乳腺癌干細(xì)胞調(diào)控機(jī)制的研究進(jìn)展

蔣雪梅，頓耀艷綜述，肖長義審校

（三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北宜昌443002）

乳腺癌干細(xì)胞調(diào)控機(jī)制的研究進(jìn)展

蔣雪梅，頓耀艷綜述，肖長義審校

（三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北宜昌443002）

乳腺腫瘤；干細(xì)胞；微RNAs；綜述

白血病干細(xì)胞在1994年被Lapidot等［1］發(fā)現(xiàn)后癌癥干細(xì)胞（CSCs）的概念已被接受［1］，CSCs啟動腫瘤的形成。據(jù)報道CSCs存在于多種腫瘤中，包括乳腺癌、肺癌、白血病、膠質(zhì)瘤、結(jié)腸癌、肝癌等；同時，一些分子標(biāo)志已經(jīng)被使用于分離整個癌細(xì)胞群，例如乙醛脫氫酶（ALDH）針對乳腺癌干細(xì)胞（BCSCs）、CD90和CD133針對肝癌干細(xì)胞、ABCB5和CD271+針對膠質(zhì)瘤癌干細(xì)胞、CD133針對腦腫瘤干細(xì)胞。CSCs是異源的，例如BCSCs和結(jié)腸癌干細(xì)胞包括至少2種不同的分子標(biāo)記類型鑒別CSCs［2］。從遺傳學(xué)角度來說，BCR-ABL1淋巴細(xì)胞白血病包含多種明顯的白血病干細(xì)胞亞克?。?］。

目前，已經(jīng)揭示一些信號途徑在調(diào)節(jié)CSCs的自我更新和分化中起了關(guān)鍵作用。Wnt信號對CSCs自我更新是重要的，例如，整體存活更差的低分化的基底乳腺癌Wnt/β連環(huán)蛋白信號被激活［4］。Wnt信號的基本活化作用被腫瘤抑制劑APC的突變導(dǎo)致BCSCs的擴(kuò)增。Her2+乳腺癌Wnt抑制信號抑制腫瘤的啟動和轉(zhuǎn)移［5-6］。Notch信號在調(diào)節(jié)CSCs是重要的，例如已有報道從肺腺癌和乳腺癌中Notch-GFP系統(tǒng)被用于分離CSCs，GFP+癌細(xì)胞能分化成GFP-癌細(xì)胞，并且有很強(qiáng)的腫瘤啟動能力［7-8］。Notch信號誘導(dǎo)脫乙?；福⊿IRT2）具有脫乙?；图せ預(yù)LDH1A1及增加BCSCs的作用［9］。除這些信號途徑外，表皮生長因子-β（TGF-β）、IL-6/JAK/STAT3、核因子-κB（NF-κB）信號和其他信號途徑在調(diào)節(jié)CSCs上起關(guān)鍵作用，并且其在調(diào)節(jié)上有時互相干擾。

1　BCSCs

2003年Clarke等分離了假定的BCSCs作為ESA+CD44+CD24-細(xì)胞群。幾乎很少的ESA+CD44+CD24細(xì)胞在體外能夠產(chǎn)生腫瘤。另外，繼發(fā)性腫瘤與原始腫瘤表型類似（形態(tài)學(xué)和ESA/CD44/CD24表達(dá)模式，腫瘤源性的ESA+CD44+CD24-腫瘤細(xì)胞至少能被連續(xù)在體外通過4條通道。有研究使用了幾種方法適應(yīng)干細(xì)胞的研究來分離或研究BCSCs，包括SP測定、Aldefluor測定和球形測定，SP測定是根據(jù)干細(xì)胞的能力排除DNA的測定。例如，通過膜轉(zhuǎn)運(yùn)者Hoechst 33342，SP測定已經(jīng)顯示在乳腺癌細(xì)胞株內(nèi)包含最易生腫瘤的群并且在體外被移植。Aldefluor測定代表一組酶催化的氧化。在惡性乳腺上皮，在體內(nèi)外具有高度ALDH的活性與最大的自我更新和分化能力有關(guān)。ALDH免疫染色陽性與乳腺癌有較差的預(yù)后相關(guān)性［9］。當(dāng)生長在體外非黏附的類似球體BCSCs也被濃集。2個腫瘤啟動群（ALDH+細(xì)胞和ESA+CD44+CD24-細(xì)胞）僅僅顯示有限的重疊（Box1）。通過其他組乳腺癌包含腫瘤起始細(xì)胞顯示不同細(xì)胞的表面標(biāo)記也被顯示相似的發(fā)現(xiàn)［10］。盡管BCSCs的異質(zhì)性，這些細(xì)胞通常與治療抵抗和腫瘤relapse相關(guān)，在癌癥治療中有2個主要障礙。因此，理解CSCs的生物學(xué)將幫助靶向CSCs的新治療方法的發(fā)展，以利于更有效的治療和癌癥的最終治愈。

BCSCs被microRNAs（miRNAs）調(diào)控，miRNA通過mRNA調(diào)節(jié)靶向。miRNA的生物機(jī)制已經(jīng)被Kim等［11］詳細(xì)總結(jié)。有研究已顯示，miRNAs在實(shí)體瘤和白血病中調(diào)節(jié)細(xì)胞增生、侵襲、轉(zhuǎn)移和腫瘤的血管形成。miR-29通過靶向Mcl-1和Bcl-2促進(jìn)肝細(xì)胞、癌細(xì)胞的凋亡［12］。在乳腺癌miR-10b通過靶向RHOC啟動腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。miRNA測定分析顯示了let-7a在乳腺分化的癌細(xì)胞被下調(diào)。一些蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶不僅催化組蛋白的甲基化，還催化非組蛋白的蛋白質(zhì)。例如，SET7/9催化組蛋白3的單甲基化，也催化K135的Lin28A的甲基化來促進(jìn)Lin28在核內(nèi)的聚集，并且增加穩(wěn)定性和Lin28的prilet-7結(jié)合能力［13］。miR-200家族包括miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141和miR-429腫瘤抑制劑。通過靶向ZEB1和ZEB2而抑制EMT。通過靶向BMI1 miR-200c抑制BCSCs。miR-200b通過靶向E-連環(huán)蛋白SUZ12、H3K27me3和其他基因而抑制BCSCs［14］。近年來，Pandolfi等發(fā)現(xiàn)miR-22通過靶向TET1、TET2及TET3促進(jìn)EMT，腫瘤浸潤和正常BCSCs的轉(zhuǎn)移；miR-22的過度表達(dá)提高了一些多能性和EMT-相關(guān)基因的表達(dá)，例如BMI1、ZEB1及ZEB2。TET1、TET2及TET3能抑制miR-200啟動子的脫甲基化。因此，miR-22通過抑制miR-200的表達(dá)促進(jìn)BCSCs，表明DNA脫甲基酶能調(diào)節(jié)BCSCs。miR-93在來自于乳腺癌不同亞型的BCSCs起不同作用。在乳腺癌細(xì)胞基底型中，例如SUM159通過靶向AKT3、SOX4和STAT3，miR-93抑制CSCs和啟動間充質(zhì)-上皮的轉(zhuǎn)化（MET）。然而，在窗型乳腺癌中如人乳腺癌細(xì)胞（MCF-7）能促進(jìn)BCSCs，表明miR-93調(diào)節(jié)BCSCs的雙重作用是依賴細(xì)胞分化的狀態(tài)，但該機(jī)制還在被闡明［15］。除了BCSCs外，miRNAs的調(diào)節(jié)異常在其他類型的CSCs也被發(fā)現(xiàn)。在結(jié)腸癌干細(xì)胞里，miR-34a的功能主要依賴其表達(dá)水平；高miR-34a表達(dá)抑制Notch信號途徑和促進(jìn)CSCs的分化；低miR-34a的表達(dá)促進(jìn)Notch信號途徑和保持CSCs表型。越來越多的研究顯示，miRNAs通過被鏈接到治療載體，例如，納米粒子能潛在地被用于治療腫瘤。

2　lncRNAs在調(diào)節(jié)乳腺癌和CSCs的調(diào)節(jié)發(fā)揮重要作用

長非編碼RNAs（lncRNAs）是長度大于200 nt的非編碼RNA。大量lncRNAs已被發(fā)現(xiàn)，但只有少數(shù)lncRNAs現(xiàn)在已被充分研究。最近，lncRNAs已在許多癌癥中被研究，例如，lncRNA-ATB在肝細(xì)胞癌、乳腺癌和結(jié)腸癌里通過TGF-β激活誘發(fā)EMT［16］。其不僅作為競爭內(nèi)源性RNA（ceRNA）競爭性的結(jié)合miR-200家族上調(diào)其目標(biāo)和誘發(fā)EMT，但是還結(jié)合IL-11 mRNA，增加IL-11的穩(wěn)定性和誘導(dǎo)IL-11的自分泌來激活STAT3通路，這個通路在調(diào)節(jié)BCSCs發(fā)揮至關(guān)重要的作用。lncRNA-ATB可能通過調(diào)節(jié)miR-200家族和STAT3來調(diào)控BCSCs。

BCAR4可以誘導(dǎo)GLI目標(biāo)基因的激活和促進(jìn)乳腺癌的轉(zhuǎn)移，特別是三陰性乳腺癌。GLI的靶基因在BCSCs發(fā)揮關(guān)鍵作用。這些表明BCAR4可調(diào)節(jié)BCSCs，并通過進(jìn)一步的研究被證明。此外，lncRNA lncTCF7調(diào)控肝細(xì)胞癌干細(xì)胞自我更新證明了通過體外腫瘤球形形成能力和體內(nèi)腫瘤啟動頻率。lncTCF7重新募集SWI/SNF復(fù)合體結(jié)合TCF7啟動子和激活TCF7的表達(dá)，TCF7激活Wnt途徑來擴(kuò)充肝細(xì)胞癌干細(xì)胞［17］。lncRNA-ROR是一個細(xì)胞重新編程和多能性的調(diào)制器。對于乳腺癌，lncRNA-ROR誘導(dǎo)EMT和促進(jìn)其轉(zhuǎn)移，lncRNA-ROR過度表達(dá)會增加CD24-CD44+細(xì)胞群百分比和微球體數(shù)量。進(jìn)一步的分析表明，其可以作為靶向EMT誘導(dǎo)者ZEB2和阻斷ZEB2退化來促進(jìn)EMT［18］。隨著lncRNAs研究進(jìn)展，越來越多的lncRNAs將在調(diào)節(jié)CSCs被得到證實(shí)。lncRNAs代表一種新型的CSCs調(diào)節(jié)器，其通過調(diào)節(jié)miRNAs、mRNAs和其他的lncRNAs。lncRNAs的研究將提高CSCs新型分子調(diào)節(jié)的理解，lncRNAs可以針對新的治療方法和預(yù)后因素作為目標(biāo)功能。

3　組蛋白調(diào)節(jié)器

組蛋白H2A、H2B、H3和H4被組蛋白修飾酶，包括組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶、組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶和組蛋白去乙酰酶修改。通過調(diào)節(jié)染色質(zhì)的狀態(tài)在調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮作用，其也彼此串道。H3K4脫甲基酶Jarid1B/KDM5B在乳腺癌被放大和過度表達(dá)來促進(jìn)細(xì)胞增殖。RNA-seq和ChIP-seq分析揭示了Jarid1的結(jié)合位點(diǎn)是顯著富集在啟動子和增強(qiáng)基因腔型的比基底型的高，表明其是一個腔型聯(lián)系的啟動致癌基因［19］。共激活劑相關(guān)的精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶1（CARM1）甲醇化物BAF155在R1064。BAF155甲基化在體內(nèi)和體外促進(jìn)乳腺癌的入侵和轉(zhuǎn)移。染色質(zhì)免疫沉淀反應(yīng)（ChIP）分析表明，CARM1控制c-myc通路中的基因表達(dá)［20］。

3.1NYD1/KDM2BH3K36me1/2和H3K4me3脫甲基酶NYD1/KDM2B在ES和iPS中起一個重要作用。其被多能性因素OCT4和SOX直接調(diào)控，且與Ploycomb抑制性復(fù)合物1（PRC1）的核心單元相互作用，如Ring1B和征募PRC1到控制細(xì)胞分化的啟動子基因的CpG島，導(dǎo)致分化基因的抑制。這也表明KDM2B可以作為Polycomb組抑制元素（PRE）來抑制分化基因的表達(dá)［21］。KDM2B是一種致癌基因，不僅促進(jìn)乳腺癌還維持BCSCs。KDM2B結(jié)合的部位編碼miR-200家族，miR-101、miR-181及miR-203。SUZ12、EZH2、RING1B、BMI1是這些miRNA的直接目標(biāo)，并且KDM2B通過抑制這些miRNA抑制BCSCs和上調(diào)PcG蛋白的核心亞單元［22］。

3.2EZH2和SUZ12EZH2和SUZ12屬于PRC2。EZH2是組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶并催化H3K27me3、SUZ12刺激EZH2的活性。EZH2在胚胎干細(xì)胞、成體干細(xì)胞和癌癥中起關(guān)鍵作用。例如，在乳腺EZH2維持腔型祖細(xì)胞的自我更新［23］。EZH2也是一個致癌基因且在pRB-E2F通路的下游。EZH2可以作為癌癥早期診斷的分子標(biāo)記，并且EZH2在正常乳腺上皮細(xì)胞超表達(dá)增加了患癌癥的風(fēng)險。此外，EZH2在乳腺癌被上調(diào)，高水平的EZH2與侵襲性的乳腺癌相關(guān)。在臨床樣本中，EZH2的表達(dá)和Notch1呈正相關(guān)。EZH2降解抑制來自三陰性乳腺癌的異種移植的出現(xiàn)和增長，并且當(dāng)EZH2過表達(dá)相反的表型也出現(xiàn)。EZH2過度表達(dá)激活Notch1信號活動來促進(jìn)BCSCs的自我更新。進(jìn)一步分析表明，EZH2調(diào)節(jié)Notch轉(zhuǎn)錄活動依賴直接結(jié)合Notch1啟動子而非組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶的活性。在惡性膠質(zhì)瘤干細(xì)胞，EZH2激活STAT3信號，促進(jìn)致腫瘤性［24］。Jung等［25］發(fā)現(xiàn)PAF（PCNA-相關(guān)因子）與β-連環(huán)蛋白相互作用來募集EZH2和形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，該復(fù)合物特別反式激活Wnt信號的目標(biāo)基因，暗示EZH2通過激活Wnt通路擴(kuò)充BCSCs，這表明EZH2可能是中心蛋白質(zhì)，并由幾個關(guān)鍵的信號通路調(diào)節(jié)CSCs。進(jìn)一步的研究還需要揭示調(diào)控機(jī)制。

SUZ12促進(jìn)Hox基因的沉默、細(xì)胞增殖和胚胎發(fā)生。在一些癌癥里SUZ12經(jīng)常被發(fā)現(xiàn)突變，例如，SUZ12突變引起周圍神經(jīng)鞘瘤的惡性轉(zhuǎn)換［26］。SUZ12也是一個直接目標(biāo)miR-200b，其是BCSCs抑制劑。miR-200b部分通過SUZ12抑制BCSCs，但SUZ12調(diào)節(jié)BCSCs的分子機(jī)制還有待闡明。

3.3BMI1BMI1-PRC1是規(guī)范的組成部分，一個E3泛素連接酶和壓縮的多聚核小體的輔助因子。越來越多的證據(jù)表明，BMI1在調(diào)節(jié)正常的和CSCs的自我更新方面起著重要作用。BMI1是腸道干細(xì)胞的標(biāo)志，并且BMI1抑制劑已被發(fā)現(xiàn)抑制結(jié)直腸癌干細(xì)胞［27］。BMI1在BCSCs的自我更新中起著關(guān)鍵作用。Neven等［28］報道了lncRNA FAL1在某些類型的癌癥，包括乳腺癌里過度表達(dá)，且其和BMI1-PRC1復(fù)合體相互作用，通過阻斷其蛋白酶體的降解來增強(qiáng)其穩(wěn)定性，且影響了H2AK119的泛素化水平表觀遺傳抑制基因的表達(dá)，例如，CDKN1A［28］。PRC1通過PREs結(jié)合目標(biāo)位點(diǎn)，且PREs也許是ncRNAs或蛋白質(zhì)，例如，Jarid2、KDM2B和HOTAIR［29］。這些表明BMI1能與ncRNAs互相干擾。

4　小結(jié)

ncRNA的作用和組蛋白調(diào)節(jié)器調(diào)節(jié)BCSCs。越來越多的非編碼RNA已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)CSCs，并且組蛋白調(diào)節(jié)器的新功能和機(jī)制也變得越來越清晰。miRNAs是短序列ncRNAs，并且其容易與納米向量共價結(jié)合。當(dāng)miRNAs或特定的miRNAs反義核苷酸能被納米向量傳遞給腫瘤細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞將被nanovectors根除。所以，藥物的納米載體發(fā)展是很重要的。lncRNAs是CSCs新發(fā)現(xiàn)的監(jiān)管者，并且調(diào)節(jié)機(jī)制通過調(diào)查越來越多的lncRNAs變得越來越清晰。lncRNAs也可以作為治療目標(biāo)起作用。例如，抑制lncRNA具有鎖核酸的BCAR4（LNA），基于反義的寡核苷酸抑制乳腺癌的轉(zhuǎn)移［30］。迄今為止，CSCs不能像胚胎干細(xì)胞一樣在體外未分化的狀態(tài)被培養(yǎng)，具有特定標(biāo)記的流式細(xì)胞術(shù)是分離CSCs的主要方法。一些重要的技術(shù)用于研究機(jī)制，例如，ChIP和ChIP-seq需要一個更大的細(xì)胞數(shù)量，其不適合CSCs的研究。但是新技術(shù)單細(xì)胞RNA測序等和ChIP-seq 500細(xì)胞［31］，將為CSCs的研究帶來新的希望。例如，表觀遺傳調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)在CSCs的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，但監(jiān)管調(diào)節(jié)機(jī)制仍未深入研究是由于CSCs細(xì)胞量少，單細(xì)胞RNA-序列和500細(xì)胞ChIP-seq將最終會解決該問題。單細(xì)胞RNA-序列的承諾和挑戰(zhàn)已被評估［32］。信號通路之間的相互作用，ncRNAs和組蛋白調(diào)節(jié)器在調(diào)節(jié)CSCs起著至關(guān)重要的作用。信號通路網(wǎng)絡(luò)的完全理解，ncRNAs和組蛋白調(diào)節(jié)器將有利于腫瘤的治療。

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