副黏病毒反向遺傳研究進(jìn)展

冉旭華,劉陽陽,聞曉波

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,黑龍江 大慶 163319)

副黏病毒反向遺傳研究進(jìn)展

冉旭華,劉陽陽,聞曉波?

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,黑龍江 大慶 163319)

反向遺傳學(xué)是對(duì)已知的生物基因序列進(jìn)行適當(dāng)?shù)男揎椇透脑旌蟛@取相應(yīng)的表型,進(jìn)而研究基因的變化對(duì)表型的影響等。副黏病毒屬于單股負(fù)鏈RNA病毒,其反向遺傳研究對(duì)其病毒蛋白的功能、致病機(jī)理及重組病毒的開發(fā)利用具有重要的研究價(jià)值,本文綜述了副黏病毒反向遺傳近年來的研究進(jìn)展,為副黏病毒及單股負(fù)鏈RNA病毒的深入研究提供參考。

反向遺傳;副黏病毒;致病機(jī)制;病毒拯救

經(jīng)典遺傳學(xué)的研究規(guī)律是首先認(rèn)識(shí)生物的表征特點(diǎn),然后以此為基礎(chǔ)對(duì)遺傳物質(zhì)的差異性及進(jìn)化規(guī)律進(jìn)行研究。而反向遺傳學(xué)則是對(duì)已知生物基因序列進(jìn)行適當(dāng)?shù)男揎椇透脑觳@得相應(yīng)的表型,隨之發(fā)展而來的技術(shù)稱為反向遺傳技術(shù)。RNA病毒的反向遺傳的出現(xiàn)使得人們能夠在c DNA層面對(duì)RNA病毒進(jìn)行操作,為RNA病毒的生物學(xué)特性研究、致病機(jī)理研究以及重組疫苗載體研究開辟了新的道路。第一個(gè)成功拯救的RNA病毒是Qβ噬菌體［1],研究人員將含有噬菌體全基因c DNA克隆的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌,并成功拯救具有活性的Qβ噬菌體,該系統(tǒng)的構(gòu)建使得在DNA層面對(duì)RNA病毒進(jìn)行研究成為可能。將含有單股RNA(single st rand RNA,ss RNA)病毒基因組的感染性克隆cRNA轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞可直接獲得重組病毒,而單股副鏈RNA(single negative strand RNA,-ssRNA)病毒則不適用于這一方法,其拯救系統(tǒng)較為復(fù)雜。

副黏病毒家族成員均為-ssRNA病毒,包含了一大群影響公共健康與經(jīng)濟(jì)發(fā)展并可引起人及動(dòng)物嚴(yán)重疾病的病原體［2],因此開展疫苗研發(fā)及致病機(jī)制的研究為相關(guān)疾病的防制具有重要意義。由于副黏病毒基因組結(jié)構(gòu)簡單,序列明確且具有較為深厚的反向遺傳學(xué)研究基礎(chǔ),因此利用反向遺傳技術(shù)探索副黏病毒生物學(xué)特性以及疫苗開發(fā)是目前的研究熱點(diǎn)。本文以副黏病毒為-ssRNA病毒的代表,通過對(duì)副黏病毒的反向遺傳進(jìn)展進(jìn)行綜述,期望可以為副黏病毒以及-ssRNA病毒相關(guān)研究提供些許幫助。

1 副黏病毒反向遺傳策略研究

1994 年,科研人員成功拯救狂犬病毒(rabies virus,RV)［3],該研究證明了從cDNA水平直接拯救-ssRNA病毒的可行性。自此之后,人們對(duì)于-ss-RNA病毒的反向遺傳研究進(jìn)入了一個(gè)新的階段,多個(gè)種屬的-ssRNA病毒反向遺傳系統(tǒng)相繼被建立。副黏病毒家族最早實(shí)現(xiàn)病毒拯救的是仙臺(tái)病毒(Sendai virus,SeV)［4]、麻疹病毒(M V)［5]以及人呼吸道合胞體病毒(H RSV)［6]。在此之后大部分副黏病毒通過反向遺傳技術(shù)獲得拯救并得到初步應(yīng)用。對(duì)副黏病毒的研究表明,當(dāng)病毒核苷酸總數(shù)為6的倍數(shù)時(shí)病毒可進(jìn)行有效復(fù)制,這一發(fā)現(xiàn)被稱為副黏病毒的“六堿基原則”。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn),核蛋白特異性的與6個(gè)核苷酸發(fā)生結(jié)合以及“六堿基原則”的出現(xiàn)可能是由于核苷酸與N-phase context之間正確的識(shí)別定位所導(dǎo)致的［7]。副黏病毒家族大多數(shù)成員嚴(yán)格遵循這一原則,但也有特例,如呼吸道合胞體病毒(RSV)［8]。這一原則的發(fā)現(xiàn)提示研究人員在進(jìn)行副黏病毒反向遺傳操作時(shí),不論是進(jìn)行內(nèi)源基因的缺失、改造還是外源片段的插入都應(yīng)當(dāng)準(zhǔn)確考慮到重組病毒基因組的核苷酸數(shù)目,因?yàn)檫@可能會(huì)影響到病毒的拯救效率。目前反向遺傳的病毒拯救主要分為兩種方法,即細(xì)胞外轉(zhuǎn)錄與細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄。

1.1 細(xì)胞外轉(zhuǎn)錄體外轉(zhuǎn)錄是較早開發(fā)出來的在DNA水平上對(duì)RNA表達(dá)進(jìn)行調(diào)控的分子生物學(xué)方法,對(duì)于大部分非逆轉(zhuǎn)錄RNA病毒來說其復(fù)制過程并不涉及DNA中間體,這就大大限制了在基因水平上對(duì)RNA病毒的研究,而細(xì)胞外轉(zhuǎn)錄技術(shù)的出現(xiàn)為研究RNA病毒基因調(diào)控及分子遺傳方面提供了新的思路。細(xì)胞外轉(zhuǎn)錄,即在無細(xì)胞系統(tǒng)中以DNA作為模板, NTP為原料,在RNA逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下模仿體內(nèi)轉(zhuǎn)錄機(jī)制生成RNA的過程。轉(zhuǎn)錄所用DNA模板應(yīng)滿足以下條件:首先DNA模板長度應(yīng)不小于拯救病毒的RNA基因組,其次全長序列要在T7或其他啟動(dòng)子的控制之下,另外為了提高轉(zhuǎn)錄效率通常在啟動(dòng)子后面人為地加上2到3個(gè)鳥嘌吟(G)殘基。正常的RNA病毒其基因組的5′端常帶有病毒基因組共價(jià)結(jié)合連結(jié)蛋白(Virus genome-linked protein,VPg),該蛋白由NIa-Pro蛋白酶從NIa的氨基端水解而得到且對(duì)于病毒基因組的復(fù)制具有重要影響。因此,為了模擬該結(jié)構(gòu),轉(zhuǎn)錄獲得的RNA序列還要在5′端加上帽子結(jié)構(gòu)CAP(m7GpppG),所謂CAP結(jié)構(gòu)是指真核生物蛋白表達(dá)過程中轉(zhuǎn)錄出的mRNA 5′端的一個(gè)特殊結(jié)構(gòu),該結(jié)構(gòu)的加入除了可以提高轉(zhuǎn)錄效率之外還可以增加轉(zhuǎn)錄RNA的穩(wěn)定性,保護(hù)其不被細(xì)胞中的核酸酶降解。與5′端相對(duì)應(yīng),即在轉(zhuǎn)錄RNA 3′端同樣需要一個(gè)穩(wěn)定的序列來保證穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄,這個(gè)序列被稱為poly(A),對(duì)脊髓灰質(zhì)炎病毒(poliovirus)的研究表明:RNA病毒復(fù)制與其3′端poly(A)尾序列有關(guān)［9],推測(cè)該結(jié)構(gòu)與RNA病毒的體外轉(zhuǎn)錄亦具有重要關(guān)系。1984年,Ahlquist及其同事［10]利用體外轉(zhuǎn)錄方法成功拯救具有感染性的雀麥花葉病毒(Brome Mosaic Virus,BMV)。該研究成功搭建了以DNA為模板研究RNA病毒的橋梁,為RNA病毒研究開辟了新的方向。

1.2 細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄RNA病毒的細(xì)胞外轉(zhuǎn)錄技術(shù)雖應(yīng)用較廣但也有它自己的不足之處,如較低的轉(zhuǎn)染效率以及轉(zhuǎn)錄的不穩(wěn)定性使得拯救的病毒由于缺乏完整性而無法繼續(xù)復(fù)制,另外因細(xì)胞外轉(zhuǎn)錄技術(shù)需要價(jià)格高昂的轉(zhuǎn)錄試劑。因此,為了克服上述缺點(diǎn),細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生,而副黏病毒的反向遺傳系統(tǒng)多是以該技術(shù)開發(fā)的。最初科研人員嘗試直接將連有RNA病毒cDNA克隆的重組載體直接轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞但未獲得重組病毒,究其原因是缺乏必要的體內(nèi)轉(zhuǎn)錄條件及適合的轉(zhuǎn)錄起始信號(hào)。

1.2.1 T7 RNA聚合酶拯救系統(tǒng)隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展,相繼建立起來越來越多的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)。目前副黏病毒應(yīng)用較多的是基于T7 RNA聚合酶體內(nèi)轉(zhuǎn)錄拯救系統(tǒng)［11]。具體方法是將體外構(gòu)建的在T7啟動(dòng)子控制下全長cDNA克隆及輔助蛋白表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染能夠穩(wěn)定表達(dá)T7 RNA聚合酶的真核細(xì)胞。一旦重組質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞,T7 RNA聚合酶便會(huì)特異地識(shí)別T7啟動(dòng)子下游的外源片段并轉(zhuǎn)錄出全長RNA或mRNA,然后進(jìn)入病毒自身的復(fù)制周期產(chǎn)生重組病毒。構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)T7 RNA聚合酶細(xì)胞的方法通常是在轉(zhuǎn)染前對(duì)細(xì)胞預(yù)先感染能夠表達(dá)T7 RNA聚合酶的重組痘苗病毒(vT F7-3)或建立能夠穩(wěn)定表達(dá)T7 RNA聚合酶的細(xì)胞系。副黏病毒早期拯救策略選用的痘苗病毒是基于牛痘病毒W(wǎng) R株構(gòu)建的穩(wěn)定表達(dá)噬菌體T7 RNA聚合酶的重組痘苗病毒vTF7-3,然而由于vTF7-3可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞上進(jìn)行有效復(fù)制但產(chǎn)生明顯的病變,因此可能影響病毒的拯救效率。為了解決這一問題,研究人員嘗試?yán)镁哂兴拗鲝?fù)制范圍的MVA痘苗株并以其為載體表達(dá)T7 RNA聚合酶,而研究人員利用MVA-T7成功拯救出了牛瘟病毒(rinder pest virus,RPV)與人副流感病毒3型(human parainfluenza virus type 3,HPIV3)［12]。

運(yùn)用輔助病毒進(jìn)行拯救的方法盡管經(jīng)過優(yōu)化但仍存在某些缺陷,如在不同細(xì)胞系中輔助病毒的感染量存在差異且不易清除。穩(wěn)定表達(dá)T7 RNA聚合酶細(xì)胞系的建立為上述問題的解決找到了新的出路。1995年,Radecke及其同事［5]構(gòu)建了能夠穩(wěn)定表達(dá)麻疹病毒核蛋白、磷蛋白以及T7 RNA聚合酶的人胚胎腎293細(xì)胞系(human embryonic kidney 293 cellline)并利用該細(xì)胞系成功拯救麻疹病毒,隨后Takeda等［13]發(fā)現(xiàn)利用重組痘病毒及穩(wěn)定表達(dá)T7 RNA聚合酶的細(xì)胞系均可成功拯救高致病性麻疹病毒株IC-B,且拯救效率無明顯差異。1999年,研究人員利用新霉素篩選成功構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)T7 RNA聚合酶的BHK-21細(xì)胞,即BSR T7/5細(xì)胞系,隨后研究人員利用該細(xì)胞系成功拯救牛呼吸道合胞體病毒(BRSV),并發(fā)現(xiàn)非結(jié)構(gòu)蛋白NS2并不是病毒復(fù)制的必需因素［14]。這些發(fā)現(xiàn)為副黏病毒的反向遺傳研究奠定了基礎(chǔ)。

1.2.2 RNA聚合酶II拯救系統(tǒng)除T7 RNA聚合酶之外,利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞固有的RNA聚合酶I或II對(duì)副黏病毒進(jìn)行拯救亦是另一種可行且有效的方法,由于不涉及到預(yù)感染輔助病毒及構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)T7RNA聚合酶的細(xì)胞系,故該方法是目前為止較為簡便的病毒拯救策略。最先應(yīng)用RNA聚合酶進(jìn)行病毒拯救的是分節(jié)段A型流感病毒［15],RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的RNAs具有穩(wěn)定的5′cap及3′poly(A)尾結(jié)構(gòu),在與通常用于核內(nèi)轉(zhuǎn)錄的RNA聚合酶I聯(lián)合利用時(shí)可極大地提高重組病毒的拯救效率?？梢员籖NA聚合酶Ⅱ識(shí)別的啟動(dòng)子包括巨細(xì)胞病毒(Cytomegalovirus,CMV)啟動(dòng)子、β肌動(dòng)蛋白(β-actin)啟動(dòng)子以及猴空泡病毒40(Simian vacuolating virus 40, SV40)啟動(dòng)子等。2002年,Le Mercier及其同事［16]在研究缺陷型狂犬病毒(Rabies virus,RV)時(shí)發(fā)現(xiàn),在病毒全長基因組cDNA克隆的兩端加入錘頭狀核酶序列(hammerhead ribozyme,HamRz)以及丁肝病毒核酶序列(hepatitis delta virus ribozyme, HdvRz)可顯著影響重組病毒的拯救效率,主要原因在于HamRz自我切割及HdvRz的反式切割作用可獲得正確長度的病毒RNA基因組,這將有利于后期的核糖核蛋白(ribonucleoprotein,RNP)裝配及重組病毒粒子的穩(wěn)定增殖。Inoue等［17]利用RNA聚合酶II識(shí)別的CMV啟動(dòng)子在多個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞系上成功拯救具有感染性的狂犬病毒,隨后利用該系統(tǒng)成功拯救副黏病毒科的新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)［18]以及小反芻獸疫病毒(Pestedes petits ruminants virus,PPRV)［19]。

2 副黏病毒反向遺傳的應(yīng)用

2.1 基因功能研究對(duì)目的基因進(jìn)行適當(dāng)修飾或者干擾相應(yīng)蛋白的表達(dá)以研究其在病毒復(fù)制周期中的作用是目前研究病毒及宿主功能蛋白較為可行的方法。研究人員利用反向遺傳學(xué)技術(shù)成功拯救缺失部分非結(jié)構(gòu)N S2的重組B R S V,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)缺乏完整N S2蛋白的重組病毒復(fù)制效率顯著低于野生親本毒株,進(jìn)而推測(cè)N S2蛋白雖不直接構(gòu)成病毒粒子但在病毒復(fù)制的過程中也起到了重要作用［14]。2000年,S chmidt及其同事［20]構(gòu)建了F及H N蛋白被B PIV3替換的重組HPIV3,將該重組病毒人工感染恒河猴并發(fā)現(xiàn)相比于對(duì)照重組病毒在恒河猴上呼吸道以及下呼吸道的增殖及致病能力顯著下降,以上結(jié)果表明PIV3表面糖蛋白與病毒在宿主體內(nèi)的復(fù)制密切相關(guān)。

2.2 致病機(jī)理研究病毒結(jié)構(gòu)與功能有著密不可分的關(guān)系,特別是一些與病毒毒力相關(guān)的致病因子,利用反向遺傳學(xué)技術(shù)研究毒力因子的致病方式將有助于相關(guān)預(yù)防及治療藥物的開發(fā)與利用。科研人員對(duì)新城疫病毒(N D V)不同分離株的研究發(fā)現(xiàn),融合蛋白F上的裂解位點(diǎn)是病毒毒力強(qiáng)弱的關(guān)鍵［21], Peeters等［22]在拯救NDV弱毒株的研究中將cDNA上F蛋白裂解位點(diǎn)突變?yōu)閺?qiáng)毒株的標(biāo)志性序列并成功拯救具有強(qiáng)致病性的NDV重組毒株,該試驗(yàn)再次證明了F蛋白裂解位點(diǎn)與NDV致病性的重要關(guān)系且為探索強(qiáng)毒株與弱毒株之間的進(jìn)化規(guī)律找到了新的研究方法。為了研究副黏病毒P基因編碼產(chǎn)生的非結(jié)構(gòu)蛋白V與病毒毒力的關(guān)系,研究人員利用反向遺傳的方法構(gòu)建了V蛋白表達(dá)受限的重組NDV,對(duì)重組NDV在雞胚上增殖情況的研究發(fā)現(xiàn),V蛋白除了會(huì)影響病毒本身的增殖能力可能還介導(dǎo)了病毒在宿主細(xì)胞中的致病過程［23]。

2.3 弱毒疫苗制備傳統(tǒng)的弱毒疫苗制備大多是通過理化致弱或在異源動(dòng)物或組織培養(yǎng)物中連續(xù)傳代獲得弱毒株,這種方法由于存在毒力返強(qiáng)、周期長且預(yù)期結(jié)果未知等風(fēng)險(xiǎn),在應(yīng)用上存在一定限制。而利用分子生物學(xué)方法如反向遺傳技術(shù)對(duì)病毒基因進(jìn)行適當(dāng)?shù)男揎棌母旧蠈?duì)病毒的生物學(xué)特性進(jìn)行改造,在不影響病毒正常復(fù)制的前提下降低其致病性且保留較高的免疫原性,無回復(fù)突變至毒力返強(qiáng)的風(fēng)險(xiǎn),且大大地縮短了研發(fā)周期,獲得可用于疫苗開發(fā)的致弱株。目前反向遺傳技術(shù)是疫苗研發(fā)中較為可行的方法,其他病毒疫苗的研發(fā)已經(jīng)提供了切實(shí)的例證,如禽流感疫苗的研發(fā)。

早期的RSV疫苗使用的弱毒株是化學(xué)方法篩選出的溫度敏感型,盡管在RSV陰性血清的黑猩猩身上表現(xiàn)出高度的致弱現(xiàn)象,但在臨床試驗(yàn)中該疫苗在部分兒童體內(nèi)展現(xiàn)出了較高的復(fù)制能力與毒性,類似的情況也出現(xiàn)在其他候選疫苗中,安全有效的免疫原性與致弱性良好的疫苗株很難同時(shí)獲得。為了解決這一問題,1999年White head及其同事［24]利用反向遺傳學(xué)的方法對(duì)已有RSV弱毒株cpts248/ 404的L基因進(jìn)行定點(diǎn)突變,獲得了充分減毒的重組疫苗株,該試驗(yàn)的成功為本已遭遇到瓶頸的RS V弱毒疫苗開發(fā)找到了新的突破口。N-糖鏈?zhǔn)俏挥诟别げ《灸夷け砻嫣堑鞍咨系奶厥饨Y(jié)構(gòu),研究發(fā)現(xiàn)該結(jié)構(gòu)與病毒侵入宿主細(xì)胞有關(guān)且影響著病毒的致病性,Panda等［25]利用反向遺傳方法構(gòu)建了HN蛋白N-糖鏈缺失的重組NDV病毒,對(duì)該重組病毒的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),缺失N-糖鏈并不會(huì)對(duì)病毒的復(fù)制能力產(chǎn)生顯著影響且獲得的重組毒株毒力要低于親本株。PIV3是一種嚴(yán)重危害嬰幼兒的呼吸道病原體,為了開發(fā)安全有效的PIV3減毒疫苗,研究人員利用反向遺傳技術(shù)將PIV3囊膜表面糖蛋白的胞外區(qū)替換為PIV2弱毒疫苗的部分抗原結(jié)構(gòu),結(jié)果獲得了充分致弱的重組毒株,為PIV3弱毒疫苗研發(fā)提供了技術(shù)基礎(chǔ)。

2.4 嵌合病毒制備嵌合病毒是利用基因工程的方法人為創(chuàng)造具有多個(gè)親本毒株生物特性的重組病毒。在自然環(huán)境中個(gè)別病毒也會(huì)發(fā)生重組現(xiàn)象,但人們對(duì)新出現(xiàn)重組病毒的生物學(xué)特性未知,有一些毒株的致病力會(huì)減弱但有一些可能會(huì)增強(qiáng),甚至出現(xiàn)新的高致病性毒株,而利用反向遺傳學(xué)方法創(chuàng)建的嵌合毒株由于親本基因序列及生物學(xué)特性已知,因此獲得重組病毒具有更高的可控性及安全性,另外部分寄生于不同物種之間的副黏病毒基因組較高的同源性以及種間差異對(duì)病毒復(fù)制的影響也為重組嵌合病毒的成功拯救以及安全使用提供了必要的先決條件。2000年,研究人員將BPIV3的F及HN編碼基因替換為HPIV3并成功構(gòu)建PIV3嵌合病毒rBPIV3-FHHNH,血清學(xué)試驗(yàn)表明:新獲得的重組嵌合病毒可在靈長類動(dòng)物身上有效誘導(dǎo)較高水平的HPIV3中和抗體［20],該重組病毒可開發(fā)為HPIV3候選疫苗及作為一種對(duì)抗其他病原的活疫苗載體。Buchholz等［26]通過反向遺傳學(xué)將牛RSV囊膜表面糖蛋白F和G替換為人RSV F和G,獲得重組人/牛嵌合RSV減毒重組疫苗,在黑猩猩身上的試驗(yàn)表明該重組疫苗是安全有效的,而該疫苗的成功構(gòu)建也為新型人用RSV疫苗開發(fā)奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

2.5 活載體疫苗副黏病毒作為活載體疫苗具有極大的優(yōu)勢(shì)。首先,由于是RNA病毒其復(fù)制階段不存在DNA中間體因此不會(huì)整合到宿主基因組中;其次,副黏病毒可在多種細(xì)胞系中增殖,易于培養(yǎng)及大規(guī)模生產(chǎn);另外,副黏病毒基因組可裝載長度較大的外源片段且插入的外源蛋白具有較高的表達(dá)效率、穩(wěn)定性及免疫原性,而反向遺傳技術(shù)的出現(xiàn)使得外源片段的插入變得更為簡便［19,27]。截至目前副黏病毒載體主要為人和動(dòng)物的呼吸道病毒,如SeV、BPIV3、HRSV以及NDV等。Schmidt及其同事以人/牛嵌合PIV3弱毒株為載體成功表達(dá)RSV糖蛋白G以及F,新獲得的重組病毒保留了PIV3載體病毒的致弱特點(diǎn)且可在靈長類動(dòng)物身上有效誘導(dǎo)產(chǎn)生較高水平的PIV3與RSV抗體滴度［27-28],這意味著該毒株可被開發(fā)成為一種有效的人用PIV3/RSV二聯(lián)疫苗來對(duì)抗目前影響嬰幼兒呼吸系統(tǒng)的兩種主要病原體。Liang等［29]將RSV F蛋白插入到嵌合PIV3毒株基因組不同蛋白編碼序列之間,并以此來研究外源片段的插入位點(diǎn)與表達(dá)量的關(guān)系,結(jié)果表明除所有重組毒株增殖未受影響之外,當(dāng)外源片段插入位置越靠近PIV3基因組3′端時(shí)其表達(dá)量越高且在F基因被插入到N-P基因之間、P-M基因之間以及HN-L基因之間時(shí)獲得的重組病毒溫度敏感性增強(qiáng)。Sawada及其同事［30]以重組麻疹疫苗株AIK-C為載體,將HRSV F基因(A2)插入到AIK-C P與M基因之間,誘導(dǎo)出的中和抗體可以對(duì)抗兩個(gè)病毒亞群,在棉鼠試驗(yàn)中該重組毒株可賦予棉鼠較強(qiáng)的對(duì)抗HRSV-A亞群的能力,肺部平均病毒載量降低大于2.3 log;攻毒試驗(yàn)中的交叉保護(hù)力對(duì)于異源B亞群較弱,肺部病毒載量僅減少0.5 log。

所有的病毒載體都應(yīng)符合三個(gè)要求:①疫苗株在體內(nèi)能夠被有效弱化;②疫苗能夠?qū)共《镜膹?fù)制以及為上下呼吸道提供保護(hù);③能夠高效生產(chǎn)病毒種子。非人源載體如SeV和B PIV3的使用應(yīng)避免機(jī)體對(duì)于該載體的免疫應(yīng)答,因?yàn)檫@將會(huì)顯著降低疫苗的效價(jià)。這些載體被認(rèn)為對(duì)人類的影響較小,它們雖然可以感染人但不會(huì)造成嚴(yán)重疾病。即便如此,它們還是受宿主限制的,因此更深入的研究應(yīng)當(dāng)是放在這些載體轉(zhuǎn)染人類細(xì)胞的能力以及對(duì)于目標(biāo)的有效性上。

3 展望

隨著反向遺傳技術(shù)的不斷完善和發(fā)展,越來越多的副黏病毒可以通過反向遺傳技術(shù)來進(jìn)行基因復(fù)制與表達(dá)調(diào)控機(jī)理、病毒與宿主間相互作用關(guān)系、病毒蛋白功能、致病機(jī)制、基因治療研究、構(gòu)建新型病毒載體表達(dá)外源基因和病毒重組疫苗制備等領(lǐng)域的研究,為更加深入了解這一類病毒的遺傳進(jìn)化、生物特點(diǎn)提供理論支撐,也有利于相關(guān)特效治療藥物和高效安全疫苗的研發(fā)從而更好防控這一類疾病提供新的研究方向和科學(xué)依據(jù)。同時(shí),由于人工合成的具有生物活性的轉(zhuǎn)錄本,在病毒復(fù)制時(shí)可能發(fā)生重組和基因突變等,可能產(chǎn)生出不可預(yù)知的新病毒,因此在進(jìn)行反向遺傳相關(guān)操作時(shí)要充分考慮到生物安全問題,以避免基因污染,使這一技術(shù)更好地為人類服務(wù)。

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Update of reverse genetics for Paramyxoviruses

Ran Xuhua,Liu Yangyang,Wen Xiaobo*
(College of Animal Science and Veterinary Medicine,Heilongjiang Bayi Agricultural University,Heilongjiang Daqing 163319)

Reverse genetics provides an important tool by which the function of gene of interest can be analyzed after the specific modification and deletion in the given gene is generated.Paramyxoviruses belong to single negative strand RNA virus family and development of the reverse genetics system,especially for single negative strand RNA viruses including paramyxoviruses,enables to facilitate the studies of viral protein function,pathogenic mechanism,as well as vaccine preparation based on recombinant viruses by reverse genetics.This paper reviews the newest research progress of reverse genetics for the members in Paramyxovirus family in an attempt to providing reference.

Reverse genetics;Paramyxovirus;Pathogenic mechanism;Viral rescue

S852.65

A

1672-9692(2016)10-0053-07

2016-08-02

冉旭華(1978-),女,博士,副教授,研究方向:分子免疫學(xué)。

聞曉波(1977-),男,博士,副教授,研究方向:分子病毒學(xué)。

黑龍江省農(nóng)墾總局“十二五”重點(diǎn)科技計(jì)劃項(xiàng)目(HNK125B-11-08A,HNK125B-11-02);“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技計(jì)劃課題(2012BAD12B03-3);黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)研究生創(chuàng)新科研項(xiàng)目(YJSCX2016-Y27)。