2200檢測(cè)總RNA的完整性，將RIN值大于7的總RNA用于文庫(kù)構(gòu)建。每個(gè)樣本取3 μg總RNA建立小RNA文庫(kù)，根據(jù)Illumina TruSeqTM RNA Sample Prep Kits(Illumina，San Diego，CA)操作說(shuō)明分別選取不同的index標(biāo)簽建庫(kù)。建庫(kù)完成后利用安捷倫2200檢測(cè)文庫(kù)的質(zhì)量。

1.7 RNA-seq高通量測(cè)序和數(shù)據(jù)分析 本實(shí)驗(yàn)采用TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS(Illumina)試劑在cBot上生成簇，接著在Hiseq2000測(cè)序平臺(tái)上運(yùn)行單端測(cè)序程序。測(cè)序過(guò)程由Illumian提供的Data collection software進(jìn)行控制，實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)分析。與參考序列比對(duì)，采用DESeq進(jìn)行分析，計(jì)算變化倍數(shù)和P值，設(shè)定Fold Change≥2為上調(diào)，≤0.5為下調(diào)，P值<0.05，并將表達(dá)低于0.01的數(shù)值過(guò)濾掉。

1.8 基因通路分析和GO分析 利用https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp分析了基因本體(Gene Ontology，GO)和基因通路(Pathway)的富集分析，P值<0.05為顯著富集。

2 結(jié)果

2.1 隔藥灸“天樞”穴對(duì)大鼠體重及結(jié)腸組織形態(tài)的影響 大鼠一般情況比較，發(fā)現(xiàn)2組大鼠均毛色密集光澤，大便成形，無(wú)便血、腹瀉，行動(dòng)活躍、反應(yīng)靈敏。大鼠在隔藥灸“天樞”穴后從第1天到第7天，體重共增加了35 g，正常組增長(zhǎng)了33 g。與NC組比較，NM組體重增長(zhǎng)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖1。

圖1 不同時(shí)間點(diǎn)2組大鼠體重比較

注：NC，正常組；NM，正常+隔藥灸組。(每組n=8)。

采用光學(xué)顯微鏡進(jìn)一步觀察HE染色后的結(jié)腸組織病理學(xué)微觀變化，NC組與NM組的腸黏膜及腺體結(jié)構(gòu)均完整，排列整齊規(guī)則，無(wú)充血、水腫及壞死，無(wú)漿細(xì)胞及中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)。見(jiàn)圖2。

圖2 2組結(jié)腸組織病理學(xué)比較

注：代表性HE染色(HE，×200)。NC，正常組；NM，隔藥灸組。(每組n=8)。

以上通過(guò)對(duì)體重和組織病理學(xué)觀察，我們發(fā)現(xiàn)隔藥灸天樞穴對(duì)大鼠的體重及結(jié)腸的組織病理學(xué)形態(tài)無(wú)明顯影響。

2.2 隔藥灸“天樞”穴對(duì)大鼠結(jié)腸組織基因表達(dá)譜的影響 每組取3只大鼠的結(jié)腸組織總RNA采用RNA-seq測(cè)序，觀察隔藥灸“天樞”穴對(duì)大鼠結(jié)腸組織基因表達(dá)譜的影響。與NC組比較，NM組的結(jié)腸組織差異表達(dá)基因有866個(gè)，其中上調(diào)604個(gè)，下調(diào)262個(gè)。見(jiàn)圖3。

采用Cluster3.0和Tree view軟件對(duì)差異表達(dá)的mRNAs聚類分析、熱圖，直觀的比較每組樣本之間均一性和組間的差異。2組共6個(gè)樣本采用hierarchical的聚類方法，分別分析上調(diào)和下調(diào)的差異表達(dá)基因，結(jié)果提示NC組和NM組各3個(gè)樣本的差異表達(dá)基因，均按組別聚類。見(jiàn)圖4、圖5；兩個(gè)熱圖中可見(jiàn)每組3個(gè)樣本的表達(dá)較為一致，2組之間有明顯的差異。見(jiàn)圖4、圖5，圖4為上調(diào)的差異表達(dá)基因的聚類分析、熱圖；圖5為下調(diào)的差異表達(dá)基因的聚類分析和熱圖。其中，差異表達(dá)基因的差異倍數(shù)大于10的基因有14個(gè)，Gbgt1(FC=62.11)、Klhl14(FC=35.63)、LOC102547612(FC=34.30)、LOC102552171(FC=17.72)、LOC102554698(FC=14.72)、Pnmt(FC=14.07)、LOC102548299(FC=13.71)、LOC103693435(FC=13.67)、Lgsn(FC=12.42)、LOC103694852(FC=11.66)、LOC102551762(FC=11.63)、Crtam(FC=11.60)、LOC102555917(FC=10.52)、LOC684998(FC=10.01)。差異表達(dá)基因的差異倍數(shù)小于0.01的基因有17個(gè)，Hist1h2aa、LOC100361543、LOC100362185、LOC102547455、LOC102552851、LOC102554579、LOC103691297、LOC103692050、LOC103693135、LOC103693516、LOC103693531、LOC103694465、LOC679565、LOC683573、Pabpc1l、Serpinb2、Slc25a21。其中Gbgt1上調(diào)了62.11倍，是變化最大的基因。

圖3 結(jié)腸組織差異表達(dá)基因的數(shù)目

2.3 隔藥灸“天樞”穴對(duì)大鼠結(jié)腸組織差異表達(dá)基因的GO和Pathway的影響 隔藥灸影響了NC大鼠結(jié)腸組織的mRNAs表達(dá)，GO分析結(jié)果提示，差異表達(dá)基因主要與MHC Ⅰ類蛋白復(fù)合物、MHC Ⅰb類蛋白復(fù)合物、細(xì)胞周期蛋白密切相關(guān)，其中上調(diào)的604個(gè)基因主要與MHC Ⅰ類蛋白復(fù)合物、MHC Ⅰb類蛋白復(fù)合物、細(xì)胞周期蛋白相關(guān)；下調(diào)的262個(gè)基因主要與細(xì)胞外的蛋白質(zhì)基質(zhì)、分泌顆粒相關(guān)。見(jiàn)圖6。Pathway分析提示，差異表達(dá)基因主要與免疫炎性反應(yīng)、類固醇和吞噬小體的作用關(guān)系密切。上調(diào)基因相關(guān)的通路有22個(gè)，其中主要與TNF-α信號(hào)通路、NOD樣受體信號(hào)傳導(dǎo)途徑、抗原提呈、Toll樣受體信號(hào)傳導(dǎo)途徑、P53信號(hào)通路、合成類固醇、吞噬小體相關(guān)；下調(diào)基因相關(guān)通路有4條，其中主要與花生四烯酸代謝、蛋白質(zhì)的消化與吸收和黏著相關(guān)。見(jiàn)圖7。

圖4 上調(diào)差異表達(dá)基因的聚類分析和熱圖

注：與NC組比較，NM組基因表達(dá)上調(diào)；NC，正常組；NM，正常+隔藥灸組。(每組n=3)。

圖5 下調(diào)差異表達(dá)基因的聚類分析和熱圖

注：與NC組比較，NM組基因表達(dá)下調(diào)；NC，正常組；NM，正常+隔藥灸組。(每組n=3)。

圖6 2組差異表達(dá)基因的GO分析

圖7 2組差異表達(dá)基因的Pathway分析

3 討論

炎癥性腸病發(fā)病率較高，每年的IBD預(yù)防保健費(fèi)用巨大[9]。目前研究結(jié)果表明，炎癥性腸病與機(jī)體內(nèi)環(huán)境——腸道微生物群的異常免疫應(yīng)答密切相關(guān)，樹(shù)突狀細(xì)胞存在調(diào)節(jié)Th1和Th17細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答[10]。國(guó)外學(xué)者Joos觀察到針灸對(duì)CD和UC均有較好的療效[11-12]；針灸具有抗炎調(diào)節(jié)免疫的作用已被證實(shí)[13]；研究者所在團(tuán)隊(duì)前期開(kāi)展了隔藥灸對(duì)CD和UC的臨床和實(shí)驗(yàn)研究，觀察到艾灸對(duì)IBD的良好效應(yīng)，該效應(yīng)可能與調(diào)節(jié)了結(jié)腸免疫炎性反應(yīng)因子有關(guān)[14-17]。基于前期研究的基礎(chǔ)，本研究采用RNA-seq高通量測(cè)序技術(shù)與方法，從轉(zhuǎn)錄組學(xué)的角度，探討艾灸“天樞”穴是否影響健康大鼠結(jié)腸組織全基因組表達(dá)。

艾灸健康大鼠“天樞”穴對(duì)體重及結(jié)腸組織形態(tài)的均無(wú)明顯影響，從組織病理學(xué)觀察未見(jiàn)充血、水腫和炎性反應(yīng)細(xì)胞浸潤(rùn)，表明艾灸不引起對(duì)健康大鼠結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)改變。然艾灸具有逆灸的保健作用，其機(jī)制尚未闡明。本實(shí)驗(yàn)從系統(tǒng)生物學(xué)轉(zhuǎn)錄組學(xué)的角度，觀察了艾灸對(duì)健康大鼠結(jié)腸組織的全基因組表達(dá)譜的影響。研究結(jié)果表明，艾灸能影響結(jié)腸組織的基因表達(dá)譜，既有上調(diào)也有基因下調(diào)的差異表達(dá)基因，總體上調(diào)基因數(shù)較下調(diào)的基因數(shù)多。采用GO和Pathway分析，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因所涉及的主要與細(xì)胞周期、機(jī)體免疫功能和蛋白質(zhì)代謝等密切相關(guān)。炎性反應(yīng)對(duì)機(jī)體感染和損傷的局部組織所呈現(xiàn)的反應(yīng)，是十分常見(jiàn)而又重要的基本病理過(guò)程，相關(guān)的免疫因子在結(jié)腸的免疫調(diào)節(jié)扮演重要角色。艾灸調(diào)節(jié)了多條免疫相關(guān)的通路：TNF-α信號(hào)通路、NOD樣受體信號(hào)傳導(dǎo)途徑、抗原提呈、Toll樣受體信號(hào)傳導(dǎo)途徑等。目前研究證實(shí)，針灸具有調(diào)節(jié)免疫發(fā)揮抑制炎性反應(yīng)的作用[13]，同時(shí)艾灸不僅能抑制結(jié)腸炎[18-20]，也能調(diào)節(jié)正常大鼠的免疫功能相關(guān)的因子，或可防止腸道炎性反應(yīng)。另外，隔藥灸調(diào)節(jié)了正常大鼠結(jié)腸組織P53信號(hào)通路，參與細(xì)胞周期、蛋白質(zhì)代謝，或可防止腸道的癌變[21]。

隔藥灸調(diào)節(jié)正常大鼠結(jié)腸組織全基因組表達(dá)譜，影響多條免疫信號(hào)通路，或可調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能，預(yù)防炎癥性腸病的發(fā)生。后續(xù)將進(jìn)一步觀察逆灸“天樞”穴對(duì)炎癥性腸病的防治作用，以及逆灸“天樞”穴在病理狀態(tài)的影響的作用機(jī)制，以期為逆灸的臨床應(yīng)用提供詳實(shí)的客觀依據(jù)。

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(2016-12-07收稿 責(zé)任編輯：洪志強(qiáng))

Genome-wide Gene Expressions under the Effect of Preventative Moxibustion at ST25 in Rats

Huang Yan1，Gu Muen2，Weng Zhijun1,Zhang Jianbin3, Shi Yin1,Ma Zhe1, Dou Chuanzi1,Liu Huirong1,2,Wu Huangan1,2,Wang Xiaomei1, Li Jing2

(1ShanghaiResearchInstituteofAcupunctureandMedian,ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai200030，China; 2DepartmentofAcupuncture,YueyangHospitalofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine,ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai200437,China; 3NanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing210023，China)

Objective:To investigate genome-wide gene expressions of preventative moxibustion at ST25 in healthy rats. Methods:A total of 16 male Sprague-Dawley rats were randomly divided into the normal group (NC) and the normal and herb-partitioned moxibustion group (NM). Starting from day 1, the NM group received herb-partitioned moxibustion at the Tianshu points (bilateral, ST25) for 7 days. On day 8, colon tissues were collected under anesthesia with 2% pentobarbital sodium. The effect of herb-partitioned moxibustion at the ST25 in rats was observed on the general conditions, body weights, and HE staining. Three samples from each group were selected for total RNA extraction. The gene expression profile in the colon tissues was analyzed by the RNA-seq combined with bioinformatics. Results:Compared with the NC group, herb-partitioned moxibustion did not take effect on weight and histopathological observation of the colon in healthy rats. The NM group had 866 differentially expressed genes in colon tissues compared to the NC group, of which 604 were up-regulated and 262 were down-regulated. KEGG pathway analysis indicated that these genes were involved in multiple pathways, including immunity and protein metabolism. Conclusion:Herb-partitioned moxibustion at ST25 alters genome-wide gene expressions in healthy rats, and affects the biological processes and pathways. The treatment can be used as a healthcare treatment against diseases.

Preventative moxibustion; Colon tissue; Gene expression profiling; Inflammatory bowel disease

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(”973”計(jì)劃)項(xiàng)目(編號(hào)：2009CB522900；2015CB554501)；國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目(編號(hào)：81503659);中國(guó)博士后科學(xué)基金面上項(xiàng)目(編號(hào)：2015M570380)；上海市針灸機(jī)制與穴位功能重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室資助(編號(hào)：14DZ2260500)；上海市重點(diǎn)學(xué)科資助項(xiàng)目(編號(hào)：S30304-A17)

王曉梅，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要研究方向：針灸胃腸疾病的臨床與基礎(chǔ)；李璟，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師，主要研究方向：針灸胃腸疾病的臨床與基礎(chǔ)研究

R245.81

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.12.010