新城疫病毒的常規(guī)檢測(cè)及病毒分離鑒定

程榮華，呼延含蓉，高 原，石 霖，閆海濱，徐 鵬*

（1.吉林省畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究院，吉林 長(zhǎng)春 130062；2.吉林省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，吉林 長(zhǎng)春 130062；3.遼寧省動(dòng)物醫(yī)學(xué)研究院，遼寧 沈陽(yáng) 110164；4.錦州醫(yī)科大學(xué)，遼寧 錦州 121001）

新城疫病毒的常規(guī)檢測(cè)及病毒分離鑒定

程榮華1，呼延含蓉2，高 原3，石 霖3，閆海濱3，徐 鵬4*

（1.吉林省畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究院，吉林 長(zhǎng)春 130062；2.吉林省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，吉林 長(zhǎng)春 130062；
3.遼寧省動(dòng)物醫(yī)學(xué)研究院，遼寧 沈陽(yáng) 110164；4.錦州醫(yī)科大學(xué)，遼寧 錦州 121001）

新城疫是禽類(lèi)常見(jiàn)的傳染病，該疫病在我國(guó)常年流行，給養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，雖然目前已經(jīng)有多種類(lèi)型的新城疫疫苗，然而由于疫苗與毒株的匹配度以及免疫程序等因素，該病目前仍然存時(shí)而發(fā)生。隨著疫苗免疫以及毒株的進(jìn)化，新城疫臨床剖檢癥狀越來(lái)越不典型，確診需要依靠實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)進(jìn)行，現(xiàn)將常規(guī)的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法介紹如下。

1 熒光RT-PCR方法

熒光RT-PCR方法是目前動(dòng)物疫病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)以及出入境檢疫機(jī)構(gòu)等常用的檢測(cè)方法，目前市面有很多商品化的熒光RT-PCR試劑盒，該方法的優(yōu)點(diǎn)是檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，快速，2～3h即可獲得檢測(cè)結(jié)果，適合大批量的實(shí)驗(yàn)室樣品監(jiān)測(cè)。該方法的局限性是由于熒光RT-PCR的價(jià)格昂貴，造成該方法較難在基層實(shí)驗(yàn)室推廣使用。

2 RT-PCR方法

目前該方法應(yīng)用較為普遍，很多實(shí)驗(yàn)室根據(jù)新城疫的保守基因設(shè)計(jì)檢測(cè)引物，自己建立了RT-PCR方法，也有實(shí)驗(yàn)室直接購(gòu)買(mǎi)商品化的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，該方法的優(yōu)點(diǎn)是檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可信，特異性高。不足之處是該方法需要跑凝膠電泳，需要凝膠成像設(shè)備觀察結(jié)果，檢測(cè)時(shí)間相對(duì)熒光RT-PCR方法較長(zhǎng)。

3 HI試驗(yàn)

HI試驗(yàn)是用來(lái)檢測(cè)新城疫抗體水平的試驗(yàn)，針對(duì)免疫的雞群，根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)當(dāng)樣品HI結(jié)果大于等于5log2時(shí)，可以判定該樣品免疫合格，當(dāng)群體抗體合格率為70%時(shí)，則判定為該群體免疫合格；針對(duì)非免疫雞，當(dāng)HI結(jié)果大于等于5log2時(shí)，提示該樣品可能感染新城疫病毒。該方法簡(jiǎn)單，無(wú)需儀器設(shè)備，在基層飼養(yǎng)場(chǎng)即可推廣應(yīng)用。

4 病毒分離鑒定

病毒分離是確診新城疫及對(duì)該毒株進(jìn)行深入研究的重要步驟。病毒分離的方法：剖檢取雞的肺臟、氣管、腦、腺胃等組織，研磨后取上清液加入雙抗后接種9日齡SPF雞胚，24h內(nèi)死亡的雞胚棄去不要，培養(yǎng)24～72h后取雞胚的尿囊液。取25uL的雞胚尿囊液做血凝試驗(yàn)，選取有血凝價(jià)的樣品保存?zhèn)溆谩?/p>

5 病毒的基因序列測(cè)定及分析

應(yīng)用PCR方法擴(kuò)增新城疫的HN全長(zhǎng)基因和F全長(zhǎng)基因，將PCR產(chǎn)物回收后，送生物公司進(jìn)行基因序列測(cè)定，對(duì)F基因的序列分析主要研究其裂解位點(diǎn)，同源性分析以及基因進(jìn)化樹(shù)的位置，對(duì)HN基因主要進(jìn)行同源性分析及基因進(jìn)化樹(shù)的繪制。

目前，新城疫病毒的常規(guī)檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)日趨成熟，對(duì)于規(guī)模化養(yǎng)殖場(chǎng)或者基層實(shí)驗(yàn)室可以應(yīng)用HI試驗(yàn)，雞胚接種，血凝實(shí)驗(yàn)甚至PCR方法進(jìn)行新城疫病毒的診斷。這些常規(guī)檢測(cè)技術(shù)是實(shí)現(xiàn)新城疫病毒的綜合防控的技術(shù)依據(jù)。

10．3969/J.ISSN．1671-6027．2016．07.096

★通訊作者