一個常染色體顯性遺傳非綜合征型聾家系的聽力學及遺傳學特征分析△

牛志杰　蔣璐#　梅凌云　馮永，3　陳紅勝　賀楚峰

劉亞蘭1，2　王雪萍1，2　劉暢1，2　熊俊3

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一個常染色體顯性遺傳非綜合征型聾家系的聽力學及遺傳學特征分析△

牛志杰1，2蔣璐1，2#梅凌云1，2馮永1，2，3陳紅勝1，2賀楚峰1，2

劉亞蘭1，2王雪萍1，2劉暢1，2熊俊3

【摘要】目的分析一個常染色體顯性遺傳非綜合征型聾家系的聽力學和遺傳學特征。方法對收集到的一個常染色體顯性遺傳非綜合征型聾家系成員進行家系調(diào)查、聽力學檢測和全身體格檢查，繪制家系圖譜，整理、分析家系成員的聽力學和遺傳學特征；提取外周血DNA，對已知常見耳聾基因GJB2、GJB3、COCH、EYA4以及線粒體DNA全序列進行篩查。結(jié)果該家系由5代53名成員組成，現(xiàn)存4代42人，耳聾患者11人；耳聾表型連續(xù)遺傳，男女均可患病，符合常染色體顯性遺傳規(guī)律，均表現(xiàn)為對稱性語后感音神經(jīng)性聾(12~36歲之間發(fā)病)，起初為高頻聽力下降，隨著年齡的增長，逐漸累及中低頻聽力。已知常見致聾基因全編碼序列突變檢測分析無陽性發(fā)現(xiàn)。結(jié)論該常染色體顯性遺傳非綜合征型聾家系中耳聾者表現(xiàn)為對稱性、遲發(fā)性、進行性、高頻下降為主的語后感音神經(jīng)性聾。

【關(guān)鍵詞】常染色體顯性遺傳；遺傳性聾；基因突變；家系

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2015-12-2815：13

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/42.1391.R.20151228.1513.032.html

Genetic and Audiological Characteristics of An Autosomal Dominant

聽力障礙是最常見的感覺缺陷性疾病之一，全世界范圍內(nèi)估計有3.6億人承受著這種疾病的痛苦(www.who.int)，約每500個新生兒中就有1個為耳聾患兒[1]。隨著現(xiàn)代醫(yī)學的進步和發(fā)展，環(huán)境因素致聾比例逐漸降低，現(xiàn)聽力障礙人群中近60%被認為是遺傳性因素所導致[2]，鑒定所有的致聾基因?qū)θ祟愡z傳學來說是一項艱辛而富有挑戰(zhàn)性的工作。

遺傳性聾中近70%是非綜合征型聾(nonsydromic hearing loss, NSHL)，其中50%被認為是單基因遺傳病，NSHL中約20%為常染色體顯性遺傳[3]。目前共定位133個非綜合征型聾基因座位(http://hereditaryhearingloss.org，截止2015.08.28)。已報道的NSHL致病基因的定位克隆主要是依據(jù)家系研究，所以對臨床耳聾家系的收集、保存和分析對遺傳性聾基因研究很關(guān)鍵。本研究擬通過對收集到的一個常染色體顯性遺傳性非綜合征型聾家系成員的聽力表型及遺傳特征進行分析，并對其致病基因進行初步篩查，為后續(xù)基因定位及克隆研究提供參考。

1資料與方法

1.1家系資料及調(diào)查方法家系資料調(diào)查由湘雅醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科家系采集小組完成，調(diào)查研究獲得湘雅醫(yī)院倫理委員會認可。該家系5代(53人)居于湖南省某市，現(xiàn)存家系成員42人(22男，20女)，其中確診患者11人(7男，4女)，主要調(diào)查家族史、耳毒性藥物應(yīng)用史、外傷及手術(shù)史、耳聾患者發(fā)病史等，家族中共14人(包括11例耳聾者)均接受了全身體格檢查、智力評估、耳鼻咽喉科專科檢查及聽力學評估。根據(jù)該家系調(diào)查結(jié)果，繪制家系遺傳圖譜之后，依照特異的遺傳學規(guī)律及臨床特點對家系遺傳方式進行分析。

1.2聽力學檢測對所有家系成員均進行常規(guī)純音測聽(丹麥Madsen502便攜式聽力計)、聲導抗檢測，耳聾患者進行聽性腦干反應(yīng)(ABR)、耳聲發(fā)射以及40 Hz聽覺相關(guān)電位檢測；先證者耳鳴癥狀顯著，完善耳鳴檢測。

根據(jù)WHO(1997)的聽力損失標準評估聽力損失程度，輕度聽力損失為26～40 dB HL；中度聽力損失為41～60 dB HL；重度聽力損失為61～80 dB HL；極重度聽力損失為>81 dB HL。

1.3耳聾基因篩查所有家系成員均簽署知情同意書，收集耳聾患者血樣9份，正常人血樣5份(EDTA采血管抽取外周靜脈血3~8 ml)，用于基因組DNA提取與保存。運用sanger測序技術(shù)對先證者進行最常見顯性遺傳性聾基因GJB2、GJB3、COCH、EYA4以及線粒體DNA[4~6]全序列測序，對于未被報道的新的堿基突變則進一步在部分家系成員中擴大范圍篩查與驗證，分析是否存在符合相應(yīng)的基因型和表型共分離現(xiàn)象。

2結(jié)果

2.1該家系遺傳學特征分析該家系系譜圖見圖1，可見，家系共5代，各代連續(xù)發(fā)病，現(xiàn)存家系成員42人，主要為第三至第五代成員確診的11例耳聾患者，聽力損失發(fā)病年齡為12~36歲，均以耳部癥狀為單一癥狀，無耳毒性相關(guān)藥物以及噪聲接觸史，未見明顯其他器官、系統(tǒng)異常。耳聾患者中伴耳鳴3例，均無前庭功能障礙。先證者(Ⅳ-17)為27歲女性，因雙耳聽力下降伴高調(diào)耳鳴就診，純音測聽示雙耳對稱性、重度感音神經(jīng)性聾，無眩暈，耳鳴檢測示雙耳高調(diào)性耳鳴，雙耳聽閾曲線均為高頻快速下降型；雙耳鼓室導抗圖為A型；雙耳ABR反應(yīng)閾為97 dB nHL；DPOAE檢查示左耳0.75、1.0、1.5 kHz通過，右耳0.75、1.0 kHz通過，其余頻率雙耳均未通過，排除了聽神經(jīng)??；顳骨高分辨率CT示：中耳及內(nèi)耳發(fā)育正常，排除中耳乳突病變、內(nèi)耳畸形和占位性病變等非遺傳性因素造成的聽力損失。家系中最初的耳聾者為男性(I-1)，其后代三個子女中2個為患者，第3代及以后代系患者均系該2名患者的后裔。由此可見，該家系連續(xù)四代中均有發(fā)病患者，耳聾表型代代相傳，呈連續(xù)遺傳現(xiàn)象；每一代家系成員中男女均可患病，且子代患病個體的父母雙方必有一方為耳聾患者； 家系中無論男性或女性患者，均可將耳聾表型遺傳給子代，以上特征符合典型的常染色體顯性遺傳模式。

圖1　耳聾家系系譜圖

2.2聽力檢測結(jié)果該家系11例耳聾患者中年齡最大78歲，最小15歲，其中，第Ⅲ代成員共9人，明確耳聾患者6人，男女之比為4：2，發(fā)病年齡最早15歲，最晚32歲，女性患者平均年齡24.5歲，因所有患者平均年齡已達61.2歲，低中頻率聽力亦受累下降，除了Ⅲ-16患者為重度感音神經(jīng)性聾，其余均為極重度感音神經(jīng)性聾，聽閾曲線為陡降型和島狀型 (殘余聽力)[7]。第Ⅳ代成員19人中，耳聾5人，男女之比為3：2，平均年齡41.4歲，最早發(fā)病者為12歲，最晚36歲，女性患者平均年齡20.2歲，聽閾曲線均以高頻聽力下降明顯，部分患者出現(xiàn)中頻聽力受累，而低頻聽力基本均正常。該家系11例耳聾者中10例患者的聽力檢測及發(fā)病年齡、雙耳平均聽閾、純音聽閾曲線類型、聽力損失程度及是否伴耳鳴與否見表1，Ⅳ-10右耳平均聽閾雖在正常范圍，但高頻聽力下降明顯，且伴耳鳴癥狀，考慮其發(fā)病時間短，表型同先證者相似度高，故初步將其視為患者；Ⅲ-8、Ⅳ-2不愿配合血采樣及聽力檢測，但通過言語交流發(fā)現(xiàn)其聽力差、言語交流困難，可明確為耳聾患者，第Ⅴ代家系年齡普遍偏小，尚未到發(fā)病年齡。

表1　該家系中10例耳聾患者聽力檢測及發(fā)病年齡、純音聽閾測試結(jié)果及是否伴耳鳴

注：*尚未到發(fā)病年齡或剛到發(fā)病年齡表型可疑者； NR為各頻率最大輸出均無反應(yīng)

2.3基因突變篩查結(jié)果家系中先證者基因直接測序結(jié)果同參考序列比對后，發(fā)現(xiàn)線粒體基因共32個堿基變異，GJB2基因和GJB3基因各1個堿基變異，EYA4基因共6個堿基變異，COCH基因共3個堿基變異，該4個常見致病基因以及線粒體DNA全編碼序列篩查突變位點均為已報道的單核苷酸多態(tài)性改變；COCH基因c.629+38Delt未見報道，對家系一例患者(Ⅲ-12)和兩例正常者(Ⅲ-13、Ⅲ-14)驗證該位點，發(fā)現(xiàn)Ⅲ-12、Ⅲ-13都帶有該突變，而Ⅲ-14為正?；蛐停窗l(fā)現(xiàn)該堿基改變與臨床表型的共分離現(xiàn)象(圖2)。

3討論

圖2　家系成員COCH基因c.629+38Delt位點驗證

通過該家系資料調(diào)查分析，可見其家系系譜圖表現(xiàn)出連續(xù)遺傳現(xiàn)象， 第三代家系成員中男女患者比例為4:2，但已故的Ⅲ-7為女性，通過家屬提供信息判斷為耳聾患者，同時家系第四代患病個體男女性別比相近(3：2)，由此判斷，該家系中男女均可出現(xiàn)耳聾表型，且機率均等，符合典型常染色體顯性遺傳模式，故可確認該家系為一個常染色體顯性遺傳性非綜合征型聾家系。家系患者均為語后聾，發(fā)病年齡12~36歲，起始均為高頻聽力下降，呈進行性加重，45~50歲以后累及中低頻，表現(xiàn)為極重度感音神經(jīng)性聾，表型特征為語后、遲發(fā)型、進行性、高頻聽力損失為主的感音神經(jīng)性聾。

常染色體顯性遺傳性非綜合征型聾遺傳表型以高頻聽力損失為主，而低頻和中頻聽力損失表型相對少見，且至今尚未發(fā)現(xiàn)某種基因突變頻率相對較高的常染色體顯性遺傳(DFNA)，缺乏像常染色體隱性遺傳性聾致病基因GJB2一樣的“明星基因”，故對高頻聽力下降為主的DFNA家系致病基因的鑒定工作更為困難。耳聾基因具有極大的異質(zhì)性，數(shù)個基因(GJB2、GJB6、TECTA、MYO7A、MYO6A、COL11A2、TBC1D24以及TMC1等)既可引起顯性亦可引起隱性非綜合征型聾，還有一些基因(GJB3、GJB2、WFS1、MYO7A、COL11A2以及MYH9等)可引起綜合征型和非綜合征型聾[9]。遺傳性疾病基因定位克隆策略主要有四種方法[10]，目前耳聾基因研究多采用的是候選基因克隆和位置候選基因克隆法，該家系樣本系2代家系成員，難以提供足夠的遺傳信息量，因此本研究采用基因直接測序檢測突變。

GJB2是最常見的非綜合征型聾致病基因，50%的常染色體隱性遺傳性聾和20%的遺傳性聾與之相關(guān)[11]，定位于DFNA3A和DFNB1A位點，文獻統(tǒng)計GJB2已有超過110種突變方式[12]，其中9種可導致DFNA(http://davinci.crg.es/deafness/index.php)。GJB2基因編碼的縫隙鏈接蛋白Cx26通過細胞縫隙鏈接網(wǎng)絡(luò)影響內(nèi)耳鉀離子通道的功能[12]；GJB2 235delC突變是東南亞人群中發(fā)病率最高的突變類型[13]；GJB2基因突變表型可表現(xiàn)為輕度到極重度聾[14]，患者的運動功能及前庭功能正常[15]。流行病學調(diào)查也顯示，GJB2基因是我國非綜合征型耳聾人群中的熱點突變基因，并且該基因僅一個外顯子序列，檢測方便。

GJB3基因編碼縫隙鏈接蛋白connexin31，被定位和克隆在(DFNA2B)1p33-35，與GJB2(DFNA3&DFNB1)一樣被廣泛認為可作為遺傳性聽力損失篩查的良好候選基因[16]。GJB3基因是一種典型的可引起非綜合征型聾、綜合征型聾及遺傳性皮膚病的異質(zhì)性基因[17,18]。該基因是由中國遺傳學重點實驗室夏家輝院士等研究人員在兩個小的高頻聽力損失的中國耳聾家系中首先報道[16]。GJB3基因突變引起的耳聾患者，起初多表現(xiàn)為高頻聽力損失，逐漸累及全頻，發(fā)病年齡多在10~20歲之間，表型與本研究耳聾家系很相似，并且擁有相同的遺傳背景。

COCH基因定位于DFNA9位點[5]，DFNA9基因突變所致聽力損失患者發(fā)病年齡集中于20~30歲，起初表現(xiàn)為高頻受累，逐漸累及全頻，表現(xiàn)為嚴重聽力缺失，部分患者可伴眩暈等前庭功能障礙[19]；COCH基因突變在DFNA家系中檢出頻率相對較高。EYA4基因突變引起的耳聾主要表現(xiàn)為30歲左右開始出現(xiàn)高頻和中頻聽力損失，逐漸累及全頻，聽閾曲線為下降型或平坦型[20]，本研究收集的耳聾家系患者表型與此類似，故該家系的致病基因可能是EYA基因突變。

線粒體基因突變可以導致非綜合征型和綜合征型聽力損失，其中12SrRNA基因突變還可以引起患者對氨基糖苷類藥物的易感性[21]。雖然尚未報道其可引起常染色體顯性遺傳性聾，但其為熱點突變基因，考慮到耳聾基因的異質(zhì)性，本研究對該家系先證者進行了檢測，共發(fā)現(xiàn)32個單核苷酸堿多態(tài)，初步排除該家系母系遺傳的可能性。

根據(jù)文中對候選基因篩查的結(jié)果，顯示COCH基因c.629+38Delt位點經(jīng)驗證未發(fā)現(xiàn)基因型和表型的共分離，初步排除該基因為該家系的致病基因，根據(jù)序列多物種保守性分析，該位點保守性低，亦可能為新的單核苷酸多態(tài)位點，其余GJB2、GJB3、COCH、EYA4以及線粒體DNA共篩查出42個堿基變異，均為已知的單核苷酸多態(tài)位點。下一步應(yīng)該對已克隆的92個NSHL耳聾基因或者33個DFNA基因進行測序篩查(http://hereditaryhearingloss.org，截止2015.08.28)，但這是一項非常費時、費力、低效率的工作，且該家系特征限制了全基因組連鎖分析方法的應(yīng)用。

全外顯子組測序技術(shù)可以進行目標序列的富集，然后對幾乎所有的蛋白編碼外顯子序列進行同步測序，使得全基因序列的獲取變得更加便捷，鑒于大多數(shù)功能性變異主要位于外顯子及其相鄰內(nèi)含子區(qū)域，全外顯子組測序已成為研究孟德爾遺傳性疾病的一種重要技術(shù)方法[22,23]；近5年應(yīng)用該技術(shù)已經(jīng)有10余個新的耳聾基因被鑒定。鑒于該新一代測序技術(shù)的高效性，今后，擬對該家系成員Ⅲ-14(正常者)、Ⅲ-12、Ⅳ-5進行全外顯子組測序，希望能找到該家系的致病基因或新的耳聾基因。

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(2015-01-01收稿)

(本文編輯周濤)

·臨床研究·

Nonsyndromic Deafness Kindred

Niu Zhijie*, Jiang Lu, Mei Lingyun, Feng Yong, Cheng Hongsheng, He Chufeng,

Liu Yalan, Wang Xueping, Liu Chang, Xiong Jun

(*Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, Xiangya Hospital,

Central South University, Changsha, 410008,China)

【Abstract】ObjectiveTo investigate the audiological and genetical features of a large Chinese pedigree with autosomal dominant nonsydromic hearing loss.MethodsWe collected the detailed medical history information of all the family members. Otoscopies, physical examinations, and pure-tone audiometry were performed. Blood samples were collected and well preserved as consented by all the participants. Genetic characteristics of the family were evaluated by audiology materials and pedigree; genomic DNA was isolated from the peripheral leukocytes of the subjects. The common deafness genes (GJB2, GJB3, COCH, EYA4，MTDNA) were screened to exclude known pathogenic mutations in the candidate genes.ResultsWe collected data from a five-generation family from Hunan Province of China with autosomal dominant sensorineural hearing loss. The family had 53 members, of which 42 members were alive and 14 members' blood samples were collected, and 11 patients were found to be hearing-impaired. Audiograms showed bilateral symmetric, progressive and sensorineural hearing loss occurred in the first to third

△國家重大科學研究計劃項目(Grant No.2014CB943003)、國家自然科學基金(Grant No.81300833)及湖南省自然科學基金青年基金(Grant No.13JJ4023)資助資助

1中南大學湘雅醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科(長沙410008)；2耳鼻咽喉重大疾病研究湖南省重點實驗室；3中南大學醫(yī)學遺傳學國家重點實驗室

#為并列第一作者

decade ago, progressing first at high-frequencies, and ultimately expending to mid and low frequencies, leading to severe-profound hearing loss. The mode of inheritance appeared to be autosomal dominant based upon the pedigree. By screening the common deafness genes, we didn't find any causative mutations but some single nucleotide polymorphisms(SNPs).ConclusionThe pedigree analysis indicated an autosomal dominant inheritance pattern in the large family, in which affected subjects showed post-lingual, symmetry, progressive hearing impairment. The negative screening results of the common deafness genes suggest that we should perform other strategies to explore the pathogenic genes, such as applying facilitate whole-exome sequencing or whole genome sequencing on this family.

【Key words】Autosomal dominant hereditary;Hereditary deafness;Gene mutation;Pedigree

通訊作者：梅凌云(Email：entmly@163.com)；馮永(Email:fengyonghn@hotmail.com)

作者簡介：牛志杰，男，湖南人，在讀博士研究生，主要研究方向為遺傳性聾為主的耳科學基礎(chǔ)與臨床研究。

【中圖分類號】R764.44

【文獻標識碼】A

【文章編號】1006-7299(2016)01-0005-05

DOI：10.3969/j.issn.1006-7299.2016.01.002