PRF的制備及保存方法的研究進展

毛俊麗綜述，王　拓，孫勇審校，陳紅亮，趙　峰

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綜述.講座

PRF的制備及保存方法的研究進展

毛俊麗綜述，王拓，孫勇審校，陳紅亮，趙峰

富血小板纖維蛋白；制備；方法；保存

富血小板纖維蛋白（platelet-rich fibrin，PRF）由法國科學家Choukroun等于2001年首次提出，與第一代富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）相比，第二代富血小板制品因其簡化的制備和血液未經(jīng)生化處理而得到廣泛應用。骨增量術中，將PRF與骨移植材料混合，可以提高移植材料的穩(wěn)定性及骨誘導性，從而起到止血、促進創(chuàng)口愈合、加速骨再生及骨改建等作用；也可以制備成膜，便于臨床使用[1]。臨床試驗表明，富含生長因子的PRF混合骨移植材料應用于引導骨再生，可以提高成骨活性[1]。但PRF制作方法研究報道較多、較雜，保存方法尚無統(tǒng)一定論，本文就PRF的制作及保存方法做一綜述。

1　PRF的制備

1.1制備原理制備PRF要求收集血液至不添加抗凝劑的試管，快速離心。由于缺乏抗凝劑，血液接觸試管表面即開始凝結，因此為了成功制備PRF，快速血液收集和在凝血反應開始前直接離心是絕對必要的[1]。PRF制備過程同時進行著離心反應和凝集反應。離心作用即在離心機強大的離心力作用下，使血液中血細胞的沉降加快,把血液中不同沉降速率(基于粒子的大小、形狀和密度等決定）的物質(zhì)分開,實現(xiàn)血液分層[2]；凝集反應類似于人體生理凝血過程，依賴血液樣本含有的少量凝血酶將纖維蛋白原緩慢轉(zhuǎn)化為纖維蛋白網(wǎng)狀結構，這種緩慢聚合過程更符合生理凝血機制，應用于臨床也會引起一個更高效的細胞遷移和擴散,促進軟硬組織愈合[3]。制備的PRF包括以下3層：上層貧血小板血漿(platelet-poor plasma，PPP)，中間層PRF凝膠，下層為紅細胞層[4]。

1.2離心方法PRF制備的關鍵是選擇離心方法，離心方法主要由相對離心力（relative centrifugal force，RCF）和離心時間決定。而相對離心力越大，離心時間越久，血液中細胞破壞可能性越大[5]。RCF被廣泛用來描述離心，它與轉(zhuǎn)速和離心半徑相關。RCF=1.118×10-6×R×W2(R為離心半徑，單位為cm；W為每分鐘轉(zhuǎn)速，單位為r/min）[6]。

最常用PRF的制取方法是Choukroun等[7]在2001年提出的，采集10 ml全血到不含抗凝劑的試管內(nèi)，立即采用3000 r/min(相對離心力大約400×g)，離心10 min。 Shahram等[8]采用的標準PRF制備方法是：采集9m l全血到不含抗凝劑的無菌玻璃涂層的塑料管，以2700 r/min離心12min；改良型富血小板纖維蛋白（advance platelet-rich fibrin，APRF）的制備方法是：采集10ml全血到不含抗凝劑的無菌純玻璃管，以1500 r/min離心14min。PRF和APRF由于離心力的不同，特定的細胞類型構成不同。APRF應用于引導骨再生有可能成為一種理想的自體細胞供體，特別是中性粒細胞和巨噬細胞，各種細胞相互協(xié)作，促進傷口愈合和組織修復再生。程亞楠[2]分別采用2500 r/min（978×g)、3000 r/min（1408×g)、4000 r/min(2504×g)，離心10min，3種離心條件產(chǎn)物的纖維蛋白結構及細胞分布無明顯差異。前兩組的PRF中白細胞和血小板回收率及部分生長因子的釋放量雖高于第3組，但差異無統(tǒng)計學意義。李艷秋等[9]分別采用2500、3000、3000 r/min離心10 min和3000 r/min分別離心10、15、20min的6種方式制備PRF，測定每種產(chǎn)物在7 d內(nèi)TGF-β和PDGF-AB釋放含量，結果3000 r/min離心10min釋放量明顯高于其他組。

1.3離心試管Mustafa等[10]用鈦試管3500 r/min離心15 min制備T-PRF(titanium-prepared，platelet-rich fibrin)。T-PRF的血小板聚集過程和玻璃管制備的PRF相似，因其不含二氧化硅，具有更好的生物相容性。作為一種新的富血小板制品，經(jīng)過初步動物體內(nèi)實驗，證實其在前15 d對于結締組織形成方面具有極強的誘導再生潛力。李龍等[11]采集家兔血液，分別用塑料管和玻璃管制備PRF膜片，對比觀察7個時間點VEGF的濃度變化，結果用塑料管制備的PRF比用玻璃管制備的釋放VEGF含量低。

1.4除水方式血液經(jīng)離心后，除水的方式有兩種，一種方法是取出PRF凝膠靜置10 min（緩慢脫水）；另一種方法是將PRF放入到PRF專用工具盒內(nèi)，壓制成膜或者塊（快速脫水）。李艷秋[9]等將制備的PRF分別用緩慢脫水和快速脫水兩種方式處理，結果發(fā)現(xiàn)其釋放生長因子的含量無明顯差異。生長因子及血小板鑲嵌在纖維蛋白構成的三維網(wǎng)狀結構中，擠壓并不會丟失。因此，目前臨床上常采用快速脫水的方式制備PRF。

2　保存方法

PRF作為一種源自自體的生物材料，臨床上多采用新鮮制備的，其保存方法研究較少，并且尚未見有特別理想的保存方法。孫悅[12]將單純利用冷凍干燥技術處理的PRF與新鮮PRF通過掃描電鏡、降解性檢測、對細胞增殖影響等方面進行對比觀察，發(fā)現(xiàn)凍干后的PRF結構疏松多孔，其內(nèi)的纖維網(wǎng)狀已經(jīng)消失，部分生長因子的釋放及降解速度加快，但其生長因子的活性并無影響。將PRF放在聚碳酸1,2-丙二酯和聚琥珀酸丁二酯的共聚物膜上凍干得到的復合膜，其生長因子的釋放及降解速度較新鮮PRF減緩，這種復合凍干膜還具有支架作用，有望成為PRF保存應用研究的新方向。為了研究PRF體外生長因子的釋放曲線，李龍等[11]將制備的PRF置于無菌DMEM培養(yǎng)基中，分別放置于4℃和37℃下培養(yǎng)，分別在7個時間點收集析出液，保存于-20℃，測定其VEGF濃度值，得出結論4℃比37℃培養(yǎng)條件下釋放VEGF含量高。

3　小結

PRF已廣泛應用于口腔頜面外科、口腔種植修復與牙周病等，目前大部分學者采用的人體PRF制作方法是：采集人體血液置于標準PRF無菌玻璃涂層的塑料離心管內(nèi)（不添加抗凝劑），用德國PROCESS PC-02離心機，在3000 r/min即刻離心10 min或2700 r/min即刻離心12 min；取出PRF凝膠放入PRF制備工具盒，壓制成塊或者膜。雖有報道新方法制備的血小板衍生物，如APRF、TPRF具有某些方面發(fā)展?jié)摿Γ淙杂写M一步動物實驗及臨床研究。由于PRF制作方法較為簡單，其蘊含的生長因子在制作完成后1 h內(nèi)大量釋放，以及沒有很好的保存方法[2]，故建議在制作后盡早使用。

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R 783.9

A

1004-0188（2016）03-0326-02

10.3969/j.issn.1004-0188.2016.03.038

全軍“十二五”科研面上課題（CWS11J024）

646000四川瀘州，四川醫(yī)科大學口腔醫(yī)學院（毛俊麗，王拓）；成都軍區(qū)機關醫(yī)院口腔科(孫勇，陳紅亮，趙峰)

孫勇,E-mail:2623457656@qq.com

（2015-12-23）