過表達(dá)Numb基因?qū)θ税螂装?637細(xì)胞周期和增殖的影響*

司馬晉， 張 ?！?， 艾 青， 王保軍， 馬 鑫 ， 張 旭

(1.航天中心醫(yī)院泌尿外科, 北京 100049； 2.解放軍總醫(yī)院泌尿疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100053)

過表達(dá)Numb基因?qū)θ税螂装?637細(xì)胞周期和增殖的影響*

司馬晉1， 張 保1△， 艾 青2， 王保軍2， 馬 鑫2， 張 旭2

(1.航天中心醫(yī)院泌尿外科, 北京 100049； 2.解放軍總醫(yī)院泌尿疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100053)

目的：探討Numb基因?qū)θ税螂装┘?xì)胞周期和增殖能力的影響及相關(guān)機(jī)制。方法: 選取人膀胱癌細(xì)胞5637為研究對象，采用Numb-ORF表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組，設(shè)置陰性對照和空白對照組。采用熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和蛋白質(zhì)印跡技術(shù)檢測各組中Numb基因和細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1)的表達(dá)；采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測各組的細(xì)胞周期；采用酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞在490nm的吸光度值，評價(jià)各組細(xì)胞的增殖活力。結(jié)果： 實(shí)驗(yàn)組Numb的△CT值為1.58±0.41，陰性對照組為5.66±0.53，空白對照組為5.81±0.47，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=77.39，P=0.00)；實(shí)驗(yàn)組Cyclin D1的△CT值為4.92±0.73，陰性對照組為2.59±0.33，空白對照組為2.45±0.26，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=11.70，P=0.01)。實(shí)驗(yàn)組中G0/G1期細(xì)胞的比例(%)為49.76±7.07，明顯高于陰性對照組的36.52±3.32和空白對照組的38.21±2.06，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=7.17，P=0.03)。增殖實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組24 h的吸光度值為0.35±0.08，明顯低于陰性對照組0.52±0.06和空白對照組0.55±0.04(F=9.03,P=0.02)。 結(jié)論： Numb基因可以提高G0/G1期細(xì)胞比例，抑制膀胱癌細(xì)胞增殖，其機(jī)制可能是通過抑制Cyclin D1表達(dá)實(shí)現(xiàn)。

膀胱腫瘤； Numb基因； 細(xì)胞周期蛋白D1

膀胱癌是泌尿外科常見的惡性腫瘤，病理類型以尿路上皮癌最常見，近年來膀胱癌的發(fā)病率逐年升高[1-2]。腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素多階段的過程，包括抑癌基因失活、癌基因活化以及細(xì)胞生物學(xué)功能的異常改變，在各種細(xì)胞生物學(xué)功能的變化中，細(xì)胞周期紊亂所致的異常細(xì)胞增殖是惡性腫瘤的共同特點(diǎn)[3-4]。Numb基因是新近發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞命運(yùn)決定因子，參與了多種人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展[5-6]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)Numb基因上調(diào)可以降低膀胱癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力[1]。本研究中我們將在前期基礎(chǔ)上，使用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)上調(diào)膀胱癌細(xì)胞中Numb基因的表達(dá)，檢測細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖的變化，以及對細(xì)胞周期素D1(Cyclin D1)表達(dá)的影響，探討Numb基因在膀胱癌細(xì)胞周期和增殖中的作用及可能的相關(guān)機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人膀胱癌細(xì)胞5637由北京大學(xué)航天臨床醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存。使用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，37℃常規(guī)培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

1.2 分組與處理

Numb-ORF表達(dá)質(zhì)粒、空載體pCMV6-Entry和轉(zhuǎn)染試劑Mega Tran 1.0購自美國Origene公司。實(shí)驗(yàn)分為三組：實(shí)驗(yàn)組(轉(zhuǎn)染Numb-ORF)、陰性對照組(轉(zhuǎn)染空載體)和空白對照組。具體操作見前期文獻(xiàn)[1，7]。轉(zhuǎn)染后48h收集細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 檢測目的基因表達(dá)

使用ABI- 7500熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)儀檢測目的基因的mRNA表達(dá)：以PPIA (peptidylprolyl isomerase A)為內(nèi)參，采用相對定量比較CT值法分析數(shù)據(jù)[8]。Numb的上游引物：5’-CTTTTACAAGAGAAGGATCATTCCG-3’，下游引物：5’-CAACGACTATCTTATCTGTTTCAGC-3’；Cyclin D1的上游引物：5’-CCCTCGGTGTCCTACTTCAA- 3’，下游引物：5’-AGGAAGCGGTCCAGGTAGTT- 3’；PPIA的上游引物：5’-ATGGTCAACCCCACCGTGT- 3’，下游引物：5’-TCTGCTGTCTTTGGGACC TTGTC- 3’。使用蛋白質(zhì)印跡檢測各目的基因蛋白質(zhì)表達(dá)強(qiáng)度，Numb、Cyclin D1和內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的一抗購自英國Abcam公司，按1 ∶1 000稀釋后使用。二抗購自北京中杉金橋公司，按1 ∶2 000稀釋后加入，具體操作步驟參照文獻(xiàn)[1,7]。

1.4 檢測細(xì)胞周期

收集各組細(xì)胞，以70%乙醇固定12小時(shí)，加入1毫升碘化丙啶染色液(上海碧云天公司)染色后流式細(xì)胞儀檢測，并計(jì)算增殖指數(shù)(proliferation index,PI)=(G2/M+S)/(G0/G1+S+G2/M)，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.5 檢測細(xì)胞增殖能力

實(shí)驗(yàn)前在96孔板中以2 000個(gè)細(xì)胞/孔密度鋪板，檢測時(shí)每孔加入MTS試劑(美國Promega公司)20μl，37℃孵育1小時(shí)后酶標(biāo)儀檢測490nm吸光度值(A490)，比較三組的細(xì)胞活力，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 各組中Numb基因的表達(dá)水平

實(shí)驗(yàn)組的△CT值為1.58±0.41，陰性對照組為5.66±0.53，空白對照組為5.81±0.47，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=77.39，P=0.00)。蛋白質(zhì)印跡檢測可見實(shí)驗(yàn)組Numb表達(dá)強(qiáng)度明顯強(qiáng)于兩對照組(圖1)，提示轉(zhuǎn)染Numb-ORF質(zhì)粒可以上調(diào)膀胱癌5637細(xì)胞中Numb的表達(dá)水平。

圖1 蛋白印跡檢測目的基因表達(dá)

2.2 各組中Cyclin D1的表達(dá)水平

實(shí)驗(yàn)組的△CT值為4.92±0.73，陰性對照組為2.59±0.33，空白對照組為2.45±0.26，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=11.70，P=0.01)。根據(jù)PCR實(shí)驗(yàn)原理，循環(huán)數(shù)(CT值)越大則表示該基因的表達(dá)量越低。蛋白質(zhì)印跡檢測可見實(shí)驗(yàn)組中Cyclin D1的表達(dá)強(qiáng)度較對照組降低(圖1)。

2.3 上調(diào)Numb表達(dá)對細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞儀分析顯示，實(shí)驗(yàn)組中G0/G1期細(xì)胞的比例(%)為49.76±7.07，明顯高于陰性對照組的36.52±3.32和空白對照組的38.21±2.06，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=7.17，P=0.03)。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)組的S期細(xì)胞比例和增殖指數(shù)均降低(P<0.05，表1，圖2)。這表明上調(diào)Numb基因可以增加G0/G1期細(xì)胞比例，減少S期細(xì)胞比例，降低細(xì)胞的增殖指數(shù)。

表1 流式細(xì)胞技術(shù)檢測各組細(xì)胞

2.4 上調(diào)Numb表達(dá)對細(xì)胞增殖的影響

實(shí)驗(yàn)組在24 h的吸光度值為0.35±0.08，明顯低于陰性對照組0.52±0.06和空白對照組0.55±0.04(F=9.03,P=0.02)；同樣，實(shí)驗(yàn)組在48 h和72 h的吸光度也明顯低于兩對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.01，表2)。根據(jù)MTS法的實(shí)驗(yàn)原理，在490nm的吸光度(A490)值與活細(xì)胞的數(shù)量呈線性關(guān)系，即A490值越大則代表的活細(xì)胞數(shù)量越多。這表明實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞增殖減弱。

圖2 流式細(xì)胞技術(shù)分析各組細(xì)胞周期分布圖

組別0h24h48h72h實(shí)驗(yàn)組0.18±0.040.35±0.080.68±0.160.92±0.31陰性對照組0.16±0.030.52±0.061.24±0.232.02±0.36空白對照組0.17±0.020.55±0.041.38±0.181.96±0.27F值0.319.0311.1311.53P值0.740.020.010.01

3 討 論

膀胱癌是泌尿外科常見的惡性腫瘤，發(fā)病率長期位居我國泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤的首位[9-10]。近年來，隨著社會工業(yè)化程度提高和環(huán)境污染等因素，膀胱癌的發(fā)病率仍在逐年提高[2]。臨床上不同TNM分期的膀胱癌患者，預(yù)后差別很大[9-10]。在TNM分期中，T分期是衡量腫瘤體積大小的指標(biāo)，而腫瘤的大小與腫瘤細(xì)胞的增殖能力是密切相關(guān)的。因此，研究Numb基因?qū)Π螂装┘?xì)胞周期和增殖能力的影響，將有助于從分子水平認(rèn)識膀胱癌發(fā)生發(fā)展的原因，有益于膀胱癌患者的臨床治療和預(yù)后。

現(xiàn)有研究表明，腫瘤的形成與進(jìn)展是多因素交互的結(jié)果，基因?qū)W的改變在其中發(fā)揮了重要作用[11-12]。Numb基因是新近發(fā)現(xiàn)的腫瘤相關(guān)基因，廣泛存在于從果蠅到哺乳動(dòng)物及人類的各層級生物體內(nèi)[1，6]。前期研究發(fā)現(xiàn)，Numb蛋白的不同表達(dá)強(qiáng)度決定了子代細(xì)胞不同的分化命運(yùn)，因而Numb基因被定義為細(xì)胞命運(yùn)決定因子[5]。目前已有多篇研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)Numb基因的異常表達(dá)參與了人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Rennstam等[13]利用免疫組化技術(shù)檢測241例乳腺癌組織標(biāo)本發(fā)現(xiàn)乳腺癌中Numb表達(dá)降低，并且減低程度與乳腺癌的侵襲性相關(guān)，提示Numb在乳腺癌中可能發(fā)揮抑癌因子作用。Wu等[14]對肝細(xì)胞癌中的Numb基因進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在肝癌病理組織中Numb基因高表達(dá)，且高表達(dá)的Numb基因與患者的不良預(yù)后具有相關(guān)性，提示Numb基因在肝癌中可能發(fā)揮促癌作用。根據(jù)前期文獻(xiàn)我們發(fā)現(xiàn)在不同類型的腫瘤中Numb基因的生物學(xué)作用不盡相同，有時(shí)作為抑癌因子，有時(shí)發(fā)揮促癌作用，因此Numb基因在膀胱癌中的作用尚須明確。本研究在前期工作基礎(chǔ)上，通過Numb基因?qū)θ税螂装┘?xì)胞周期和增殖能力的影響，進(jìn)一步探討Numb基因在人膀胱癌中的作用和相關(guān)機(jī)制。

惡性腫瘤共性的生物學(xué)特點(diǎn)是細(xì)胞周期紊亂所致的異常細(xì)胞增殖，同時(shí)細(xì)胞增殖強(qiáng)度也影響著腫瘤的大小和以此為依據(jù)的臨床T分期[15]。Cyclin D1是一個(gè)負(fù)責(zé)細(xì)胞周期調(diào)控的重要蛋白質(zhì)，其表達(dá)與細(xì)胞增殖密切相關(guān)[16]。生理情況下，Cyclin D1負(fù)責(zé)調(diào)控細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期；當(dāng)Cyclin D1表達(dá)過量時(shí)，會促使G1期細(xì)胞向S期轉(zhuǎn)化，縮短細(xì)胞周期，加速增殖，這也是腫瘤組織迅速生長的原因之一。Lima等[16]研究發(fā)現(xiàn)Cyclin D1在膀胱癌病理組織中表達(dá)升高，而且其表達(dá)量與腫瘤的大小、分期、分級等臨床指標(biāo)呈統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性，降低Cyclin D1表達(dá)水平將有利于膀胱癌患者獲得更好的預(yù)后轉(zhuǎn)歸。本研究中我們使用體外質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)，在膀胱癌5637細(xì)胞中過表達(dá)Numb基因，檢測細(xì)胞周期和增殖活力的變化。我們發(fā)現(xiàn)過表達(dá)Numb基因可以促使膀胱癌細(xì)胞的G0/G1期比例升高，降低S期比例，抑制腫瘤細(xì)胞的G1/S期轉(zhuǎn)化，減低細(xì)胞增殖指數(shù)。眾所周知，S期是細(xì)胞DNA的合成期，是為細(xì)胞有絲分裂進(jìn)行遺傳物質(zhì)準(zhǔn)備的時(shí)期，處于S期細(xì)胞的比例降低意味著能夠進(jìn)行有絲分裂增殖的細(xì)胞減少[4]。在細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中我們也觀察到，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的增殖活力顯著低于對照組。

為了進(jìn)一步探討Numb基因?qū)Π螂装┘?xì)胞周期和增殖調(diào)控的可能機(jī)制，我們檢測了與增殖相關(guān)的細(xì)胞周期蛋白 D1的表達(dá)，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組中Cyclin D1的表達(dá)下降。Flores等報(bào)道了Numb基因可以與膜受體Notch信號相互作用，抑制Notch信號通道的活化及下游效應(yīng)因子的表達(dá)[17]。我們前期在膀胱癌的研究中已證實(shí)：Notch信號的活性是通過介導(dǎo)細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子Hes1從而向下傳導(dǎo)影響下游的效應(yīng)分子表達(dá)[10]。同時(shí)也有文獻(xiàn)證實(shí)，Cyclin D1就是Notch信號通道下游的效應(yīng)因子之一[18]。因此，綜合這些間接證據(jù)我們可以推論Numb基因可抑制Notch信號通路的活化，受抑制的Notch信號可影響Cyclin D1的表達(dá)。由此我們預(yù)測Numb基因似乎是通過Notch信號通路途徑抑制了Cyclin D1的表達(dá)，影響細(xì)胞周期和抑制細(xì)胞增殖，今后我們將繼續(xù)研究證實(shí)這一觀點(diǎn)。綜上，本研究發(fā)現(xiàn)Numb基因可以負(fù)性調(diào)節(jié)Cyclin D1的表達(dá)促使膀胱癌細(xì)胞發(fā)生G0/G1期阻滯，抑制細(xì)胞增殖，提示Numb基因在膀胱癌中可能發(fā)揮抑癌基因作用，有可能成為新型的腫瘤標(biāo)志物或潛在的抗腫瘤藥物靶點(diǎn)。

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Effect of Numb Gene on Cell Cycle and Proliferation in Human Bladder Cancer 5637 Cells*

Sima Jin1, Zhang Bao1△, Ai Qing2, et al

(1.DepartmentofUrology,AerospaceCenterHospital,Beijing100049,China； 2.KeyLaboratoryofUrologicalDiseases，GeneralHospitalofChinesePeople’sLiberationArmy，Beijing100053,China)

Objective: To study the effect of Numb gene on cell cycle and proliferation in human bladder cancer cells and its related mechanism. Methods: Human bladder cancer 5637 cells which were transfected by the Numb-ORF plasmid were used as the experimental group. The negative control and blank control were also set. The expression of Numb or Cyclin D1 was detected by Real-Time PCR and Western Blot. The cell cycle was analyzed by Flow cytometry. Cell proliferation was assessed by comparing with absorbance at 490nm using a Micro-plate Reader. Results: Compared with the negative control (5.66±0.53) and blank control (5.81±0.47), the △CTvalue of Numb in the Numb-ORF group (1.58±0.41) was significantly lower (F=77.39，P=0.00). Meanwhile, the △CT value of Cyclin D1 in the Numb-ORF group (4.92±0.73) was significantly higher than that in the negative control (2.59±0.33) and blank control (2.45±0.26) (F=11.70，P=0.01). The ratio (%) of G0/G1cells was as follows: Numb-ORF group was 49.76±7.07, negative control was 36.52±3.32 and blank control was 38.21±2.06 (F=7.17，P=0.03). In proliferation assay, compared with negative control (0.52±0.06) and blank control (0.55±0.04), the OD value at 24h in Numb-ORF group (0.35±0.08) was significantly reduced (F=9.03,P=0.02). Conclusion: Numb gene could promote G0/G1phase arrested and inhibit proliferation of bladder cancer cells, the suppressive effects may be due to down-regulation of Cyclin D1.

Bladder Neoplasm; Numb Gene; Cyclin D1

2015- 10- 09

2016- 01- 09

*國家自然科學(xué)基金(81100561)

司馬晉，男，山西運(yùn)城人，碩士研究生，主治醫(yī)師，主要研究方向：泌尿系腫瘤的基礎(chǔ)和臨床研究。

△張 保，主任醫(yī)師，E-mail:baoztj@sina.com

R737.14；R730.2

A

10.3969/j.issn.1674- 0904.2016.01.001

?應(yīng)用基礎(chǔ)研究?