冰片聯(lián)合燈盞花素對缺氧/復(fù)氧損傷血腦屏障通透性的影響

徐露　張?zhí)?/p>

摘要：目的 觀察冰片聯(lián)合燈盞花素對缺氧/復(fù)氧下血腦屏障（BBB）通透性的影響，探討其保護(hù)BBB的作用機(jī)制。方法 培養(yǎng)原代大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（BMEC），在缺氧培養(yǎng)箱中缺氧2 h，再復(fù)氧24 h，建立單層BMEC體外BBB模型。實(shí)驗(yàn)分為正常對照組、模型組、冰片組、燈盞花素組、冰片+燈盞花素組，各給藥組給予相應(yīng)藥物干預(yù)，檢測各組跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻（TEER）值和辣根過氧化物酶（HRP）的通透性，ELISA、Western blot檢測BMEC中緊密連接蛋白ZO-1及Claudin-5蛋白表達(dá)。結(jié)果 缺氧/復(fù)氧損傷導(dǎo)致TEER值降低，HRP通透率增加，ZO-1及Claudin-5蛋白表達(dá)降低；冰片聯(lián)合燈盞花素可明顯改善上述損傷。結(jié)論 冰片聯(lián)合燈盞花素對缺氧/復(fù)氧下BBB的損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與上調(diào)ZO-1、Claudin-5蛋白表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：冰片；燈盞花素；血腦屏障；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.02.021

中圖分類號：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2016）02-0076-03

Effects of Borneolum Syntheticum Combined with Breviscapine on Blood-brain Barrier Permeability Induced by Hypoxia/Reoxygenation Injury XU Lu1， ZHANG Tai-jun2 （1. Key Lab of Biochemical and Molecular Pharmacology， Chongqing Medical University， Chongqing 400016， China； 2. Chongqing City Hospital of Traditional Chinese Medicine， Chongqing 400021， China）

Abstract： Objective To observe effects of Borneolum Syntheticum combined with breviscapine on blood-brain barrier （BBB） permeability induced by hypoxia/reoxygenation injury. Methods The BBB model in vitro was established by primarily culturing brain microvascular endothelial cells （BMEC）， hypoxia 2 h and reoxygenation 24 h. The experiment was divided into normal control group， model group， Borneolum Syntheticum group， breviscapine group， and Borneolum Syntheticum-breviscapine group. All treatment groups were given relevant medicine. TEER and HRP were detected； ELISA and Western blot was used to detect the expressions of ZO-1 and Claudin-5 in BMEC. Results Hypoxia/reoxygenation induced injury decreased TEER， increased permeability rate of HRP， and decreased the expressions of ZO-1 and Claudin-5； while Borneolum Syntheticum combined with breviscapine could improve damage caused by hypoxia/reoxygenation. Conclusion Borneolum Syntheticum combined with breviscapine shows obvious protective effect on BBB permeability induced by hypoxia/reoxygenation， and the mechanism is involved in the regulation of ZO-1 and Claudin-5 protein expressions.

Key words： Borneolum Syntheticum； breviscapine； blood-brain barrier； rats

血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）是人體的一道重要生理屏障，主要作用是阻止某些有害物質(zhì)進(jìn)入腦組織，同時(shí)促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入腦組織，BBB在保持腦組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定方面起積極的作用。腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（brain microvascular endothelial cells，BMEC）是BBB的重要組成部分，其特殊的細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)和細(xì)胞間緊密連接，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)血管內(nèi)外物質(zhì)交換中起重要的作用。然而當(dāng)腦組織受到炎癥侵襲、缺

基金項(xiàng)目：重慶市自然科學(xué)基金（cstc2012jjA10137）

通訊作者：張?zhí)珽-mail：4345422@qq.com

血、缺氧損傷時(shí)，BMEC及其緊密連接的完整性遭到破壞，使BBB通透性增高，大量有害物質(zhì)進(jìn)入腦組織后加重腦神經(jīng)血管損傷。

燈盞花素是臨床常用的腦保護(hù)劑，能改善腦微循環(huán)、減輕腦組織損傷[1]。但燈盞花素水溶性較高，難以通過BBB，如能在腦組織中提高其藥物濃度，療效會更為明顯。冰片是一種芳香開竅藥物，有研究表明，冰片能抑制P-糖蛋白，協(xié)助其他難通過BBB的藥物進(jìn)入BBB[2]。本實(shí)驗(yàn)將冰片和燈盞花素聯(lián)合用藥，觀察其對缺氧/復(fù)氧下BBB通透性的影響，探討其保護(hù)BBB的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動物

SPF級7日齡SD大鼠6只，體質(zhì)量（30±5）g，雌雄不限，重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，許可證號XCXK（渝）20090006，封閉且無菌條件下飼養(yǎng)。

1.2 藥物

燈盞花素（20 mg/支），湖南恒生制藥有限公司，純度≥95%，批號20131012，用生理鹽水配制成1 mg/mL溶液備用；天然冰片，河南萬博化工產(chǎn)品有限公司，純度95%，批號A130916，用0.8%羧甲基纖維素鈉配制成0.5 mg/mL混懸液備用。

1.3 主要試劑與儀器

辣根過氧化物酶（HRP），Sigma公司；ELISA試劑盒、Western blot試劑盒、組織蛋白提取試劑、兔抗ZO-1單克隆抗體和小鼠抗Claudin-5單克隆抗體，Santa Cruz公司。Bio-Red酶標(biāo)儀（美國Gene公司），跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻（TEER）儀（美國Millipore公司），凝膠成像系統(tǒng)（美國Thermo公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)

參考文獻(xiàn)[3]，將SD大鼠脫頸處死，75%酒精浸泡3～5 min進(jìn)行消毒?？焖偃〕鋈X，置于預(yù)冷的D-Hank's液中，去除小腦、間腦、血管、腦膜等，保留皮質(zhì)。用眼科剪將腦組織剪成約1 mm3碎片，再加0.7 mg/mLⅡ型膠原酶，37 ℃消化1 h，1000×g離心10 min，棄上清液，加20%BSA，1000×g離心20 min，保留底層沉淀。再加1 mg/mL膠原酶/分散酶，37 ℃消化1 h，700×g離心6 min，棄上清液，DMEM液漂洗2次，棄上清液，加DMEM培養(yǎng)液（20%胎牛血清FBS、2 mmol/L L-谷氨酸、30 ?g/mL內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、100 ?g/mL肝素鈉）后，接種于75 cm2培養(yǎng)瓶中，2 d后換液，單層BMEC長成后融合70%～80%時(shí)傳代。用消化液（0.25%胰酶和0.02%EDTA組成）消化，消化終止后用巴氏管輕輕吹打成細(xì)胞懸液，1000×g離心5 min，棄上清液，加DMEM培養(yǎng)液，接種于培養(yǎng)板中。

2.2 分組、造模及給藥

將培養(yǎng)的BMEC密度調(diào)至4×105/mL，吸取0.5 mL接種于Transwell板上，多聚酯細(xì)胞膜的細(xì)胞密度約為2×105/cm2，向Transwell板加1.5 mL完全培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，2 d換液1次。待細(xì)胞融合時(shí)分為5組：正常對照組Transwell板全程正常孵育；模型組置于缺氧培養(yǎng)箱中2 h，再迅速置于正常培養(yǎng)箱中24 h；冰片組根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)及文獻(xiàn)[4]，置于正常培養(yǎng)箱時(shí)加冰片使其終濃度為5 ?mol/L；燈盞花素組根據(jù)前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)，置于正常培養(yǎng)箱時(shí)加燈盞花素使其終濃度為10 ?mol/L；冰片+燈盞花素組置于正常培養(yǎng)箱時(shí)加冰片和燈盞花素使其終濃度分別為5 ?mol/L和10 ?mol/L。

2.3 跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻值測定

待BMEC達(dá)到融合狀態(tài)后，將電阻儀電極插入Transwell小室中，計(jì)算TEER值[（測得電阻值-基礎(chǔ)電阻值）÷小室膜面積]，測量每組復(fù)氧24 h時(shí)TEER值。

2.4 辣根過氧化物酶通透率測定

棄Transell板內(nèi)培養(yǎng)基，在供體池中加含有500 ng HRP培養(yǎng)基，在受體池中加1150 ?L相同培養(yǎng)基，使Transwell內(nèi)外液面相平，于復(fù)氧后24 h從受體池中取樣50 ?L，向樣品中各加50 ?L四甲基聯(lián)苯胺溶液和H2O2，顯色10 min，加1 mol/L H2SO4 50 ?L終止反應(yīng)，于酶標(biāo)儀450 nm處測定吸光度（A）值。另將10 ng/mL HRP溶液用無血清DMEM培養(yǎng)基等比稀釋，按上述方法顯色并測定A值，計(jì)算HRP通透率[（CHRP受體池×V受體池）÷（CHRP供體池×V供體池）×100%][5]。

2.5 ELISA檢測ZO-1及Claudin-5蛋白表達(dá)

嚴(yán)格按照ZO-1及Claudin-5 ELISA試劑盒說明方法進(jìn)行操作，于酶標(biāo)儀450 nm處測定各組A值。

2.6 Western blot檢測ZO-1及Claudin-5蛋白表達(dá)

棄Transell板內(nèi)培養(yǎng)基，用預(yù)冷濃度為0.01 mol/L 的PBS沖洗3次，加冰的裂解液，0 ℃放置30 min，再將細(xì)胞刮掉，離心后棄上清液，得到總蛋白。嚴(yán)格按照試劑盒說明操作，檢測ZO-1及Claudin-5蛋白表達(dá)情況，所得條帶用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行光密度掃描。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以—x±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 冰片聯(lián)合燈盞花素對大鼠跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻值和辣根過氧化物酶通透率的影響

缺氧/復(fù)氧損傷可顯著降低BBB的TEER值，增加HRP通透率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與模型組比較，冰片組TEER值和HRP通透率均無明顯差異（P>0.05），燈盞花素組和冰片+燈盞花素組TEER值明顯升高，HRP通透率明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），其中以冰片+燈盞花素組效果更為顯著。結(jié)果見表1。

4.2 冰片聯(lián)合燈盞花素對大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞ZO-1及Claudin-5蛋白表達(dá)的影響

與正常對照組比較，缺氧/復(fù)氧損傷后ZO-1及Claudin-5蛋白表達(dá)均顯著降低（P<0.01）；冰片組、燈盞花素組、冰片+燈盞花素組均能顯著上調(diào)ZO-1及Claudin-5蛋白表達(dá)（P<0.01），冰片+燈盞花素組作用更為顯著。結(jié)果見表2、表3、圖1。

5 討論

BMEC作為BBB形成的主要結(jié)構(gòu)，它們之間形成的緊密連接是BBB主要的物質(zhì)基礎(chǔ)。當(dāng)緊密連接蛋白的表達(dá)量、位置分布或結(jié)構(gòu)功能等發(fā)生改變時(shí)，BMEC及其緊密連接的完整性遭到破壞，從而使BBB通透性增高，大量有害物質(zhì)進(jìn)入腦組織后加重腦神經(jīng)血管損傷。作為與緊密連接密切相關(guān)的關(guān)鍵蛋白ZO-1和Claudin-5蛋白更起著非常重要的作用。有研究表明，ZO-1缺失將會導(dǎo)致緊密連接結(jié)構(gòu)遭到破壞[6]；Claudin-5表達(dá)下降也已被證明與血管通透性增加密切相關(guān)[7]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，單獨(dú)使用冰片，其TEER值和HRP通透率與模型組比較并無顯著差異，單用燈盞花素和冰片聯(lián)合燈盞花素均可明顯增加TEER值和降低HRP通透率，維持BBB的完整性，但冰片聯(lián)合燈盞花素效果更為明顯。ELISA和Western blot檢測結(jié)果也顯示，燈盞花素和冰片聯(lián)合燈盞花素均可明顯促進(jìn)ZO-1和Claudin-5蛋白的表達(dá)。

綜上所述，冰片聯(lián)合燈盞花素對缺氧/復(fù)氧損傷BBB具有明顯的保護(hù)作用，且與單用燈盞花素比較，聯(lián)合用藥可明顯增強(qiáng)藥理效應(yīng)，根據(jù)Western blot、ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果雙重提示，其作用機(jī)制可能為上調(diào)ZO-1和Claudin-5蛋白的表達(dá)，維持BMEC及其緊密連接的完整性。

參考文獻(xiàn)：

[1] 唐省三，馬亞珍.燈盞花素注射液對大鼠腦缺血再灌注局灶性腦損傷的保護(hù)作用[J].中國臨床康復(fù)，2005，9（29）：243-245.

[2] 朱國棟.冰片開放血腦屏障及通過P糖蛋白介導(dǎo)的機(jī)制研究[D].廣州：廣州醫(yī)學(xué)院，2009.

[3] 郭虹，康立源，柴麗娟，等.燈盞細(xì)辛總咖啡酸酯對TNF-α誘導(dǎo)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1表達(dá)的影響[J].遼寧中醫(yī)雜志，2009，36（9）：1554- 1556.

[4] 胡利民.冰片及配伍對血腦屏障通透性的影響和腦保護(hù)作用機(jī)制研究[D].天津：天津中醫(yī)學(xué)院，2004.

[5] 李江輝，潘長旺，胡昕，等.血腦屏障細(xì)胞模型的構(gòu)建[J].中國病原生物學(xué)雜志，2008，12（3）：894-896.

[6] YU H， WANG P， AN P， et al. Recombinant human angiopoietin-1 ameliorates the expressions of ZO-1， occludin， VE-cadherin， and PKCa signaling after focal cerebral ischemia/reperfusion in rats[J]. J Mol Neurosci，2012，46（1）：236-247.

[7] KIM J， CHAE Y K. Geomewide association studies of stroke[J].N Engl Med，2009，361（7）：722-723.

（收稿日期：2015-05-14）

（修回日期：2015-06-10；編輯：華強(qiáng)）