肌源性干細(xì)胞研究進(jìn)展

牛麗麗畢力格巴圖牧仁肖瑞王憶霄姜麗麗溫建勛王秀娟邊艷超

1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)分子病理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;2.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)雜志社; 3.內(nèi)蒙古師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院

肌源性干細(xì)胞研究進(jìn)展

牛麗麗1畢力格巴圖2牧仁3肖瑞1王憶霄1姜麗麗1溫建勛1王秀娟1邊艷超1

1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)分子病理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;2.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)雜志社; 3.內(nèi)蒙古師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院

近年來，具有巨大臨床應(yīng)用潛能的成體干細(xì)胞已經(jīng)成為生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。肌源性干細(xì)胞具有強(qiáng)大的自我更新和多項(xiàng)分化潛能，能分化為神經(jīng)細(xì)胞、胰島細(xì)胞、成骨細(xì)胞等不同胚層的細(xì)胞，并能參與多種組織的損傷修復(fù)過程，在脊髓損傷修復(fù)及治療壓力性尿失禁中發(fā)揮巨大作用，因此，在基因治療和組織工程領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用前景。

肌源性干細(xì)胞 更新 分化 損傷修復(fù)

近年來，具有巨大臨床應(yīng)用潛能的成體干細(xì)胞已經(jīng)成為生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。肌源性干細(xì)胞（muscle-derived stem cells,MDSCs），是肌肉來源的多能干細(xì)胞的一個通稱，它的具體組分、不同組分之間的確切關(guān)系尚未確定，具有強(qiáng)大的自我更新和多項(xiàng)分化潛能，在適當(dāng)?shù)臈l件下不僅能分化為中胚層細(xì)胞類型，如：成肌細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和造血譜系，還可以打破胚層的限制分化為外胚層和內(nèi)胚層的細(xì)胞類型[1-2]，并參與多種組織的損傷修復(fù)過程，在基因治療和組織工程領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用前景。

一、肌源性干細(xì)胞的分離純化

1999年Jackson等[3]報(bào)道，利用Hoechst/流式細(xì)胞儀法從小鼠骨骼肌中分離到一群與衛(wèi)星細(xì)胞明顯不同的干細(xì)胞,這些細(xì)胞表達(dá)造血干細(xì)胞的表面標(biāo)志,能有效重建造血功能,說明這種具有分化多能性的肌源干細(xì)胞與肌肉干細(xì)胞或衛(wèi)星細(xì)胞是兩種不同的細(xì)胞。Gussoni E等在Nature雜志上也報(bào)道了用Hoechst/FACS方法純化MDSCs的方法，即3～5周齡小鼠骨骼肌中消化分離出的細(xì)胞，經(jīng)Hoechst33342染色，用FACS方法富集到MDSCs，移植到致死照射處理的小鼠體內(nèi)能有效重建造血系統(tǒng)。Lee等[4]（2000）、Jankowski等[5](2001)、Qu-Petersen等[6]（2002）用差速貼壁法從正常的骨骼肌中分離出三個細(xì)胞亞群：成纖維細(xì)胞很快在PP1和PP2培養(yǎng)板中貼壁，稱之為早期貼壁細(xì)胞群；PP3和PP4細(xì)胞貼壁稍慢，其主要成分為肌衛(wèi)星細(xì)胞，稱之為晚貼壁細(xì)胞群；PP5和PP6貼壁速度很慢，稱為慢貼壁細(xì)胞群，此細(xì)胞群為一種新的細(xì)胞群，其具有很高的分化潛能，稱之為肌源性干細(xì)胞。

國內(nèi)也有相關(guān)的報(bào)道，張金明等[7]（2006）采用差速貼壁分離技術(shù)，分別用Ⅺ型膠原酶、dispase蛋白酶及胰蛋白酶分步消化肌肉，得到了兔的MDSCs；遲猛等[8]（2008）采用消化法和差速貼壁法分離純化得到了人的MDSCs；韓穎等[9]（2008）使用膠原酶消化牛骨骼肌，然后采用差速貼壁分離技術(shù)純化獲得牛的MDSCs。

二、肌源性干細(xì)胞的表面標(biāo)志

干細(xì)胞表面特異性分子標(biāo)志，是區(qū)分不同干細(xì)胞的主要依據(jù)，肌源性干細(xì)胞的表面標(biāo)志已被初步認(rèn)識，但其結(jié)果具有很大差異，這些不同的結(jié)果可能是由于各實(shí)驗(yàn)室的條件、細(xì)胞分離培養(yǎng)方法及分析方法不同所造成。Lee[4-10]等通過免疫組化、PT-PCR和流式細(xì)胞術(shù)等方法分析MDSCs表達(dá)標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)肌源標(biāo)志Desmin、Bcl-2、C-met，和干細(xì)胞標(biāo)志Sca-1、CD34，但不表達(dá)C-kit、CD45。Torrente[11]等報(bào)道MDSCs雖然也表達(dá)Sca-1、CD34，但不表達(dá)Desmin。Zhuqing Qu[12]等發(fā)現(xiàn)60%的原代MDSCs不表達(dá)Desmin，而傳代培養(yǎng)時(shí)Desmin陽性細(xì)胞逐漸增加。我們注意到造血干細(xì)胞的表達(dá)標(biāo)志如Sca-1、CD34也在MDSCs表達(dá)，而有些肌細(xì)胞的標(biāo)記卻不被MDSCs表達(dá)，這種現(xiàn)象說明當(dāng)干細(xì)胞的全能性增加，其組織特異性標(biāo)志減少,而不同組織來源的干細(xì)胞共有的標(biāo)志增多。

pax7是一個促進(jìn)MDSCs向衛(wèi)星細(xì)胞分化的重要因子[13]。Olguin和Zammit等發(fā)現(xiàn)Pax7可以調(diào)節(jié)衛(wèi)星細(xì)胞的繁殖和自我更新[14-15],對衛(wèi)星細(xì)胞的功能起重要作用[16]。Pax7在MDSCs與衛(wèi)星細(xì)胞表達(dá)有所不同[17-18]，pax7-/-的小鼠中完全缺乏衛(wèi)星細(xì)胞而MDSCs數(shù)不受影響，說明MDSCs與衛(wèi)星細(xì)胞是兩種不同的細(xì)胞。

三、肌源性干細(xì)胞的分化潛能

MDSC具有多向分化潛能，在適當(dāng)?shù)臓I養(yǎng)素和生長因子的作用下能分化為不同胚層的細(xì)胞，如造血細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等。但MDSCs的分化機(jī)制尚不清楚，可能與細(xì)胞融合有關(guān)，因此也是目前研究的熱點(diǎn)。

1.MDSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化

睫狀神經(jīng)因子作為一種神經(jīng)營養(yǎng)因子，通過細(xì)胞表面的受體可以使得成肌細(xì)胞去分化而轉(zhuǎn)變?yōu)槎嗄芨杉?xì)胞；丹參也具有誘導(dǎo)多能干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化的功能，但具體機(jī)制尚不明確。曾祥一等（2009）應(yīng)用差速貼壁法和酶消化法獲得MDSCs后接種于6孔板內(nèi)，誘導(dǎo)組用含有睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子的DMED預(yù)誘導(dǎo)24h，更換培養(yǎng)液，洗滌3次，再加入含丹參注射液的無血清DMEM誘導(dǎo)5h；對照組使用無血清DMEM培養(yǎng)基處理。結(jié)果顯示誘導(dǎo)前MDSCs未見神經(jīng)絲蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)后的神經(jīng)元樣細(xì)胞神經(jīng)絲蛋白呈陽性表達(dá)；凝膠電泳及Western blot檢測結(jié)果顯示，與誘導(dǎo)前比較，誘導(dǎo)后對照組核因子kB抑制蛋白的表達(dá)無明顯變化，誘導(dǎo)組核因子kB抑制蛋白的表達(dá)明顯下降[19]。

李進(jìn)等[20]（2008）從成年SD大鼠骨骼肌組織中培養(yǎng)出肌源性干細(xì)胞，采用bFGF、EGF誘導(dǎo)出神經(jīng)球樣細(xì)胞團(tuán)，并檢測nestin免疫組化染色示強(qiáng)陽性。在再貼壁培養(yǎng)下，用RA、BDGF誘導(dǎo)分化，部分細(xì)胞表現(xiàn)出神經(jīng)元樣或膠質(zhì)細(xì)胞樣形態(tài)，并表達(dá)NSE、GFAP。為治療臂叢神經(jīng)根性撕脫傷及其它中樞神經(jīng)損傷提供了一種新方法。

2.MDSCs向胰島素分泌細(xì)胞分化

劉福強(qiáng)等用大鼠胰腺提取液（RPE）誘導(dǎo)MDSCs向胰島素分泌細(xì)胞分化，通過形態(tài)學(xué)觀察、雙硫腙（DTZ）染色、免疫細(xì)胞化學(xué)顯色、葡萄糖刺激實(shí)驗(yàn)和RT-PCR對誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)行體外結(jié)構(gòu)和功能鑒定，結(jié)果顯示RPE誘導(dǎo)后第5日有胰島樣結(jié)構(gòu)出現(xiàn)；免疫細(xì)胞化學(xué)顯示，誘導(dǎo)后第12日細(xì)胞團(tuán)表達(dá)胰島素、胰高血糖素，而未誘導(dǎo)組細(xì)胞不表達(dá)上述蛋白；RT-PCR結(jié)果表明，誘導(dǎo)后第6日檢測到PDX-1的表達(dá)，誘導(dǎo)后第12日檢測到胰島素1、胰島素2、胰高血糖素和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體2基因的表達(dá)。說明大鼠MDSCs可定向分化為胰島素分泌細(xì)胞[21]。

3.MDSCs向成骨細(xì)胞分化

肌肉中骨祖細(xì)胞的存在和MDSCs分化為成骨細(xì)胞的能力有效地促進(jìn)了骨的愈合。骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic proteins,BMPs）是TGF-β超家族的成員，廣泛分布于動物骨組織的酸性蛋白質(zhì)，在人類基因組中發(fā)現(xiàn)的BMP家族有20多個成員。BMP-2是已知的所有生長因子中對骨的形成最強(qiáng)的生長因子，對骨組織形成、生長和修復(fù)有促進(jìn)作用[22]。經(jīng)BMP-2誘導(dǎo)的人MDSCs形態(tài)發(fā)生顯著變化，出現(xiàn)了胞體肥大并呈圓形的細(xì)胞，這些肥大的圓形細(xì)胞經(jīng)檢測證實(shí)，其胞體內(nèi)有ALP、骨鈣素的表達(dá)，說明MDSCs能向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化，且隨著BMP-2劑量的增加，ALP、骨鈣素含量相應(yīng)增加[23]。Kuroda等[24]的研究表明由MDSCs的BMP-4的局部傳遞增強(qiáng)了小鼠的軟骨形成并促進(jìn)了關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)。Peng等[25]研究發(fā)現(xiàn)VEGF與BMP-4能協(xié)同作用促進(jìn)骨的愈合，但如果兩種因子的比例不當(dāng)，將對骨愈合產(chǎn)生有害的結(jié)果。W right等[26]用編碼BMP-4的反轉(zhuǎn)錄病毒體外轉(zhuǎn)染人MDSCs，移植到免疫力正常的小鼠后，成骨量少于SCID小鼠。Alden等[27]認(rèn)為，表達(dá)BMP-2的腺病毒轉(zhuǎn)染MDSCs異體移植成骨存在免疫反應(yīng)。避免或減輕免疫反應(yīng)，改進(jìn)并簡化MDSCs的分離和純化方法，過渡到自體細(xì)胞移植是尚待解決的重要問題。

四、肌源性干細(xì)胞在基因治療與組織工程中的應(yīng)用

1.在脊髓損傷修復(fù)中的應(yīng)用

常用于脊髓損傷修復(fù)的種子有胚胎神經(jīng)干細(xì)胞、嗅鞘細(xì)胞、骨髓基質(zhì)干細(xì)胞等，這些細(xì)胞移植至脊髓損傷區(qū)均能使損傷再生或修復(fù)，但都有其各自的缺點(diǎn)和不足。MDSCs具有誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞的潛能，并能向神經(jīng)干細(xì)胞一樣在中樞神經(jīng)組織里遷移和整合；自體移植又克服了倫理學(xué)爭議和排斥反應(yīng)等問題，是組織工程臨床用于脊髓損傷修復(fù)的理想種子細(xì)胞。

目前，干細(xì)胞移植治療脊髓損傷的機(jī)制尚不清楚，一般認(rèn)為：①干細(xì)胞在適合的環(huán)境條件下具有分化為神經(jīng)細(xì)胞的潛能，神經(jīng)細(xì)胞從結(jié)構(gòu)上修復(fù)脊髓損傷。②植入的干細(xì)胞與定居部位神經(jīng)組織間相互作用，并產(chǎn)生某些細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子不僅能促進(jìn)神經(jīng)功能的修復(fù)，也能保障植入干細(xì)胞的存活、增殖，并誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞向受損部位遷移。③干細(xì)胞本身也可以作為填充物填補(bǔ)損傷部位，定向再生為神經(jīng)細(xì)胞錨靠周圍組織完成上行下傳功能的重建，移植時(shí)創(chuàng)造抑制膠質(zhì)細(xì)胞再生、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞體存活、促進(jìn)自體神經(jīng)細(xì)胞再生的微環(huán)境。④干細(xì)胞具有向血管內(nèi)皮祖細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞方向分化的作用，有利于受損區(qū)神經(jīng)和血管組織的修復(fù)[28]。⑤減少損傷區(qū)的細(xì)胞凋亡。⑥抑制T細(xì)胞的增殖等[29-30]。

2.在治療壓力性尿失禁中的應(yīng)用

全世界約有20億人患有尿失禁，其嚴(yán)重影響了人們的生活質(zhì)量。壓力性尿失禁是尿失禁中最常見的一種類型，且發(fā)病率越來越高[31]。發(fā)生壓力性尿失禁的機(jī)制主要是尿道括約肌結(jié)構(gòu)及功能缺陷和膀胱頸支撐功能障礙。傳統(tǒng)的治療方法只能取得短期的療效，不能從本質(zhì)上糾正成肌功能障礙，而且還會引起慢性炎癥反應(yīng)，尿道周圍膿腫、糜爛，及尿道阻塞而引起尿潴留，內(nèi)臟器官偏移和肺栓塞等不良反應(yīng)[32]。

目前，治療壓力性尿失禁的最新方法就是應(yīng)用干細(xì)胞移植技術(shù)。在干細(xì)胞移植術(shù)中，所應(yīng)用的干細(xì)胞必須具有較強(qiáng)的增殖能力。MDSCs是肌肉內(nèi)高度未分化的多潛能干細(xì)胞，增殖快、融合慢、分化能力強(qiáng)存活率高等優(yōu)點(diǎn)，是治療壓力性尿失禁的一種理想的種子細(xì)胞。

Atalad等[33]最早報(bào)道了在一豬模型應(yīng)用培養(yǎng)的自體軟骨細(xì)胞治療壓力性尿失禁，他們還研究了使用人膀胱平滑肌細(xì)胞和尿道細(xì)胞在生殖泌尿重建中作組織替代[34]。Lee JY等[35]報(bào)道在一尿失禁模型注射肌肉干細(xì)胞和膠原，在注射后第四周肌肉干細(xì)胞和膠原具有相似的改善LPP和逼尿肌壓力的作用，但在移植后12周，膠原的作用明顯減弱而肌肉干細(xì)胞的作用持續(xù)。Peyromaur M等[36]研究了正常大鼠尿道肌源性細(xì)胞移植的存活和分化，發(fā)現(xiàn)移植后細(xì)胞可長期存在和分化。研究表明用人的肌源性干細(xì)胞治療婦女的壓力性尿失禁，與傳統(tǒng)的治療方法相比較取得了良好治療效果，但其具體的細(xì)胞移植數(shù)量和試驗(yàn)中存在的隨機(jī)性還有待進(jìn)一步研究[37]。

五、展望

近年來，隨著高新技術(shù)的發(fā)展、分子生物學(xué)的應(yīng)用和學(xué)科間的相互滲透，使基因治療和組織工程修復(fù)等的研究獲得了迅猛發(fā)展，特別是成體干細(xì)胞在組織修復(fù)中的應(yīng)用得到高度重視。肌源性干細(xì)胞取自自體，具有較強(qiáng)的自我更新能力和高度的可塑性，且不需要免疫抑制劑，也不存在倫理問題，因此在臨床上具有廣泛的應(yīng)用前景。

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