司馬晉, 張 保△, 艾 青, 王保軍, 馬 鑫 , 張 旭
(1.航天中心醫(yī)院泌尿外科, 北京 100049; 2.解放軍總醫(yī)院泌尿疾病重點實驗室, 北京 100053)
過表達Numb基因?qū)θ税螂装?637細胞周期和增殖的影響*
司馬晉1, 張 保1△, 艾 青2, 王保軍2, 馬 鑫2, 張 旭2
(1.航天中心醫(yī)院泌尿外科, 北京 100049; 2.解放軍總醫(yī)院泌尿疾病重點實驗室, 北京 100053)
目的:探討Numb基因?qū)θ税螂装┘毎芷诤驮鲋衬芰Φ挠绊懠跋嚓P(guān)機制。方法: 選取人膀胱癌細胞5637為研究對象,采用Numb-ORF表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞為實驗組,設(shè)置陰性對照和空白對照組。采用熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)和蛋白質(zhì)印跡技術(shù)檢測各組中Numb基因和細胞周期蛋白D1(Cyclin D1)的表達;采用流式細胞技術(shù)檢測各組的細胞周期;采用酶標儀檢測細胞在490nm的吸光度值,評價各組細胞的增殖活力。結(jié)果: 實驗組Numb的△CT值為1.58±0.41,陰性對照組為5.66±0.53,空白對照組為5.81±0.47,差異有統(tǒng)計學意義(F=77.39,P=0.00);實驗組Cyclin D1的△CT值為4.92±0.73,陰性對照組為2.59±0.33,空白對照組為2.45±0.26,差異有統(tǒng)計學意義(F=11.70,P=0.01)。實驗組中G0/G1期細胞的比例(%)為49.76±7.07,明顯高于陰性對照組的36.52±3.32和空白對照組的38.21±2.06,差異有統(tǒng)計學意義(F=7.17,P=0.03)。增殖實驗中,實驗組24 h的吸光度值為0.35±0.08,明顯低于陰性對照組0.52±0.06和空白對照組0.55±0.04(F=9.03,P=0.02)。 結(jié)論: Numb基因可以提高G0/G1期細胞比例,抑制膀胱癌細胞增殖,其機制可能是通過抑制Cyclin D1表達實現(xiàn)。
膀胱腫瘤; Numb基因; 細胞周期蛋白D1
膀胱癌是泌尿外科常見的惡性腫瘤,病理類型以尿路上皮癌最常見,近年來膀胱癌的發(fā)病率逐年升高[1-2]。腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個多因素多階段的過程,包括抑癌基因失活、癌基因活化以及細胞生物學功能的異常改變,在各種細胞生物學功能的變化中,細胞周期紊亂所致的異常細胞增殖是惡性腫瘤的共同特點[3-4]。Numb基因是新近發(fā)現(xiàn)的細胞命運決定因子,參與了多種人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展[5-6]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)Numb基因上調(diào)可以降低膀胱癌細胞的侵襲和遷移能力[1]。本研究中我們將在前期基礎(chǔ)上,使用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)上調(diào)膀胱癌細胞中Numb基因的表達,檢測細胞周期和細胞增殖的變化,以及對細胞周期素D1(Cyclin D1)表達的影響,探討Numb基因在膀胱癌細胞周期和增殖中的作用及可能的相關(guān)機制。
1.1 細胞培養(yǎng)
人膀胱癌細胞5637由北京大學航天臨床醫(yī)學院實驗室保存。使用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司),37℃常規(guī)培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞實驗。
1.2 分組與處理
Numb-ORF表達質(zhì)粒、空載體pCMV6-Entry和轉(zhuǎn)染試劑Mega Tran 1.0購自美國Origene公司。實驗分為三組:實驗組(轉(zhuǎn)染Numb-ORF)、陰性對照組(轉(zhuǎn)染空載體)和空白對照組。具體操作見前期文獻[1,7]。轉(zhuǎn)染后48h收集細胞進行實驗。
1.3 檢測目的基因表達
使用ABI- 7500熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)儀檢測目的基因的mRNA表達:以PPIA (peptidylprolyl isomerase A)為內(nèi)參,采用相對定量比較CT值法分析數(shù)據(jù)[8]。Numb的上游引物:5’-CTTTTACAAGAGAAGGATCATTCCG-3’,下游引物:5’-CAACGACTATCTTATCTGTTTCAGC-3’;Cyclin D1的上游引物:5’-CCCTCGGTGTCCTACTTCAA- 3’,下游引物:5’-AGGAAGCGGTCCAGGTAGTT- 3’;PPIA的上游引物:5’-ATGGTCAACCCCACCGTGT- 3’,下游引物:5’-TCTGCTGTCTTTGGGACC TTGTC- 3’。使用蛋白質(zhì)印跡檢測各目的基因蛋白質(zhì)表達強度,Numb、Cyclin D1和內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的一抗購自英國Abcam公司,按1 ∶1 000稀釋后使用。二抗購自北京中杉金橋公司,按1 ∶2 000稀釋后加入,具體操作步驟參照文獻[1,7]。
1.4 檢測細胞周期
收集各組細胞,以70%乙醇固定12小時,加入1毫升碘化丙啶染色液(上海碧云天公司)染色后流式細胞儀檢測,并計算增殖指數(shù)(proliferation index,PI)=(G2/M+S)/(G0/G1+S+G2/M),實驗獨立重復3次。
1.5 檢測細胞增殖能力
實驗前在96孔板中以2 000個細胞/孔密度鋪板,檢測時每孔加入MTS試劑(美國Promega公司)20μl,37℃孵育1小時后酶標儀檢測490nm吸光度值(A490),比較三組的細胞活力,實驗獨立重復3次。
1.6 統(tǒng)計學分析
2.1 各組中Numb基因的表達水平
實驗組的△CT值為1.58±0.41,陰性對照組為5.66±0.53,空白對照組為5.81±0.47,差異有統(tǒng)計學意義(F=77.39,P=0.00)。蛋白質(zhì)印跡檢測可見實驗組Numb表達強度明顯強于兩對照組(圖1),提示轉(zhuǎn)染Numb-ORF質(zhì)??梢陨险{(diào)膀胱癌5637細胞中Numb的表達水平。
圖1 蛋白印跡檢測目的基因表達
2.2 各組中Cyclin D1的表達水平
實驗組的△CT值為4.92±0.73,陰性對照組為2.59±0.33,空白對照組為2.45±0.26,差異有統(tǒng)計學意義(F=11.70,P=0.01)。根據(jù)PCR實驗原理,循環(huán)數(shù)(CT值)越大則表示該基因的表達量越低。蛋白質(zhì)印跡檢測可見實驗組中Cyclin D1的表達強度較對照組降低(圖1)。
2.3 上調(diào)Numb表達對細胞周期的影響
流式細胞儀分析顯示,實驗組中G0/G1期細胞的比例(%)為49.76±7.07,明顯高于陰性對照組的36.52±3.32和空白對照組的38.21±2.06,差異有統(tǒng)計學意義(F=7.17,P=0.03)。同時,實驗組的S期細胞比例和增殖指數(shù)均降低(P<0.05,表1,圖2)。這表明上調(diào)Numb基因可以增加G0/G1期細胞比例,減少S期細胞比例,降低細胞的增殖指數(shù)。
表1 流式細胞技術(shù)檢測各組細胞
2.4 上調(diào)Numb表達對細胞增殖的影響
實驗組在24 h的吸光度值為0.35±0.08,明顯低于陰性對照組0.52±0.06和空白對照組0.55±0.04(F=9.03,P=0.02);同樣,實驗組在48 h和72 h的吸光度也明顯低于兩對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P=0.01,表2)。根據(jù)MTS法的實驗原理,在490nm的吸光度(A490)值與活細胞的數(shù)量呈線性關(guān)系,即A490值越大則代表的活細胞數(shù)量越多。這表明實驗組的細胞增殖減弱。
圖2 流式細胞技術(shù)分析各組細胞周期分布圖
組別0h24h48h72h實驗組0.18±0.040.35±0.080.68±0.160.92±0.31陰性對照組0.16±0.030.52±0.061.24±0.232.02±0.36空白對照組0.17±0.020.55±0.041.38±0.181.96±0.27F值0.319.0311.1311.53P值0.740.020.010.01
膀胱癌是泌尿外科常見的惡性腫瘤,發(fā)病率長期位居我國泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤的首位[9-10]。近年來,隨著社會工業(yè)化程度提高和環(huán)境污染等因素,膀胱癌的發(fā)病率仍在逐年提高[2]。臨床上不同TNM分期的膀胱癌患者,預后差別很大[9-10]。在TNM分期中,T分期是衡量腫瘤體積大小的指標,而腫瘤的大小與腫瘤細胞的增殖能力是密切相關(guān)的。因此,研究Numb基因?qū)Π螂装┘毎芷诤驮鲋衬芰Φ挠绊?,將有助于從分子水平認識膀胱癌發(fā)生發(fā)展的原因,有益于膀胱癌患者的臨床治療和預后。
現(xiàn)有研究表明,腫瘤的形成與進展是多因素交互的結(jié)果,基因?qū)W的改變在其中發(fā)揮了重要作用[11-12]。Numb基因是新近發(fā)現(xiàn)的腫瘤相關(guān)基因,廣泛存在于從果蠅到哺乳動物及人類的各層級生物體內(nèi)[1,6]。前期研究發(fā)現(xiàn),Numb蛋白的不同表達強度決定了子代細胞不同的分化命運,因而Numb基因被定義為細胞命運決定因子[5]。目前已有多篇研究報道發(fā)現(xiàn)Numb基因的異常表達參與了人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Rennstam等[13]利用免疫組化技術(shù)檢測241例乳腺癌組織標本發(fā)現(xiàn)乳腺癌中Numb表達降低,并且減低程度與乳腺癌的侵襲性相關(guān),提示Numb在乳腺癌中可能發(fā)揮抑癌因子作用。Wu等[14]對肝細胞癌中的Numb基因進行研究,發(fā)現(xiàn)在肝癌病理組織中Numb基因高表達,且高表達的Numb基因與患者的不良預后具有相關(guān)性,提示Numb基因在肝癌中可能發(fā)揮促癌作用。根據(jù)前期文獻我們發(fā)現(xiàn)在不同類型的腫瘤中Numb基因的生物學作用不盡相同,有時作為抑癌因子,有時發(fā)揮促癌作用,因此Numb基因在膀胱癌中的作用尚須明確。本研究在前期工作基礎(chǔ)上,通過Numb基因?qū)θ税螂装┘毎芷诤驮鲋衬芰Φ挠绊?,進一步探討Numb基因在人膀胱癌中的作用和相關(guān)機制。
惡性腫瘤共性的生物學特點是細胞周期紊亂所致的異常細胞增殖,同時細胞增殖強度也影響著腫瘤的大小和以此為依據(jù)的臨床T分期[15]。Cyclin D1是一個負責細胞周期調(diào)控的重要蛋白質(zhì),其表達與細胞增殖密切相關(guān)[16]。生理情況下,Cyclin D1負責調(diào)控細胞由G1期進入S期;當Cyclin D1表達過量時,會促使G1期細胞向S期轉(zhuǎn)化,縮短細胞周期,加速增殖,這也是腫瘤組織迅速生長的原因之一。Lima等[16]研究發(fā)現(xiàn)Cyclin D1在膀胱癌病理組織中表達升高,而且其表達量與腫瘤的大小、分期、分級等臨床指標呈統(tǒng)計學相關(guān)性,降低Cyclin D1表達水平將有利于膀胱癌患者獲得更好的預后轉(zhuǎn)歸。本研究中我們使用體外質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù),在膀胱癌5637細胞中過表達Numb基因,檢測細胞周期和增殖活力的變化。我們發(fā)現(xiàn)過表達Numb基因可以促使膀胱癌細胞的G0/G1期比例升高,降低S期比例,抑制腫瘤細胞的G1/S期轉(zhuǎn)化,減低細胞增殖指數(shù)。眾所周知,S期是細胞DNA的合成期,是為細胞有絲分裂進行遺傳物質(zhì)準備的時期,處于S期細胞的比例降低意味著能夠進行有絲分裂增殖的細胞減少[4]。在細胞增殖實驗中我們也觀察到,實驗組細胞的增殖活力顯著低于對照組。
為了進一步探討Numb基因?qū)Π螂装┘毎芷诤驮鲋痴{(diào)控的可能機制,我們檢測了與增殖相關(guān)的細胞周期蛋白 D1的表達,結(jié)果顯示實驗組中Cyclin D1的表達下降。Flores等報道了Numb基因可以與膜受體Notch信號相互作用,抑制Notch信號通道的活化及下游效應(yīng)因子的表達[17]。我們前期在膀胱癌的研究中已證實:Notch信號的活性是通過介導細胞核轉(zhuǎn)錄因子Hes1從而向下傳導影響下游的效應(yīng)分子表達[10]。同時也有文獻證實,Cyclin D1就是Notch信號通道下游的效應(yīng)因子之一[18]。因此,綜合這些間接證據(jù)我們可以推論Numb基因可抑制Notch信號通路的活化,受抑制的Notch信號可影響Cyclin D1的表達。由此我們預測Numb基因似乎是通過Notch信號通路途徑抑制了Cyclin D1的表達,影響細胞周期和抑制細胞增殖,今后我們將繼續(xù)研究證實這一觀點。綜上,本研究發(fā)現(xiàn)Numb基因可以負性調(diào)節(jié)Cyclin D1的表達促使膀胱癌細胞發(fā)生G0/G1期阻滯,抑制細胞增殖,提示Numb基因在膀胱癌中可能發(fā)揮抑癌基因作用,有可能成為新型的腫瘤標志物或潛在的抗腫瘤藥物靶點。
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Effect of Numb Gene on Cell Cycle and Proliferation in Human Bladder Cancer 5637 Cells*
Sima Jin1, Zhang Bao1△, Ai Qing2, et al
(1.DepartmentofUrology,AerospaceCenterHospital,Beijing100049,China; 2.KeyLaboratoryofUrologicalDiseases,GeneralHospitalofChinesePeople’sLiberationArmy,Beijing100053,China)
Objective: To study the effect of Numb gene on cell cycle and proliferation in human bladder cancer cells and its related mechanism. Methods: Human bladder cancer 5637 cells which were transfected by the Numb-ORF plasmid were used as the experimental group. The negative control and blank control were also set. The expression of Numb or Cyclin D1 was detected by Real-Time PCR and Western Blot. The cell cycle was analyzed by Flow cytometry. Cell proliferation was assessed by comparing with absorbance at 490nm using a Micro-plate Reader. Results: Compared with the negative control (5.66±0.53) and blank control (5.81±0.47), the △CTvalue of Numb in the Numb-ORF group (1.58±0.41) was significantly lower (F=77.39,P=0.00). Meanwhile, the △CT value of Cyclin D1 in the Numb-ORF group (4.92±0.73) was significantly higher than that in the negative control (2.59±0.33) and blank control (2.45±0.26) (F=11.70,P=0.01). The ratio (%) of G0/G1cells was as follows: Numb-ORF group was 49.76±7.07, negative control was 36.52±3.32 and blank control was 38.21±2.06 (F=7.17,P=0.03). In proliferation assay, compared with negative control (0.52±0.06) and blank control (0.55±0.04), the OD value at 24h in Numb-ORF group (0.35±0.08) was significantly reduced (F=9.03,P=0.02). Conclusion: Numb gene could promote G0/G1phase arrested and inhibit proliferation of bladder cancer cells, the suppressive effects may be due to down-regulation of Cyclin D1.
Bladder Neoplasm; Numb Gene; Cyclin D1
2015- 10- 09
2016- 01- 09
*國家自然科學基金(81100561)
司馬晉,男,山西運城人,碩士研究生,主治醫(yī)師,主要研究方向:泌尿系腫瘤的基礎(chǔ)和臨床研究。
△張 保,主任醫(yī)師,E-mail:baoztj@sina.com
R737.14;R730.2
A
10.3969/j.issn.1674- 0904.2016.01.001
?應(yīng)用基礎(chǔ)研究?