食品中丙烯酰胺的測(cè)定及其含量控制方法

◎ 石聲鑫

（汕頭市質(zhì)量計(jì)量監(jiān)督檢測(cè)所，廣東 汕頭 515041）

食品中丙烯酰胺的測(cè)定及其含量控制方法

◎ 石聲鑫

（汕頭市質(zhì)量計(jì)量監(jiān)督檢測(cè)所，廣東 汕頭 515041）

建立一種準(zhǔn)確、方便的檢測(cè)食品中丙烯酰胺含量的高效液相色譜分析方法。樣品中的丙烯酰胺經(jīng)丙酮提取后，以甲醇-水溶液（5∶95）為流動(dòng)相，C18色譜柱分離，二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，外標(biāo)法定量。結(jié)果顯示，方法線(xiàn)性良好，檢出限為5 ng/g，RSD為0.53%～2.10%，回收率為86.3%～101.5%。運(yùn)用該檢測(cè)方法，進(jìn)一步探索減少食品中丙烯酰胺產(chǎn)生的措施，結(jié)果表明，將薯?xiàng)l油炸溫度降到180 ℃和在其原料中添加VC、纖維素可有效控制丙烯酰胺的產(chǎn)生，其中添加纖維素的效果明顯。

高效液相色譜；丙烯酰胺；食品；控制

丙烯酰胺是一種水溶性的塑膠單體化合物，是生產(chǎn)聚丙烯酰胺的原料。自2002年我國(guó)在油炸和燒烤的淀粉類(lèi)食品首次檢出丙烯酰胺，其他國(guó)家也相繼報(bào)道類(lèi)似結(jié)果[1,2]。目前，大部分學(xué)者認(rèn)為丙烯酰胺的生成是天冬酰胺或谷氨酸等相似結(jié)構(gòu)的氨基酸及葡萄糖等經(jīng)過(guò)高溫加熱所致。丙烯酰胺具有潛在的致癌性、神經(jīng)毒性、遺傳毒性和生殖毒性[3,4]，人體可通過(guò)消化道、呼吸道、皮膚黏膜等多種途徑接觸丙烯酰胺，在人體內(nèi)，丙烯酰胺生成活性環(huán)氧丙酰胺，這種物質(zhì)容易與DNA結(jié)合，形成絡(luò)合物，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)遺傳物質(zhì)損傷和基因突變。

丙烯酰胺的毒性引起全球研究人員的極大關(guān)注。①關(guān)于食品中丙烯酰胺含量的分析方法的研究。目前，食品中丙烯酰胺的檢測(cè)，國(guó)際上使用最多的方法有GC-MS法、LC-MS法、LC-MS-MS法等。我國(guó)制定的食品中丙烯酰胺檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)有兩部[5,6]。大部分分析方法均需要經(jīng)過(guò)樣品脫脂凈化，加入同位素標(biāo)記的丙烯酰胺作為內(nèi)標(biāo)，樣品溴化衍生等步驟，過(guò)程繁瑣，被測(cè)組分在前處理過(guò)程損失較大，回收率低且測(cè)定誤差較大。②關(guān)于食品中丙烯酰胺含量控制的研究。我國(guó)是以糧谷類(lèi)食物為主的國(guó)家，因此，建立食品中丙烯酰胺的快速準(zhǔn)確檢測(cè)技術(shù)，探索其減少措施具有積極的現(xiàn)實(shí)意義。本課題擬采用HPLC-DAD研究食品中丙烯酰胺的測(cè)定方法，優(yōu)化前處理步驟和儀器分析條件，以建立食品中丙烯酰胺的快速準(zhǔn)確檢測(cè)技術(shù)，并且從原料、生產(chǎn)工藝等方面研究，探索減少丙烯酰胺產(chǎn)生的措施。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

Agilent1200高效液相色譜儀：Agilent1200型，配有二極管陣列檢測(cè)器DAD，美國(guó)Agilent公司；超聲波水浴器：英國(guó)GRANT XUB18；有機(jī)相濾膜：13 mm×0.22 μm，津騰儀器有限公司；甲醇、丙酮：色譜純；乙酸：分析純；丙烯酰胺：純度≥99.0%，250 mg，美國(guó)Sigma公司；丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：取10 mg丙烯酰胺（精確至0.1 mg），用甲醇溶解后定容于100 mL的棕色容量瓶中，配制成濃度為100 μg/mL丙烯酰胺的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，貯存于-20 ℃冰箱中，使用時(shí)用水稀釋成標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流速：0.5 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量為10 μL。設(shè)置3種體積配比的流動(dòng)相條件，甲醇-水溶液（A：5∶95，B：20∶80，C：60∶40）進(jìn)行試驗(yàn)，考察丙烯酰胺的標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖效果。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備。將標(biāo)準(zhǔn)貯備液用純水稀釋配制成濃度為0.05、0.1、0.2、0.5 μg/mL和1.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，進(jìn)液相色譜分析，以各標(biāo)準(zhǔn)峰的保留時(shí)間定性，峰面積外標(biāo)法定量，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

（2）樣品前處理方法的優(yōu)化。分別用水、0.1%乙酸溶液、丙酮、5%甲醇溶液作為提取溶劑：分別稱(chēng)取5份5 g（精確至0.01 g）均質(zhì)加標(biāo)（加標(biāo)量為2 μL）薯?xiàng)l樣品于10 mL容量瓶中，分別加入不同提取溶劑并定容至10 mL，加塞渦旋5 min后置于超聲波水浴中處理30 min，經(jīng)濾膜過(guò)濾后，進(jìn)樣測(cè)定。

（3）精密度和加標(biāo)回收率測(cè)定。選取曲奇、面包、薯?xiàng)l三種樣品，進(jìn)行3水平添加回收試驗(yàn)，每個(gè)添加水平取6個(gè)平行樣，進(jìn)行回收率試驗(yàn)。

（4）方法最低檢出限。選取空白樣品添加標(biāo)準(zhǔn)溶液，適當(dāng)稀釋樣品的濃度，使其信噪比RSN≤3時(shí)樣品的濃度為方法的最低檢出限。

（5）控制丙烯酰胺含量的方法。選取未油炸的薯?xiàng)l樣品，將樣品分為9組，每組4個(gè)樣品，檢測(cè)每個(gè)樣品，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果比較各組差異。具體工藝改進(jìn)方法如下：①正常的油炸油溫為220 ℃左右，將油溫降至180 ℃左右和200 ℃左右。②兩組樣品中分別添加0.05 g/kg和0.1 g/kg的特丁基對(duì)苯二酚（TBHQ），經(jīng)正常油溫煎炸。③兩組樣品中分別添加0.2 g/kg和0.4 g/kg的維生素C（VC），經(jīng)正常油溫煎炸。④兩組樣品中分別添加0.5%纖維素和1.0%纖維素，經(jīng)正常油溫煎炸。比較4組成品中丙烯酰胺的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)和流動(dòng)相比例的選擇

由于試樣中雜峰較多，易產(chǎn)生假陽(yáng)性，本文取丙烯酰胺濃度為0.2 μg/mL的溶液，利用DAD檢測(cè)器對(duì)其進(jìn)行紫外190～400 nm全波長(zhǎng)掃描，確定210 nm為測(cè)定波長(zhǎng)，360 nm為參比波長(zhǎng)，便于篩除干擾物質(zhì)，初步定性待測(cè)組分后進(jìn)一步定量，從而提了檢測(cè)的靈敏度，丙烯酰胺的吸收光譜如圖1所示。

圖1 丙烯酰胺的吸收光譜圖

改變流動(dòng)相比例，分別對(duì)甲醇-水溶液按不同比例（A：5∶95，B：20∶80，C：60∶40）試驗(yàn)。結(jié)果表明，流動(dòng)相為甲醇-水溶液（5∶95）時(shí)，峰形對(duì)稱(chēng)，重現(xiàn)型最好，效果最好（色譜圖如圖2所示）。

圖2 0.4 μg/mL丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液在A流動(dòng)相比例下的高效液相色譜圖

2.2 線(xiàn)性關(guān)系

將濃度為0.02、0.1、0.2、0.4 μg/mL和1.0 μg/mL的丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，在規(guī)定的色譜條件下測(cè)定，標(biāo)準(zhǔn)溶液所得的色譜峰峰面積和對(duì)應(yīng)的濃度繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)如圖3所示。

圖3 丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖

測(cè)定結(jié)果表明，在0.05～1.0 μg/mL的濃度范圍內(nèi)，峰面積與濃度呈線(xiàn)性關(guān)系，符合定量要求。

2.3 樣品前處理方法的優(yōu)化

分別采用水、0.1%乙酸溶液、丙酮、5%甲醇溶液作為提取溶劑對(duì)加標(biāo)樣品進(jìn)行前處理，測(cè)定其回收率。丙烯酰胺是極性小分子物質(zhì)且在酸性溶液中更加穩(wěn)定，采用水或極性強(qiáng)的有機(jī)溶劑萃取，在基質(zhì)復(fù)雜的食品中更好地提取包埋在脂肪微粒中的丙烯酰胺。結(jié)果見(jiàn)表1，加標(biāo)回收試驗(yàn)顯示4種溶劑均能達(dá)到90%以上，滿(mǎn)足檢測(cè)要求，尤以丙酮作為提取溶劑時(shí)提取效果最好，回收率達(dá)97%，同時(shí)在液相色譜上也有很好的分離。

表1 4種不同提取溶劑的回收率表（單位：%）

2.4 精密度、加標(biāo)回收率和最低檢出限

選取曲奇、面包、薯?xiàng)l3種樣品進(jìn)行3水平添加回收試驗(yàn)，每個(gè)添加水平取6個(gè)平行樣，應(yīng)用優(yōu)化后的方法進(jìn)行回收率試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。未加標(biāo)的薯?xiàng)l樣品色譜圖和對(duì)應(yīng)的加標(biāo)色譜圖如圖4、圖5所示。該方法回收率為86.3%～101.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.83%～2.15%，精密度較高。準(zhǔn)確度和精密度符合丙烯酰胺的檢測(cè)要求。

選取空白餅干樣品添加丙烯酰胺，將含量依次降低的丙烯酰胺加入到樣品中去，對(duì)每個(gè)濃度樣品測(cè)定3次，記錄每次測(cè)得S/N值，結(jié)果顯示當(dāng)添加5 ng/g時(shí)，S/N=3.1，因此該方法檢出限為5 ng/g。檢出限比國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法的更低[5]，符合新的檢測(cè)要求。

表2 樣品添加不同濃度丙烯酰胺標(biāo)樣的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差表（單位：%）

圖4 未加標(biāo)的薯?xiàng)l樣品色譜圖

圖5 加標(biāo)的薯?xiàng)l樣品色譜圖

2.5 不同工藝條件丙烯酰胺的含量水平

按優(yōu)化的丙烯酰胺檢測(cè)方法，分別對(duì)不同工藝條件下成品薯?xiàng)l樣品的丙烯酰胺含量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表3。與正常組相比，在200 ℃時(shí)變化不大；而添加TBHQ后，丙烯酰胺含量反而有所增加；油溫降至180 ℃時(shí)、添加VC以及纖維素丙烯酰胺含量控制效果明顯，其中以1.0%纖維素添加量效果最優(yōu)，丙烯酰胺含量?jī)H為正常組的28%。

表3 不同工藝條件下成品薯?xiàng)l丙烯酰胺的含量表

3 結(jié)果和討論

丙烯酰胺是極性小分子物質(zhì)，可用水或極性強(qiáng)的有機(jī)溶劑萃取。丙烯酰胺在酸性溶液中更加穩(wěn)定，但考慮到食品基質(zhì)復(fù)雜，本研究分別采用水、0.1%乙酸溶液、丙酮、5%甲醇溶液作為提取溶劑對(duì)樣品進(jìn)行前處理。結(jié)果表明，4種溶劑均可較好地提取丙烯酰胺，均能滿(mǎn)足檢測(cè)要求，尤以丙酮作為提取溶劑時(shí)提取效果最好，可能是由于丙酮能更好地提取包埋在脂肪微粒中的丙烯酰胺。此前處理方法方便快捷，相比國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)采用的氣質(zhì)聯(lián)用法（GC-MS）和國(guó)際上使用的液質(zhì)聯(lián)用法（LC-MS-MS），樣品前處理需經(jīng)過(guò)凈化、溴化衍生等步驟，可避免繁瑣步驟造成的成分損失，確保較高的回收率。HPLC方法操作簡(jiǎn)便，更易于推廣，采用甲醇-水溶液（5∶95）作為流動(dòng)相，丙烯酰胺有很好的分離效果，峰形完好，峰的保留時(shí)間和重現(xiàn)性均良好。從精密度、回收率和最低檢出限試驗(yàn)中表明，該檢測(cè)方法靈敏度、精密度和準(zhǔn)確度均較高，符合檢測(cè)要求。試驗(yàn)證明該方法是一種準(zhǔn)確、方便的測(cè)定食品中丙烯酰胺的分析方法。

在探索工藝方法控制食品中丙烯酰胺產(chǎn)生時(shí)，主要從溫度和抗氧化兩個(gè)方面考慮。通過(guò)將油溫降至180 ℃，成功地減少丙烯酰胺的產(chǎn)生，但在200 ℃時(shí)則無(wú)變化。從感官上看，與正常油溫炸出的薯?xiàng)l相比，180 ℃時(shí)顏色略淡，體積略小，口味則無(wú)大變化。因此，通過(guò)適當(dāng)?shù)慕档图庸囟瓤蓽p少丙烯酰胺的產(chǎn)生，這也與文獻(xiàn)研究結(jié)果一致[7]，但不同的原料產(chǎn)品有不同的最佳加工溫度，這需要不斷地探索。原料添加TBHQ和VC后感官基本無(wú)影響，TBHQ的使用符合GB 2760-2011標(biāo)準(zhǔn)添允許的最大添加量[8]，但在使用TBHQ后對(duì)丙烯酰胺的抑制并不明顯，甚至有促進(jìn)趨勢(shì)，這可能是高溫使抗氧化劑TBHQ發(fā)生反應(yīng)，喪失抗氧化活性，或反應(yīng)生產(chǎn)一種有利于丙烯酰胺生成的中間物質(zhì)；纖維素則對(duì)丙烯酰胺抑制效果明顯，且纖維素添加量越高，抑制效果越明顯，纖維素對(duì)丙烯酰胺產(chǎn)生的抑制機(jī)理可能是由于纖維素的添加可大大降低吸油率，減少裹粉中的油脂含量，增加裹粉的水分含量，因此在油炸過(guò)程中，水分被油脂置換受到限制，產(chǎn)生丙烯酰胺的褐變反應(yīng)受到抑制。

4 結(jié)語(yǔ)

本研究結(jié)果表明，控制薯?xiàng)l油炸油溫在180 ℃和在原料中添加VC、纖維素可有效減少成品丙烯酰胺產(chǎn)生，但丙烯酰胺的產(chǎn)生是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，其影響因素不僅與加工溫度和各種添加劑有關(guān)，還與加工時(shí)間、pH值、含水量、原料內(nèi)在成分和油的使用時(shí)間等的因素有關(guān)，值得進(jìn)一步研究。

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Determination and the Control Methods of Acrylamide in Food

Shi Shengxin
(Shantou Supervison Testing Institute of Quality and Metrology, Shantou 515041, China)

An accurate and convenient method for the determination of acrylamide in food by high performance liquid chromatography (HPLC) was developed. The acrylamide was extracted with acetone and separated by a C18column with methanol - water (5∶95) as the mobile phase. The detection wavelength was set at 210 nm with a diode array detector and quantifed by external standard method. The detection limit was 5 ng/g, RSD was 0.53%～2.10%, and the recovery was 86.3%～101.5%. The results showed that the frying temperature of french fries was reduced to 180 ℃ and the addition of VC and cellulose in the raw materials could efectively control the production of acrylamide, and the addition of fber the efect is obvious.

HPLC; Acrylamide; Food; Control

O657.7

10.16736/j.cnki.cn41-1434/ts.2016.24.049