VEGF和突變型p53在胃癌組織表達(dá)及意義①

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(青島醫(yī)學(xué)院附屬威海醫(yī)院威海市立二院消化內(nèi)科，威海264200)

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VEGF和突變型p53在胃癌組織表達(dá)及意義①

穆桂芳穆雪峰②畢海靜曲玲譚悅菊孫光喜董祟海白厚橋高才華周利克陳文軍

(青島醫(yī)學(xué)院附屬威海醫(yī)院威海市立二院消化內(nèi)科，威海264200)

[摘要]目的：通過檢測(cè)胃癌及癌前病變患者活檢組織中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和突變型p53基因(mtp53)的表達(dá)，探討VEGF和突變型p53基因在胃癌發(fā)生發(fā)展中的臨床意義。方法：通過胃鏡組織活檢收集 19例正常胃組織、22例腸上皮化生、47例胃腸黏膜不典型增生、54例胃癌樣本，通過免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)組織中VEGF和mtp53的表達(dá)水平。結(jié)果：VEGF、mtp53的表達(dá)水平在正常胃組織，腸上皮化生，不典型增生以及胃癌中呈逐漸增高的規(guī)律。胃癌組織中VEGF和mtp53表達(dá)較正常胃組織、腸上皮化生組織顯著增高(P<0.05)，而與不典型增生組織差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論：VEGF與突變型p53的異常表達(dá)可能與胃組織病變的惡化程度有關(guān)。

胃癌是人類消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著人類的健康。但由于胃癌早期癥狀并不特異，發(fā)現(xiàn)時(shí)多是中晚期而延誤治療。因此，如何對(duì)胃癌進(jìn)行早期診斷成為該領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。目前研究表明，突變型 p53(mtp53)在胃癌組織中表達(dá)上調(diào)，并可通過促進(jìn)血管生成因子(如血管內(nèi)皮生長因子VEGF)的表達(dá)，介導(dǎo)胃部腫瘤細(xì)胞的進(jìn)一步生長、轉(zhuǎn)移等[1]。但一直缺乏關(guān)于mtp53和VEGF在胃癌癌前病變中表達(dá)水平的相關(guān)研究。本研究通過檢測(cè)和對(duì)比胃癌及癌前病變患者中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、突變型p53基因的表達(dá)水平，分析VEGF、突變型p53基因在胃癌生發(fā)發(fā)展中的臨床意義，旨在為胃癌的早期診斷與治療提供新思路。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對(duì)象和樣本收集選擇2010年 6月至 2014 年 6月在威海市立二院行胃鏡檢查的患者142例為研究對(duì)象，其中包括19例正常胃組織、22例腸上皮化生、47例胃腸黏膜不典型增生、54例胃癌。收集所有研究對(duì)象的胃組織樣本，石蠟包埋備用。

1.1.2試劑兔抗人VEGF 多克隆抗體、鼠抗人 mtp53 單克隆抗體(美國Abcam公司)。免疫組化檢測(cè)試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.2方法

1.2.1免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)VEGF和mtp53表達(dá)本研究采用免疫組化 PV-9000 二步法。具體實(shí)驗(yàn)步驟為：石蠟切片常規(guī)水化，以3%去離子水水浴10 min阻斷內(nèi)源性過氧化物酶反應(yīng)。蒸餾水沖洗3遍，每次3 min，PBS浸泡5 min后，將切片浸入 0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液中，微波爐中火加熱5 min，然后小火加熱10 min，冷卻后PBS洗5 min×3次。滴加一抗，4 ℃過夜。PBS 洗 5 min×3 次，滴加試劑 1，37℃孵育15 min，取出后PBS洗5 min×3次。滴加試劑 2，37℃孵育15 min，取出后PBS洗5 min× 3 次。新鮮配制的DAB 顯色，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間，自來水終止反應(yīng)。蘇木素輕度復(fù)染，鹽酸乙醇分化，自來水泛藍(lán)沖洗5 min。脫水、透明，中性樹膠封片后，顯微鏡觀察。PBS代替一抗作為陰性對(duì)照組。

1.2.2結(jié)果判定由兩名未參與實(shí)驗(yàn)的高年資病理科醫(yī)生獨(dú)立觀察切片，協(xié)助判斷免疫組化結(jié)果。VEGF 定位于腫瘤細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜，陽性物質(zhì)呈棕黃色；mtp53定位于腫瘤細(xì)胞核，陽性物質(zhì)呈棕黃色。p53、VEGF陽性細(xì)胞數(shù)>10%為陽性，<10%為陰性；同時(shí)，VEGF陽性細(xì)胞數(shù)分級(jí):10%~25%為+，26%~50%為++，>50%為+++。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)錄入Excel表格，采用SPSS17.0行χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1研究對(duì)象對(duì)各組受試者的性別、年齡進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示各組人群的性別和年齡差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明各組人群匹配，具有可比性。

2.2VEGF、p53 在胃癌組織中的表達(dá)對(duì)各組受試者的p53和VEGF的表達(dá)情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示VEGF、mtp53的表達(dá)水平在正常胃組織，腸上皮化生，不典型增生以及胃癌中呈逐漸增高的規(guī)律。胃癌組織中VEGF和mtp53表達(dá)較正常胃組織、腸上皮化生組織顯著增高(P<0.05)，如圖1、2，而與不典型增生組織差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1不同胃組織中VEGF、p53表達(dá)情況比較[n(%)]

Tab.1Expression of p53 and VEGF indifferent gastric tissues[n(%)]

GroupVEGFpositiveexpressionratep53positiveexpressionrateNormalgastrictissue(n=19)0.2%1.3%Intestinalmetaplasia(n=22)17.3%1)3)16.5%1)Dysplasiaofgastricmucosa(n=47)22.1%1)38.7%1)Gastriccancertissue(n=54)50.6%1)2)3)62.3%1)2)3)

Note：1)P<0.05，compared with normal gastric tissue group;2)P<0.05，compared with intestinal metaplasia group;3)P<0.05 compared with gastric mucosa dysplasia group.

圖1　VEGF在胃癌組織中的表達(dá)(×40)Fig.1　Expression of VEGF in gastric cancer and dys-plasia(×40)

圖2　p53在胃癌組織中的表達(dá)(×40)Fig.2　Expression of p53 in gastric cancer and dysplasia(×40)

3討論

迄今為止，人類腫瘤相關(guān)性最高的基因?yàn)閜53基因，p53基因與腫瘤細(xì)胞生長、凋亡等都有著密切的關(guān)系[2]。人類惡性腫瘤中，至少有50%患者與p53基因突變有關(guān)，p53基因適度表達(dá)是細(xì)胞正常生長發(fā)育的基礎(chǔ)[3]。VEGF是一類可致血管生長特異分裂的誘導(dǎo)因，參與腫瘤血管形成的重要因素之一，可通過調(diào)節(jié)血管和淋巴管生成，增加血管通透性，導(dǎo)致腫瘤生長、侵襲、轉(zhuǎn)移，同時(shí)，腫瘤快速生長又會(huì)導(dǎo)致機(jī)體生成更多VEGF[4]。p53基因是胃癌中最常出現(xiàn)突變的抑癌基因，其點(diǎn)突變和過表達(dá)可存在于胃癌各臨床分期之中。國外已有研究發(fā)現(xiàn)，p53基因作用于胃癌進(jìn)展階段，在腸化生和異型增生階段也有較高的檢出率[5]。腫瘤病理形成中，本研究顯示，在54例胃癌中，p53蛋白陽性表達(dá)率為62.3%，與國內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相近[6，7]。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從正常胃黏膜，腸上皮化生，胃黏膜不典型增生至胃癌，突變型p53和VEGF表達(dá)呈逐漸上升的趨勢(shì)，其中不典型增生組與胃癌組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而正常組和腸上皮化生組與胃癌組差異顯著，表明突變型p53基因和VEGF陽性表達(dá)在胃癌及癌前病變中廣泛存在，在胃黏膜不典

型增生中表達(dá)已接近胃癌。同時(shí)，表1中的數(shù)據(jù)還顯示：VEGF陽性表達(dá)率和突變型P53的陽性表達(dá)率在腸上皮化生階段明顯增加，突變型P53在腸上皮化生組的陽性細(xì)胞比正常對(duì)照增加近15%，而胃黏膜不典型組比腸上皮化生組增加近22%，胃癌組比胃黏膜不典型增生組增加近24%，這些數(shù)據(jù)提示mtP53基因在不典型增生組中明顯增加，而VEGF陽性細(xì)胞的表達(dá)的增加值的改變最高值則出現(xiàn)在胃癌組織，提示VEGF在胃癌組織中的表達(dá)高峰期可能在一定程度上滯后于突變型P53基因的表達(dá)，而這一結(jié)論還需要大量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)論證。

檢測(cè)突變型p53表達(dá)和VEGF有助于對(duì)胃黏膜癌前病變進(jìn)展的監(jiān)測(cè)。在胃癌及癌前病變中進(jìn)行p53表達(dá)和VEGF的聯(lián)合檢測(cè)，能為胃癌的早期篩查、診斷提供一定的幫助[8-11]。

參考文獻(xiàn)：

[1]Gao L,Cheng W,Zhu XG,etal.VEGF somatostatin in gastric cancer SGC-7901 cells,the influence of the NF-kappa B expression[J].J Suzhou Univ(Medical Edition),2010，(3):483-486.

[2]Liu J，Zhang C，Hu WW，etal.Tumor suppressor p53 and its mutants in cancer metabolism[J].Cancer Letters,2015，(356)：197-203.

[3]Samudio IJ,Duvvuri S,Dwyer Clise-K,etal.Activation p53signaling by MI-63 induces apoptosis in acute myeloid leukemia cells[J].Leuk diagnosed with lymphoma,2010,51(5):911-919.

[4]榮曉云，王言奎.宮頸癌及癌前病變組織Fox-M1與VEGF表達(dá)及相關(guān)性[J].齊魯醫(yī)學(xué)雜志，2011,26(4):471-473.

[5]Kathleen Saavedra，José Valbuena，Wilda Olivares1，etal.Loss of expression of reprimo,a p53-induced cell cycle arrest gene,correlates with invasive stage of tumor progression and p73 expression in gastric cancer[J] Plos One，2015，Doi.10.1371/journal.pone.0125834.

[6]俞繼衛(wèi)， 姜波健， 倪曉春，等.聯(lián)合評(píng)估survivin 與p53在胃癌組織中表達(dá)的臨床意義及對(duì)預(yù)后的影響[J].國際外科學(xué)雜志,2007,34(2):156-160 .

[7]王曉龍，張成武，劉寧，等.P53基因Arg72Pro單核苷酸多態(tài)性與青海地區(qū)人群胃癌易感性的相關(guān)性分析[J].中國免疫學(xué)雜志，2014，30(2)：178-181.

[8]Bilgi CI,Tez M.Serum VEGF levels in gastric cancer patients:correlation with clinicopathological parameters[J].Turk J Med Sci,2015，45(1):112-117.

[9]Chavez-Perez VA,Strasberg-Rieber M,Rieber M.Metabolic utilization of xogenous pyruvate by mutant p53(R175H)human melanoma cells promotes survival under glucose depletion[J].Cancer Biol Therapy，2011，12(7)： 647-656.

[10]Wei Zhe-Wei,Xia Guang-Kai,Wu Ying,etal.a CXCL1 promotes tumor growth through VEGF pathway activation and is associated with inferior survival in gastric cancer[J] Cancer Letters，2015，(359):335-343.

[11]Aguilera KY,Rivera LB,Hur H,etal.Collagen signaling enhances tumor progression after anti-VEGF therapy in a murine model of pancreatic ductal adenocarcinoma[J].Cancer Res,2014，(74):1032-1044.

[收稿2015-01-25修回2015-06-01]

(編輯許四平)

[關(guān)鍵詞]VEGF；突變型p53；胃癌；癌前病變

VEGF and mutant p53 expression in gastric carcinoma and significance

MUGui-Fang,MUXue-Feng,BIHai-Jing,QULing，TANYue-Ju，SUNGuang-Xi,DONGSui-Hai,BAIHou-Qiao,GAOCai-Hua,ZHOULi-Ke,CHENWen-Jun.WeihaiMunicipalHospitalofWeihaiHospitalAffiliatedtoQingdaoMedicalCollege,Weihai264200,China

[Abstract]Objective:To detect precancerous lesions of gastric cancer and biopsy tissue vascular endothelial growth factor(VEGF)and mutant p53 gene(mtp53)expression,to explore the development of clinical significance of VEGF and mutant p53 gene in gastric cancer.Methods: 19 cases by endoscopic biopsies of normal gastric tissues,22 cases of intestinal metaplasia,47 cases of gastrointestinal mucosal dysplasia,54 cases of gastric cancer samples by immunohistochemical staining to detect the expression levels of VEGF and mtp53′s.Results: The expression levels of VEGF,mtp53 in normal gastric mucosa,intestinal metaplasia,dysplasia,and gradually increased gastric cancer was the law.mtp53 of VEGF expression in gastric carcinoma and compared with normal gastric tissue,intestinal metaplasia was significantly higher(P<0.05),but with atypical hyperplasia was no significant difference(P> 0.05).Conclusion: The abnormal expression of VEGF and mutant p53 may be related to the degree of deterioration of the stomach tissue lesions related.

[Key words]VEGF;Mutant p53;Gastric cancer;Precancerous lesions

作者簡介：穆桂芳(1967年-)，女，主治醫(yī)師，主要從事消化系統(tǒng)腫瘤相關(guān)研究。

中圖分類號(hào)R573.9
①本文為胃癌組織中VEGF及突變型p53基因表達(dá)及臨床意義研究(No.2012GNS042-1)項(xiàng)目。
②深圳市南山區(qū)人民醫(yī)院(深圳第六人民醫(yī)院)消化科，深圳518067。

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1000-484X(2016)01-0090-03

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.01.019