豬圓環(huán)病毒2型檢測技術研究進展

宋大賀，孫曉飛，賈　赟，孫　燕

（1.大連機場出入境檢驗檢疫局，遼寧　大連　116001；2.遼寧出入境檢驗檢疫局，遼寧　大連　116001；3.大連森林動物園，遼寧　大連　116000)

豬圓環(huán)病毒2型檢測技術研究進展

宋大賀1，孫曉飛2，賈赟2，孫燕3

（1.大連機場出入境檢驗檢疫局，遼寧大連116001；2.遼寧出入境檢驗檢疫局，遼寧大連116001；3.大連森林動物園，遼寧大連116000)

豬圓環(huán)病毒?。≒orcine Circovirus Diseases，PCVDs）的臨床特征和系統(tǒng)病理損傷與其他疾病十分相似，很難根據(jù)臨床癥狀做出正確的診斷，因此實驗室對豬圓環(huán)病毒2型（Porcine Circovirous Type2，PCV2）的檢測結果成為了診斷的重要依據(jù)之一，本文將對實驗室檢測PVC2經(jīng)常采用的血清學和分子生物學檢測技術進行概述與比較。

PCV2；檢測技術；血清學；分子生物學

1　豬圓環(huán)病毒的病原學特征

豬圓環(huán)病毒（porcine circovirous，PCV）屬于圓環(huán)病毒科、圓環(huán)病毒屬，其直徑約12～23 nm，呈二十面體對稱，無囊膜，共價鍵閉合，為單股環(huán)狀DNA病毒，相對分子量為36 kDa，是已知最小的動物病毒[1-2]，PCV根據(jù)致病性、抗原性和基因序列差異，將PCV分為PCV1和PCV2兩型。研究表明，PCV1暫不具有治病性，而PCV2則具有較強的治病性，通常被認為是引起與豬圓環(huán)病毒相關疾病的主要病原。PCV2主要分為PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d和PCV2e五種基因型亞群[3-4]，其中，PCV2a和PCV2b是主要類型，又因為PCV2b在自然感染中流行，所以PCV2b被認為致病性最強[5-7]。

2　PCV2的致病機理

PCV2的致病機理十分復雜，目前還沒有研究清楚，但是一些相關研究表明，單獨感染豬圓環(huán)病毒不足以引起仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS），必須有其他的因素參與才能發(fā)生[8-11]。PCV2降低宿主的免疫力的途徑很多，但主要為兩個方面：一方面，PCV2通過感染樹突細胞（DC）與其相互作用，利用DC的吞噬作用，使其變成PCV2的儲存和運輸?shù)拿浇?，然后通過釋放某種介質，干擾免疫淋巴細胞正常增殖，從而降低宿主的免疫能力[12]。另一方面，PCV2的ORF3編碼的非結構蛋白，可以通過級聯(lián)反應分別激活 caspase-8和caspase-3,誘發(fā)感染組織細胞凋亡引發(fā)相應組織器官發(fā)生功能性障礙。當機體受到不良環(huán)境刺激時則可引起動物機體發(fā)病[13]。又由于感染PCV2的豬群免疫低下，在飼養(yǎng)環(huán)境改變和長途運輸?shù)葢l件下更容易感染其他疾病，從而誘發(fā)混合感染[14]。

3　PCV2的血清學方法

3.1酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）ELISA是在檢測PCV2方法中，使用最廣的血清學方法，并且競爭ELISA、間接ELISA和抗原捕獲ELISA都適用于PCV2的檢測。Nawagitgul等[15]建立了以細胞培養(yǎng)的PCV2全病毒作為抗原（PCV2-ELI-SA）和以ORF2重組桿狀病毒表達產(chǎn)物作為包被抗原（ORF2-ELISA）檢測PCV2全病毒抗體的間接ELISA，并且這種方法在實驗室已經(jīng)被普遍使用。Walker等[16]利用PCV1和PCV2特異性單克隆抗體建立了競爭ELISA，并對來自英法等國家的484份感染PCV2的豬血清進行檢測，實驗結果表明：采用該方法病毒抗體檢出率達到99%以上。Mc-Nei l ly等[17]以PCV2特異性單抗為工具建立了的抗原捕獲ELISA也能夠準確檢測PCV2。ELISA具有較高的敏感性和特異性，并且能夠一次性檢測大量血清樣品，因此非常適合血清學的大規(guī)模檢測調查。

3.2間接免疫熒光試驗（IFA）IFA，主要用于PCV分離效果鑒定及病變組織或豬源細胞 PCV2感染情況的檢測。蘆銀華等[18]利用IFA檢測法國內(nèi)幾個地區(qū)的規(guī)?；i場，進行血清調查，結果表明，PCV2陽性率達到59%，說明了我國豬群中廣泛流行PCV。同樣，陳慶新等[19]利用IFA對浙江杭州地區(qū)的28個豬場采集的1 677血清進行PCV2檢測，試驗結果表明，PCV2陽性率為55.48%，表明杭州地區(qū)大范圍感染PCV2.IFA具有成本低、準確和快速的特性，但因其操作復雜，所以很少能夠應用于現(xiàn)場臨床診斷。

3.3免疫過氧化物酶單層細胞試驗（IPMA）IPMA方法具有操作簡便、特異性和敏感度高等特點，是進行PCV2流行病學調查及血清抗體檢測的有效技術手段。黃立平等[20]用IPMA對黑龍江省、吉林省、河北省、上海市、遼寧省等地豬場送檢的257份血清樣品進行檢測，PCV1和PCV2血清抗體陽性檢出率分別為19.1%和80.5%，PCV1抗體陽性豬中有95.9%為 PCV2陽性，表明我國豬群已存在PCV2感染，并且在臨床上PCV1與PCV2多以混合感染形式存在。IPMA在檢測PCV2方面的應用已經(jīng)非常成熟，劉長明等[21]通過對IPMA反應條件的優(yōu)化，研制了一種新型的PVC2的診斷試劑盒，研究結果表明該試劑盒具有實用、高效和特異等特點。

3.4免疫組織化學技術（IHC）IHC可以對攜帶PCV2的細胞及組織的形態(tài)進行大體的評價，而且在普通顯微鏡下就可以進行觀察，是一種免疫染色法。唐寧等[22]利用IHC對PCV2人工感染豬進行全身監(jiān)測，試驗結果表明PCV2抗原陽性信號出現(xiàn)在淋巴組織（淋巴結、脾、扁桃體）、心、肝、肺、腎、胃、十二指腸、大腦及小腦內(nèi)。IHC具有定位準確、特異性強、操作簡單等特點，并且對試驗條件要求不高，檢測成本低，因此是許多實驗室首選的檢測手段。

4　PCV2的分子生物學方法

4.1核酸原位雜交技術（ISH）ISH應用于檢測組織切片中的DNA病毒，劉雯等[23]利用PCR地高辛探針合成的方法制備了長度為494 dp的特異性探針，并利用該探針建立了原位雜交組織切片檢測方法，應用該方法檢測PCV2感染豬的扁桃體和淋巴結組織，結果表明陽性信號主要存在于巨噬細胞胞漿中。Hamberg等[24]將IHC和ISH現(xiàn)結合建立一種檢測技術，可以區(qū)別組織切片中正在復制過程中的PCV2和非復制狀態(tài)的 PCV2。ISH具有特異性和敏感性，能夠準確反應PCV2在組織細胞中的狀態(tài)和分布，是為研究PCV2致病機理提供了有效的技術手段。

4.2聚合酶鏈反應技術（PCR）PCR是一種應用非常廣泛的分子生物學技術，其在醫(yī)學、食品學和遺傳育種學等研究方面被廣泛使用，而且隨著不斷地探索，研究者們建立了多種PCR方法來提高其使用效率。在檢測PCV2方面，經(jīng)常使用的PCR包括多重PCR、熒光定量PCR和RFLP-PCR。

4.2.1多重PCR多重PCR是指在一個PCR反應體系中，加入多種引物，擴增出多種DNA片段的技術，PCV常與其他病原混合感染引起嚴重癥狀，多重PCR可以一次性擴增出多種病原DNA片段，從而節(jié)省了對PCV與多種病原檢測的時間，為臨床診斷和防疫提供了幫助。王娟萍等[25]利用4對特異性引物，建立了PRRSV、PPV、PRV、PCV-2的四重PCR檢測方法，以及相互間的任意二重PCR和三重PCR檢測方法，并進行了特異性、敏感性和重復性試驗，試驗結果表明，建立的多重PCR的方法，具有較高的特異性和敏感性，可以同時準確檢測出PRRSV、PPV、PRV、PCV-2四種病毒。

4.2.2實時熒光定量PCR實時熒光定量PCR是一種定量分析的試驗技術，其簡化了定量檢測的過程，真正實現(xiàn)了絕對定量，其經(jīng)常被應用于許多難培養(yǎng)的病毒檢測診斷中，同時，也可以應用于潛伏期的病毒診斷。吳曉燕等[26]建立了針對PCV2 ORF2基因的SYBR GREENⅠ熒光定量PCR方法，并證明了該技術與與常規(guī)PCR相比提高了100倍的敏感性。實時熒光定量PCR與傳統(tǒng)PCR相比具有較高的敏感性和特異性，能夠實時監(jiān)測反應過程，縮短了PCV2臨床診斷的時間，同時為豬圓環(huán)病毒致病機理的研究提供了幫助。

4.2.3限制片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應（PFLP-PCR）PFLP-PCR是通過PCR擴增目的基因序列片段，然后用限制性內(nèi)切酶酶切，再通過凝膠電泳呈現(xiàn)不同的條帶，從而檢測PCV2病毒，并且通過酶切片段的差異從而鑒定不同的基因型。王新等[27]根據(jù)GenBank中PCV全基因序列設計引物，建立了PCV2的PCR-RFLP檢測方法，通過對PK-15細胞、IBRS-2細胞、PMWS和PDNS疑似病料進行了PCV檢測及血清型的鑒定，結果表明，1個IBRS2細胞和1個PMWS病料檢測出PCV1的基因片段，1個PMWS病料和1個PDNS病料檢測出PCV2基因片段，從而證明PFLP-PCR方法可以用于PCV2的檢測，并且能夠快速、準確鑒別診斷出是PCV1或/和PCV2的感染。

5　結語

PCV2極易被感染，其所引發(fā)的豬圓環(huán)病毒?。≒CVDs）在世界范圍內(nèi)廣泛流行，且致死率極高，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟損失，因此能夠及早發(fā)現(xiàn)并及時采取防控措施是減少損失的保證，但是針對PCV2的實驗室檢測方法雖然有很多種，可是受到成本和條件的影響，很多快速準確的檢測方法無法被廣泛使用。因此一種成本低廉操作簡便而快速準確的檢測方法，不僅可以為養(yǎng)豬企業(yè)減少了經(jīng)濟損失，而且為豬病的疫情防控工作提供了有力的支撐，為養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展提供了保障。

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Reserch Progress on Detection Method of Porcine Circovirous Type2

Song Dahe1,Sun Xiaofei2,Jia Yun3,Sun Yan3
(1.Dal ian Airpor t Ent ry-Exit Inspection and Qurantine Bureau,LiaoningDal ian116001; 2.Liaoning Ent ry-Exit Inspection and Qurantine Bureau,LiaoningDal ian116001 3.Dal ian Forest Zoo,LiaoningDalian116000)

The cl inical features and pathological injuries of porcine circovirus diseases are simi lar to other swine diseases.It is very dif f icul t to make the cor rect diagnosis according to clinlcal symptom,therefore,the detection resul t of PVC2 become the important basis to diagnosis PCVDS.this paper summarizes and compares the detection technology of PVC2 including serological and molecular biological detection technology,what are usual ly used in the lab.

Porcine Circovirous Type2;Detection technology;Serology;Molecular biology

S858.28

A

1672-9692(2016)04-0054-04

2016-02-11

宋大賀（1984-），男，碩士研究生，獸醫(yī)師，主要從事動植物檢疫工作。