小麥?zhǔn)召忂^程中嘔吐毒素檢測(cè)方法的探討

徐存寬　薛云才　孫寶勝

泰州市糧油質(zhì)量監(jiān)測(cè)所　江蘇泰州　225300

小麥?zhǔn)召忂^程中嘔吐毒素檢測(cè)方法的探討

徐存寬薛云才孫寶勝

泰州市糧油質(zhì)量監(jiān)測(cè)所江蘇泰州225300

目前對(duì)嘔吐毒素國內(nèi)常用的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法、酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒和膠體金快速定量法等。膠體金快速定量法無需大型儀器、檢測(cè)速度快、成本較低，但精度較低，這在小麥?zhǔn)召彫F(xiàn)場(chǎng)是可以接受的，比較適合于收購糧食過程中嘔吐毒素的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，控制好入庫小麥的嘔吐毒素含量。

小麥嘔吐毒素檢測(cè)

嘔吐毒素主體成分為DON（deoxynivalenol，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇），屬于單端孢霉烯族化合物，主要由禾谷鐮刀菌、尖孢鐮刀菌、串珠鐮刀菌、擬枝孢鐮刀菌、粉紅鐮刀菌、雪腐鐮刀菌等鐮刀菌產(chǎn)生。由于它可以引起豬的嘔吐，故又名嘔吐毒素。研究表明，DON化學(xué)性能非常穩(wěn)定，一般不會(huì)在加工、儲(chǔ)存以及烹調(diào)過程中破壞，121℃高壓加熱25min僅有少量破壞，烘焙溫度210℃，油煎溫度140℃、或煮沸，只能破壞50%。含有嘔吐毒素谷物類加工產(chǎn)品，在加工過程中，由于技術(shù)限制不可能完全去除，人食用含有一定量嘔吐毒素糧油食品后，會(huì)出現(xiàn)胃部不適、眩暈、腹脹、頭痛、惡心、嘔吐，手足發(fā)麻、全身乏力、顏面潮紅、以及食物中毒性白細(xì)胞缺乏癥。嘔吐毒素主要通過胃腸道吸收，經(jīng)血液循環(huán)進(jìn)入肝臟代謝后經(jīng)腎臟隨尿液排出，造成各器官的廣泛損傷。它在人體中的半衰期為2～4h，代謝迅速，8h后就檢測(cè)不到嘔吐毒素和它的代謝物。

嘔吐毒素可在人和動(dòng)物體內(nèi)蓄積，具有致畸性、神經(jīng)毒性、胚胎毒性和免疫抑制作用。嘔吐毒素的產(chǎn)毒菌株適宜在陰涼、潮濕的條件下生長，廣泛存在于大麥、小麥、玉米和燕麥中。

我國《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中真菌毒素限量》中規(guī)定，小麥粉、小麥中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇限量標(biāo)準(zhǔn)為1000μg/kg。

由于嘔吐毒素對(duì)人體具有較大的傷害，近年來相關(guān)部門加大了對(duì)市場(chǎng)中面粉等食品的嘔吐毒素含量檢測(cè)，在檢測(cè)中一些面粉加工企業(yè)的部分批次產(chǎn)品被檢出嘔吐毒素含量超標(biāo)，相關(guān)產(chǎn)品面粉加工企業(yè)只能回收處理，給企業(yè)造成較大的損失。而面粉中的嘔吐毒素主要來自于小麥，且在面粉加工過程中，對(duì)嘔吐毒素沒有有效的去除方法，只能通過控制小麥中的嘔吐毒素含量來保證面粉中的嘔吐毒素含量不超標(biāo)。因此面粉加工企業(yè)紛紛加強(qiáng)了對(duì)采購小麥的嘔吐毒素含量控制。

從保障人民健康、食品安全的角度來看，作為糧食收購第一線的糧庫，在小麥的收購過程中就應(yīng)控制好入庫小麥的嘔吐毒素含量。目前，糧庫在收購過程中主要是通過控制小麥樣品的赤霉病率，來間接控制嘔吐毒素含量，這種方法準(zhǔn)確性較差，特別在赤霉病高發(fā)的年份，更是難以操作。目前對(duì)嘔吐毒素國內(nèi)常用的檢測(cè)方法主要有以下幾種：高效液相色譜法、酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒、膠體金快速定量法等。

1　高效液相色譜法

1）主要儀器與試劑

高效液相色譜儀；天平（感量0.001g）；粉碎機(jī)；均質(zhì)器；精密移液器；免疫親和柱；甲醇；聚乙二醇。

2）嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

臨用前將10mg/kg儲(chǔ)存標(biāo)準(zhǔn)品，用流動(dòng)相逐步稀釋配置成適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

3）色譜條件

C18色譜柱（150mm×4.6mm）；流動(dòng)相：甲醇+水（20+80）；流速：0.8mL/min；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：50μL，檢測(cè)波長：218nm。

4）提取凈化

準(zhǔn)確稱取25.00g均勻樣品于250mL規(guī)格具塞三角燒瓶中，加5.00g聚乙二醇，加125mL去離子水，于往復(fù)式振蕩器劇烈震蕩20min。用快速濾紙過濾，收集濾液（≥10mL）于15mL刻度塑料離心管中；再將濾液經(jīng)微纖維濾紙過濾，收集濾液于新塑料離心管中作為上樣液。取2.5mL上清液以1～2滴/s的速率將其通過免疫親和柱，直至空氣吹出柱內(nèi)的全部液體，再用10mL去離子水以1～2滴/s的速率洗滌親和柱，直至空氣吹出柱內(nèi)的全部液體。最后用2mL甲醇以1滴/s流速的淋洗親和柱，收集濾液于玻璃試管中，在50～60℃加熱條件下氮?dú)獯蹈?，然后用流?dòng)相復(fù)溶。用高效液相色譜進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)峰保留時(shí)間定性，根據(jù)峰面積外標(biāo)法定量。

高效液相色譜法檢測(cè)嘔吐毒素的優(yōu)點(diǎn)是：檢測(cè)的準(zhǔn)確性高，李輝章等人的研究結(jié)果顯示，嘔吐毒素在0.5～8.0mg/kg內(nèi)線性關(guān)系好，相關(guān)系數(shù)為0.999；在0.5、2.0和8.0mg/kg的加標(biāo)水平下，回收率為95.1%～102.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.8%～6.4%。缺點(diǎn)是：需要使用大型儀器；檢測(cè)中使用的耗材成本高；整個(gè)檢測(cè)過程大概需要3～4h，相對(duì)于收購而言檢測(cè)時(shí)間過長。所以高效液相色譜法適用對(duì)大批量小麥嘔吐毒素含量的精確測(cè)定。

2　酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒

酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒是利用間接酶聯(lián)免疫進(jìn)行檢測(cè)。樣品中游離的嘔吐毒素與包被在微孔中的抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合游離單克隆抗體上的結(jié)合位點(diǎn)，形成抗原體結(jié)合物，經(jīng)洗板后，加入酶標(biāo)記的二抗與單克隆抗體結(jié)和，經(jīng)再次洗板后加入顯色劑與反應(yīng)底物，其與酶標(biāo)物作用而成藍(lán)色，加入反應(yīng)停止液后顏色由藍(lán)色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色，黃色越深則表明嘔吐毒素越少.用酶標(biāo)儀在450nm處測(cè)定光吸收值，從而定量檢測(cè)樣品中的嘔吐毒素污染水平。

1）主要儀器與試劑

酶標(biāo)儀、恒溫培養(yǎng)箱、移液器、嘔吐毒素酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒。

2）測(cè)定步驟

①根據(jù)樣品檢測(cè)數(shù)插入相應(yīng)數(shù)量的酶標(biāo)板微孔于反應(yīng)板支架上，標(biāo)記好標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣品孔，然后加入200μL左右稀釋好的洗滌液，放置lmin，倒掉液體后拍干。

②在標(biāo)準(zhǔn)品孔中加入50μL各濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，在樣品孔中加入50μL樣品液。每孔都加入50μL稀釋后的DON抗體溶液，混合搖勻，在37℃恒溫箱中孵育60min。

③孵育結(jié)束后甩掉微孔中的液體，然后每孔加入250μL稀釋后的洗滌波，放置lmin倒掉液體，重復(fù)洗滌3次，倒掉液體后用力拍干。每孔加入l00μL稀釋后的酵標(biāo)二抗溶液，在37℃恒溫箱中孵育30min。

④孵育結(jié)束后甩掉微孔中的液體，每孔加入250μL稀釋后的洗滌波，放置lmin倒掉液體，重復(fù)洗滌3次，倒掉液體后用力拍干。每孔分別加入50μL顯色劑和50μL反應(yīng)底物，輕輕搖勻，在37℃恒溫箱中顯示反應(yīng)15min。

⑤顯色反應(yīng)結(jié)束后每孔加入50μL終止液，用酶標(biāo)儀在450nm處進(jìn)行測(cè)定（必須在加入終止液后10min內(nèi)完成測(cè)定）。

⑥用酶標(biāo)儀在450nm處測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)品孔的光吸收值（A）以及對(duì)應(yīng)濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.通過標(biāo)準(zhǔn)曲線，定量樣品中嘔吐毒素含量。

酶聯(lián)免疫法測(cè)嘔吐毒素的優(yōu)點(diǎn)是：檢測(cè)中不需要使用大型儀器；檢測(cè)的成本較低。缺點(diǎn)是：檢測(cè)的準(zhǔn)確性低，楊丹妮等人的研究結(jié)果表明，小麥樣品提取后直接過濾后進(jìn)行ELISA檢測(cè)的回收率較高，在75%以上，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在 4.7%～10.6%，酶聯(lián)免疫法檢測(cè)的準(zhǔn)確性低于高效液相色譜法。檢測(cè)過程中需要進(jìn)行精確加注試劑，恒溫箱孵化，洗板等過程，操作比較繁瑣，整個(gè)檢測(cè)過程需要2～3h，不太適用收購現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

3　膠體金快速定量法

本文的膠體金快速定量法是以charm公司的ROSAFAST5嘔吐毒素快速定量檢測(cè)條為例?？焖俣繖z測(cè)條法的原理為免疫層析法，使用水提取樣品中的嘔吐毒素，提取物與有顏色的微粒反應(yīng)，以讀數(shù)儀讀取檢測(cè)區(qū)的顏色強(qiáng)度，并將結(jié)果換算為樣品中的嘔吐毒素濃度。

1）主要儀器與試劑

ROSA孵育器（45℃）、ROSA-M讀數(shù)儀、離心機(jī)、天平、FAST5嘔吐毒素快速定量檢測(cè)條。

2）樣品制備

稱取10g混勻后的樣品至干凈的錐形瓶中，加入50mL去離子水；劇烈震蕩30s后靜置1min，獲得提取物；用一次性吸管吸取1mL提取物至離心管中，離心機(jī)5000r/min速度，離心1min；移取100μL離心后的提取液至干凈的離心管中，加入1mL DONQ-FAST5稀釋緩沖液，即“稀釋的提取液”；移取300μL稀釋的提取液至干凈的離心管中，加入1mLDONQ-FAST5稀釋緩沖液混勻，即2次稀釋的提取液。

3）檢測(cè)步驟

將檢測(cè)條放入ROSA-M孵育器，平底一側(cè)朝上。一邊使檢測(cè)條保持在孵育器內(nèi)，一邊小心揭開粘膜至指示線處，使樣品槽暴露；移液器保持豎直，加入300uL稀釋的提取液至樣品室，重新封上粘膜；操作下一檢測(cè)條蓋上孵育器蓋子并鎖定，紅色計(jì)時(shí)指示燈亮，開始倒計(jì)時(shí)；孵育器孵育5min，不要超過7min；取出檢測(cè)條，判讀檢測(cè)是否有效，判讀結(jié)果之前，將檢測(cè)條樣品室一端向下放置。將干凈，有效的檢測(cè)條插入ROSA-M讀數(shù)儀；選取DON頻道，并選擇相應(yīng)的樣品類型（MATRIX01），按ENTER讀取結(jié)果。MATRIX01：檢測(cè)的范圍為1000～6000μg/kg，比較適合于小麥現(xiàn)場(chǎng)收購的嘔吐毒素檢測(cè)。

膠體金快速定量法檢測(cè)嘔吐毒素的優(yōu)點(diǎn)是：檢測(cè)中不需要使用大型儀器；檢測(cè)的速度快，在操作熟練的基礎(chǔ)上樣品可在10min內(nèi)檢測(cè)出結(jié)果；檢測(cè)的成本較低。缺點(diǎn)是：檢測(cè)的精度較低，袁克等人的研究表明，其檢測(cè)精度與酶聯(lián)免疫法比較接近，低于高效液相色譜法。但這個(gè)缺點(diǎn)在收購現(xiàn)場(chǎng)的檢測(cè)中是可以接受的。

綜上所述，膠體金快速定量法具有明顯的速度優(yōu)勢(shì)，較低的檢測(cè)成本，可以接受的檢測(cè)精度，比較適合收購現(xiàn)場(chǎng)對(duì)嘔吐毒素的快速檢測(cè)。

艾蘭虹的研究表明，控制小麥赤霉病含量≤3%，可確保小麥嘔吐毒素含量符合國家糧食衛(wèi)生指標(biāo)規(guī)定。在收購過程中，糧庫可結(jié)合實(shí)際檢測(cè)結(jié)果對(duì)赤霉病含量確定一個(gè)限量，對(duì)赤霉病超過限量的小麥，在現(xiàn)場(chǎng)用膠體金快速定量法檢測(cè)嘔吐毒素含量，檢測(cè)合格的小麥方可入庫，而檢測(cè)不合格的小麥，則作為飼料糧另外存放或由售糧人自行處理，保證入庫小麥嘔吐毒素含量不超標(biāo)。除收購過程中把好關(guān)，每天收購結(jié)束對(duì)倉房?jī)?nèi)小麥應(yīng)抽取綜合樣，在有條件的情況下用高效液相色譜法準(zhǔn)確測(cè)定嘔吐毒素含量，也可用酶聯(lián)免疫法或膠體金快速定量法進(jìn)行檢測(cè)。及時(shí)了解倉房?jī)?nèi)整個(gè)小麥嘔吐毒素含量，并根據(jù)檢測(cè)結(jié)果在接下來的收購過程中及時(shí)調(diào)整嘔吐毒素的控制量。在整倉收購?fù)瓿珊螅捎酶咝б合嗌V法準(zhǔn)確測(cè)定嘔吐毒素含量，作為以后相關(guān)驗(yàn)收及銷售的憑證。

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TS211.2，TS211.7

B

1674-5280（2016）04-0027-03

2016-06-02

徐存寬（1981—），男，本科，工程師，主要從事糧油檢測(cè)工作。