一類申報新藥雷騰舒工作對照品核磁共振定量分析方法的建立

賈國慧++呼海濤

摘要 目的：建立一類申報新藥雷騰舒工作對照品的核磁共振定量方法。方法：以咖啡因為內(nèi)標(biāo)，采用核磁共振定量法對雷騰舒樣品進(jìn)行定量。結(jié)果：本方法三個不同濃度水平的樣品平均回收率為99.87%，RSD0.76%。重復(fù)性考察RSD為0.53%。日間精密度考察RSD為0.20%。結(jié)論：所建立的核磁共振定量方法，簡便、快速、準(zhǔn)確性、重復(fù)性好，可作為該新藥工作對照品定量的方法之一。

關(guān)鍵詞 核磁共振定量法 雷騰舒 工作對照品賦值

中圖分類號：TQ460.72； 0657.2

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1006-1533（2016）01-0072-03

隨著我國新藥研究的發(fā)展，企業(yè)研發(fā)人員需要為開發(fā)的新藥制備工作對照品并進(jìn)行定量的情況越來越多。為確保定量的可靠性，往往需要用多種不同原理來建立定量方法。通過不同方法所測數(shù)據(jù)的差異，對工作對照品定量的準(zhǔn)確性與可靠性進(jìn)行確認(rèn)。常用的方法豐要包括色譜扣除法（質(zhì)量平衡法）和容量分析方法等，然而對于有些沒什么滴定活性基團(tuán)的化合物，往往很難找到合適的容量分析方法。

本研究為擬申報化學(xué)11類新藥雷騰舒（研發(fā)代號T8，目前已在II期臨床評價階段，圖1）藥學(xué)研究中的一部分，按照新藥研究指導(dǎo)原則，須采用不同原理的方法對其工作對照品進(jìn)行定量（賦值）研究。在我們完成質(zhì)量平衡法評估后，希望采用經(jīng)典的容量分析方法進(jìn)行比對研究。然而通過對本品結(jié)構(gòu)、性質(zhì)的深入分析，發(fā)現(xiàn)其結(jié)構(gòu)中存在的3類可能的可滴定基團(tuán)（環(huán)氧基、羥基、內(nèi)酯環(huán)）都很難設(shè)計量化方案。分析如下。

①環(huán)氧基結(jié)構(gòu)中存在的三個環(huán)氧結(jié)構(gòu)單元，各自的化學(xué)環(huán)境不盡相同，難以量化反應(yīng)程度。②羥基結(jié)構(gòu)中有兩個羥基，一個為二級羥基、另一個為三級羥基。二級羥基雖可通過與醋酐反應(yīng)?；螅脡A滴定牛成的醋酸，從而完成定量，但前提是須確保?；耆?。即使可以酰化完全，醋酐也很容易使三級羥基脫水，從而干擾定量結(jié)果。③內(nèi)酯環(huán)該基團(tuán)理論上可與堿反應(yīng)，先加成再脫去-OR，但因本品內(nèi)酯環(huán)上同時存在雙鍵，會導(dǎo)致1、2加成與l、4加成同時存在，很難量化。預(yù)試驗結(jié)果也證實了上述分析。

面對上述問題，如何選擇更加便捷、可靠的賦值方法成為我們在新藥申報中必須考慮的問題。通過調(diào)研，我們發(fā)現(xiàn)采用已知含量的其他化合物做內(nèi)標(biāo)的定量核磁方法可以很好地解決我們所面臨的問題。方法具有專屬性好、無需已知含量自身對照品的技術(shù)特點。

為了建立并驗證該方法在新藥一雷滕舒樣品定量上的可行性，我們對該方法進(jìn)行了研究，并獲得了準(zhǔn)確性、重復(fù)性良好的結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 儀器

核磁共振儀（德國布魯克，Ascend 400）。天平（瑞士梅特勒，XP56，百萬分之一）。

1.2 試藥

雷騰舒（本公司自制，批號：235-61、20080102）；咖啡因（Alfa公司，含量99.6%）；氘代乙腈、氘代吡啶（J&K Scientific Ltd.）；氘代二甲亞砜（Cambridge Isotope Laboratories. Inc.）。

1.3 樣品制備與計算

精密稱定咖啡因（約4mg）及本品（約6mg）適量至2ml量瓶，以氘代乙腈溶解并定容至刻度，搖勻，取約0.5ml到核磁管，上樣測定。分別記錄化學(xué)位移值為3.345、3.358組峰（T8）的面積和化學(xué)位移值為3.274峰（咖啡因）的峰面積，按下述公式計算。

A_{1/A2=n1W1/M1/（n2W2/M2）}

其中A_{1為T8定量峰的面積、A2為內(nèi)標(biāo)咖啡因定量峰的面積；}

n_{1為T8定量峰氫質(zhì)子數(shù)（n1=1），n2為咖啡因定量峰氫質(zhì)子數(shù)（n2=3）；}

W_{1為T8測定量，W2為咖啡因稱樣量，M1、M2分別為T8、咖啡因的分子量。}

1.4 核磁共振儀條件設(shè)置

核磁共振儀：2930序列，共振頻率400兆赫，磁場強(qiáng)度9.4T，弛豫時間12s，中心頻率3.31ppm。

2 結(jié)果

2.1 方法的重復(fù)性

采用本法對經(jīng)干燥的T8樣品（批號：235-61）平行測定5次，考察方法的重復(fù)性（表1）。結(jié)果表明，RSD小于2，方法重復(fù)性很好。

2.2 方法的重現(xiàn)性

為了考察方法的重現(xiàn)性，我們在不同日期，對上述T8樣品進(jìn)行了測定，經(jīng)計算方法重現(xiàn)性好（表2）。

2.3 方法的準(zhǔn)確度

采用上述方法，對方法準(zhǔn)確度進(jìn)行考察。取經(jīng)干燥的T8原料（批號：235-61）4、6、8mg，精密稱定，分別置于2ml量瓶中，再分別加入精密稱定的4mg咖啡因，用氘代乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，吸取0.5ml至核磁管中，測定。從平均回收率和RSD值可見該方法準(zhǔn)確度非常好（表3）。

2.4 與質(zhì)量平衡法數(shù)據(jù)的比較

采用本法和質(zhì)量平衡法分別檢測了批號為20080102的T8樣品。本法測定結(jié)果：99.20%、質(zhì)量平衡法測定結(jié)果：99.56%。兩種方法測定結(jié)果基本一致。

3 討論

工作對照品定量（賦值）是研發(fā)工作中經(jīng)常遇到的問題。在追求真值的過程中，需要多種分析于段協(xié)同作用，綜合判斷。采用核磁共振儀進(jìn)行定量，提供了不同原理定量的義一方法。該方法的定量研究，國內(nèi)外已有報道，其工作原理也在多國藥典上有詳述，但在新藥附值研究的實際應(yīng)用方面報道不多。

我們在方法建立過程中發(fā)現(xiàn)，內(nèi)標(biāo)選擇、樣品前處理、儀器參數(shù)設(shè)置等因素，都會對檢測結(jié)果產(chǎn)牛影響，須關(guān)注。

以本研究為例，我們篩選了多個化合物，最終選定了咖啡因（圖1）作為內(nèi)標(biāo)物。因為咖啡因結(jié)構(gòu)中氫的磁場環(huán)境比較簡單，可找到與本研究被測物峰位不干擾且場位比較接近的測量峰；另外，經(jīng)考察，咖啡因在我們選定的溶解樣品的溶劑氘代乙腈中非常穩(wěn)定而且不會與被測物反應(yīng)。這些特點保障了測定結(jié)果的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

新藥賦值研究中，節(jié)約樣品和選擇合適的溶解樣品的溶劑也是我們方法設(shè)計中不得不考慮的問題。為篩選到樣品溶解度高、穩(wěn)定性好、且對測定無干擾的溶劑，我們分別考察了氘代二甲亞砜、氘代吡啶、氘代乙腈三種溶劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，氘代二甲亞砜為溶劑，雖然可滿足溶解度高、溶劑干擾少、樣品穩(wěn)定性好等要求，但重復(fù)性、線性結(jié)果不穩(wěn)定，無法達(dá)到預(yù)期的定量要求。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，為節(jié)省樣品與氘代試劑，我們在試驗方案中選用了1ml量瓶進(jìn)行定容，由于氘代二甲亞砜黏度大，容易導(dǎo)致定量誤差，使測定結(jié)果重現(xiàn)性不好。為此，我們換用氘代吡啶作為溶解溶劑對方法進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)T8在氘代吡啶中不穩(wěn)定，放置后溶液顏色會發(fā)牛變化，測定結(jié)果可靠性差。通過這兩次溶解溶劑對測定結(jié)果的影響，我們重新分析了T8的溶解度、穩(wěn)定性，最終選擇氘代乙腈為溶劑，獲得了比較理想的結(jié)果。

此外，儀器的參數(shù)設(shè)置，也是影響數(shù)據(jù)穩(wěn)定性的重要因素，特別是中心頻率、弛豫時間、掃描次數(shù)的設(shè)定。合適的中心頻率（參數(shù)OI）的選擇，可使脈沖對各定量峰強(qiáng)度的影響差異最小。另外，須考察弛豫時間、掃描次數(shù)對外加標(biāo)準(zhǔn)和待測物響應(yīng)穩(wěn)定性的影響，以確定最佳參數(shù)。

綜上，在新藥開發(fā)過程中無法獲得標(biāo)準(zhǔn)品對照的情況下，采用核磁定量法對企業(yè)自制工作對照品進(jìn)行純度分析與賦值，是不同原理進(jìn)行純度評估的新選擇。其優(yōu)點除簡單、快捷之外，還具有不需要已知含量待測樣品的對照品，僅需要已知含量的普通化學(xué)品的特點。這很好地解決了新藥工作對照品賦值研究中無對照品的問題，且測定數(shù)據(jù)可靠性好。