超聲介導(dǎo)微泡促進(jìn)干/祖細(xì)胞移植在缺血性疾病中的應(yīng)用進(jìn)展

馬驥，馬蘇亞

超聲介導(dǎo)微泡促進(jìn)干/祖細(xì)胞移植在缺血性疾病中的應(yīng)用進(jìn)展

馬驥，馬蘇亞

細(xì)胞移植是再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，以骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）和內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）為主的細(xì)胞移植已用于心梗等缺血性疾病的研究中。因其易于獲得、穩(wěn)定性好、且可向心肌細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞分化，能有效地促進(jìn)組織修復(fù)和血管新生，是治療缺血性疾病的理想靶細(xì)胞。然而，既往研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞移植因存在移植效率低、存活細(xì)胞數(shù)量少及靶向性差等缺點(diǎn)而限制了其應(yīng)用。超聲介導(dǎo)微泡破壞（US +MB）技術(shù)是指在特定部位采用一定聲強(qiáng)的超聲波輻照破壞微泡，所產(chǎn)生的沖擊波、微射流通過空化效應(yīng)及聲孔效應(yīng)等作用于周邊的細(xì)胞、組織，并增加其通透性，利于外源性物質(zhì)到達(dá)靶部位而發(fā)揮療效。因其具有安全無創(chuàng)、靶向性好及可重復(fù)應(yīng)用等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于如基因、藥物的靶向輸送，血腦屏障的開放等。近來研究發(fā)現(xiàn)超聲聯(lián)合微泡可促進(jìn)干/祖細(xì)胞靶向歸巢，從而治療心梗、肢體缺血等疾病，本文就其在缺血性疾病中的應(yīng)用進(jìn)展作一綜述。

1 超聲介導(dǎo)微泡促進(jìn)干/祖細(xì)胞移植的作用機(jī)制

1.1 增加細(xì)胞膜、血管壁通透性超聲微泡通過空化效應(yīng)、聲孔效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)與周邊細(xì)胞、組織相互作用，增加其通透性。（1）空化及聲孔效應(yīng)：微泡作為一種外源性的空化核，可明顯降低超聲波發(fā)生空化效應(yīng)的空化閾值。在一定強(qiáng)度的聲場中，微泡在低聲壓時產(chǎn)生穩(wěn)態(tài)空化，在聲場中沿著平衡半徑左右振蕩，重復(fù)收縮和膨脹并在其周圍產(chǎn)生微射流，使微泡周邊存在極高的剪切力，這種剪切力作用于毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的離子通道及其表面受體，導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變；微泡在高聲壓時產(chǎn)生瞬態(tài)空化，在超聲場負(fù)壓相迅速膨脹，正壓相急劇收縮至內(nèi)爆，微泡破壞產(chǎn)生的強(qiáng)大沖擊波和高速微射流直接作用于細(xì)胞膜，使其表面形成短暫開放的小孔，有利于細(xì)胞外物質(zhì)進(jìn)入胞內(nèi)。大鼠血管經(jīng)超聲破壞微泡作用后在電鏡下觀察細(xì)胞表面可見許多大小不一、呈火山口樣的小孔，繼續(xù)培養(yǎng)24h后發(fā)現(xiàn)小孔消失，說明此效應(yīng)造成細(xì)胞表面的結(jié)構(gòu)變化是可逆的。（2）機(jī)械效應(yīng)：微泡在聲場中不斷收縮和膨脹，對血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生機(jī)械牽拉，使細(xì)胞間緊密連接被撐開，細(xì)胞間隙增寬、毛細(xì)血管通透性增加，有利于細(xì)胞穿過內(nèi)皮層遷移至受損部位。

1.2 提供適宜的微環(huán)境干/祖細(xì)胞動員、遷移、黏附生存及最終分化與其所處的微環(huán)境密切相關(guān)，微環(huán)境的改變可引起干細(xì)胞某段基因序列的沉默而影響其最終分化，創(chuàng)造一個適宜的微環(huán)境對于細(xì)胞移植的成功至關(guān)重要，而超聲與微泡作用產(chǎn)生的適度的炎癥反應(yīng)可為細(xì)胞移植提供適宜的“微環(huán)境”，有利于干/祖細(xì)胞的動員及歸巢：通過空化效應(yīng)破壞組織毛細(xì)血管，增加周圍細(xì)胞的氧化應(yīng)激，啟動局部炎癥反應(yīng)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤，增加損傷局部趨化因子基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1（SDF-1）、黏附分子血管細(xì)胞黏附分子-1（VCAM-1）、細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）、促血管生長因子血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）及堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）的表達(dá)，促進(jìn)干/祖細(xì)胞的動員，增加其同內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，提高細(xì)胞移植效率，并促進(jìn)其進(jìn)一步分化為心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞參與損傷組織的修復(fù)，參與血管新生。

2 超聲輻照參數(shù)的選擇

不適當(dāng)?shù)某曒椪諘鸾M織損傷及過度炎癥反應(yīng)，微泡破裂亦會導(dǎo)致細(xì)胞壞死及組織出血等不良反應(yīng)。實際操作中需選擇最佳超聲輻照參數(shù)，在避免可能引起的不良反應(yīng)的前提下提高細(xì)胞移植的效率。

在一定頻率下，當(dāng)聲強(qiáng)超過適宜的范圍時，細(xì)胞的增值活性逐漸降低、死亡率逐漸增加。Zhong等觀察到在聲強(qiáng)0.5W/cm2條件下，心肌細(xì)胞肌小節(jié)清晰、線粒體規(guī)則；聲強(qiáng)1.0W/cm2時，心肌細(xì)胞膜平滑完整，線粒體輕微腫脹、形態(tài)不規(guī)則，部分可見空泡樣改變，HE染色僅見輕微的炎癥細(xì)胞浸潤和適度的組織損傷；但當(dāng)聲強(qiáng)達(dá)到2.0W/cm2時可觀察到肌絲溶解，線粒體腫脹紊亂，部分線粒體嵴縮短甚至缺失，HE染色可見明顯的組織出血及過度的炎癥反應(yīng)。因此目前研究多認(rèn)為在頻率1.0MHz，聲強(qiáng)1.0W/cm2的條件下利用超聲波輻照破壞微泡對移植細(xì)胞的增值、凋亡，細(xì)胞活力無明顯影響，且所產(chǎn)生的VEGF、SDF-1及VCAM-1等細(xì)胞因子可為移植細(xì)胞提供適宜的微環(huán)境。

3 干/祖細(xì)胞移植治療缺血性疾病的可能機(jī)制

目前用于研究缺血性疾病治療的細(xì)胞主要有：骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞及內(nèi)皮祖細(xì)胞，二者在趨化因子作用下動員遷移至缺血部位，參與損傷修復(fù)及血管新生，這一復(fù)雜反應(yīng)的完成需多條途徑共同參與。

3.1 向心肌細(xì)胞分化BMSCs是一種具有多向分化潛能的多功能干細(xì)胞，具有高度的自我復(fù)制和增值潛能，與心肌共同培養(yǎng)可誘導(dǎo)其向心肌細(xì)胞分化，而Wnt信號通路在這一過程中發(fā)揮重要作用：經(jīng)Wnt3a介導(dǎo)的經(jīng)典Wnt信號通路可提高BMSCs增值遷移能力，利于其到達(dá)缺血心肌處；而Wnt5a、Wnt11介導(dǎo)的非經(jīng)典Wnt信號通路則可誘導(dǎo)其向心肌細(xì)胞分化，促進(jìn)BMSCs在缺血心肌組織存活、增加心肌細(xì)胞數(shù)量、修復(fù)受損心肌、改善心功能。

3.2 向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化EPCs是血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，主要來源于骨髓、臍帶血和外周血，在一些趨化因子的作用下可動員、遷移、歸巢至缺血部位，通過分化為成熟的血管內(nèi)皮細(xì)胞并分泌VEGF等細(xì)胞因子參與缺血組織的血管新生及損傷內(nèi)皮的修復(fù)。Notch、PI3K/Akt、MAPK信號通路均參與EPCs生物學(xué)功能調(diào)控，而PI3K/Akt是其中有代表性的一條：它可通過磷酸化作用抑制Akt下游的促凋亡基因FOXO4、促凋亡蛋白BAD、caspase-9活性，抑制EPCs凋亡、促進(jìn)其增殖；也可激活A(yù)kt下游內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）并產(chǎn)生NO，促進(jìn)EPCs動員遷移、歸巢和分化。

3.3 促進(jìn)細(xì)胞因子的分泌BMSCs與EPCs可通過旁分泌作用增加VEGF、SDF-1及VCAM-1等因子的分泌。其中VEGF和SDF-1可促進(jìn)干/祖細(xì)胞的歸巢與分化，VCAM-1可增加細(xì)胞與內(nèi)皮的粘附，這些因子共同作用可有效修復(fù)受損內(nèi)皮，促進(jìn)血管新生，增加毛細(xì)血管密度，改善心肌灌注和心功能。

4 超聲介導(dǎo)微泡促進(jìn)干/祖細(xì)胞移植在缺血性疾病中的應(yīng)用

4.1 心肌梗死（MI）

4.1.1 BMSCs梗死心肌不能再生是心梗后治療的一大難題，而BMSCs作為一種多能干細(xì)胞，可向心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞分化，是心梗再生治療的理想靶細(xì)胞。Song在大鼠梗死心肌處利用超聲波輻照破壞微泡后電鏡觀察可見血管內(nèi)皮細(xì)胞間隙增寬、微血管破裂，再予BrdU標(biāo)記BMSCs移植治療，發(fā)現(xiàn)與單獨(dú)BMSCs治療組相比，微泡干預(yù)后梗死心肌處BrdU陽性細(xì)胞數(shù)量明顯增多、內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞形成的新生毛細(xì)血管密度明顯增加，且治療1個月后心功能各項指標(biāo)均較單獨(dú)細(xì)胞治療組顯著改善；Li報道超聲破壞微泡作用可增加缺血心肌組織趨化因子SDF-1的分泌，同時上調(diào)BMSCs表面SDF-1受體CXCR4的表達(dá)，有效促進(jìn)BMSCs動員及歸巢；Zhong在梗死心肌處利用超聲波分3次輻照破壞微泡后觀察到心肌組織內(nèi)VEGF、SDF-1、VCAM-1的表達(dá)明顯增加，再予DAPI標(biāo)記BMSCs移植，發(fā)現(xiàn)心肌組織內(nèi)DAPI陽性細(xì)胞數(shù)量較對照組明顯增多，說明超聲破壞微泡作用可通過改變?nèi)毖募〗M織微環(huán)境來促進(jìn)BMSCs歸巢；有研究者在細(xì)胞移植前1周內(nèi)在梗死心肌處予超聲波分3次輻照破壞微泡，同樣觀察到心肌組織VCAM-1、VEGF及SDF-1等因子表達(dá)增加，再予BMSCs移植治療4周，發(fā)現(xiàn)與單獨(dú)BMSCs治療組相比，微泡聯(lián)合BMSCs移植能更有效促進(jìn)冠狀動脈側(cè)支循環(huán)形成，增加毛細(xì)血管密度，提高心肌再灌注；Xu將MI動物模型隨機(jī)分為4組：PBS對照組、US+MB組、MSCs組、US+MB+MSCs組，用DAPI標(biāo)記MSCs移植治療MI，4周后觀察到US+MB+MSCs組梗死心肌局部DAPI陽性細(xì)胞數(shù)量明顯多于MSCs組，且梗死區(qū)域VEGF、VCAM-1等因子的表達(dá)明顯增多，新生毛細(xì)血管密度、心肌灌注明顯增加，心肌纖維化及心室重塑得到有效抑制，心功能明顯改善，說明超聲破壞微泡作用可有效促進(jìn)MSCs靶向歸巢并促進(jìn)其發(fā)揮療效；Tong等將具有生物效能的NO載入傳統(tǒng)超聲微泡中，在心前區(qū)利用超聲波輻照破壞微泡使NO靶向釋放到心肌組織中，再予CM-Dil標(biāo)記的BMSCs移植治療MI大鼠，2 d后發(fā)現(xiàn)僅在梗死區(qū)心肌組織觀察到CM-Dil陽性細(xì)胞，而正常心肌不表達(dá)，且微泡干預(yù)后陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多，說明此方法可提高細(xì)胞移植的靶向性及移植效率，4周后觀察到梗死心肌組織毛細(xì)血管密度、心肌灌注明顯增多，梗死區(qū)域SDF-1及VEGF等因子表達(dá)明顯增加，有效抑制了心室重塑，改善了心功能。

4.1.2 EPCsEPCs可促進(jìn)心梗后心肌組織血管新生，增加其血流灌注，改善心功能。李巧利用超聲微泡聯(lián)合EPCs移植治療MI大鼠，4周后超聲心動圖顯示左室短軸縮短率和左室射血分?jǐn)?shù)明顯提高，心肌組織局部微血管密度、VEGF蛋白的表達(dá)明顯增加，缺血心肌的血供及心功能得到顯著改善。

以上研究均證實，利用超聲破壞微泡作用可增加缺血心肌局部SDF-1、VEGF及VCAM-1等因子的表達(dá)，有效促進(jìn)干/祖細(xì)胞動員、歸巢及分化，增加局部毛細(xì)血管密度，提高心肌再灌注血流量，最終改善心功能、抑制心肌纖維化及心室重塑，并影響其預(yù)后。

4.2 心肌病心肌病常由于心肌血管新生能力受損，毛細(xì)血管數(shù)量減少引起心肌細(xì)胞缺血壞死最終導(dǎo)致心衰，增加心肌的血流灌注或可延緩其心衰的發(fā)生發(fā)展。Zen等研究發(fā)現(xiàn)超聲破壞微泡作用可增加心肌組織局部VCAM-1及ICAM-1等黏附因子的表達(dá)，促進(jìn)EPCs同內(nèi)皮層黏附并分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞，并與VEGF、bFGF等血管生長因子共同作用促進(jìn)心肌組織的血管新生；Zen等利用超聲微泡聯(lián)合Dil標(biāo)記的EPCs移植治療心肌病倉鼠，2周后觀察到心肌組織內(nèi)Dil陽性細(xì)胞數(shù)量明顯多于對照組，12周后觀察到心肌組織毛細(xì)血管密度、心肌細(xì)胞密度明顯增加、凋亡細(xì)胞數(shù)量減少、間質(zhì)纖維化減輕、左心室重量減輕，心肌組織的血流灌注明顯增多，微泡聯(lián)合細(xì)胞移植有效抑制了心室重塑，延緩心力衰竭進(jìn)程。

4.3 肢體缺血利用超聲破壞微泡產(chǎn)生的一系列生物效應(yīng)可促進(jìn)缺血肢體的治療性血管新生。Song等報道超聲破壞微泡后引起的毛細(xì)血管破裂能促進(jìn)骨骼肌新生動脈形成；Yoshida等報道US+MB作用后巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤可增加局部VEGF等血管生長因子的分泌，促進(jìn)缺血肢體的血管新生及動脈生成；在這些研究的基礎(chǔ)上，Imada首先將微泡與細(xì)胞移植相結(jié)合并證實了其在缺血肢體血管新生的作用：微泡破裂引起血小板來源的促炎因子活化，增加缺血局部P選擇素表達(dá)，有利于移植細(xì)胞與損傷內(nèi)皮的黏附，與單獨(dú)細(xì)胞移植組相比，微泡干預(yù)后缺血肢體新生毛細(xì)血管數(shù)量明顯增多，血流灌注顯著改善；Enomoto同樣證實了超聲破壞微泡作用可誘導(dǎo)缺血肢體的血管新生，且與EPCs移植相結(jié)合后這種形成新生血管的能力進(jìn)一步增強(qiáng)。

4.4 糖尿病陰莖勃起功能障礙（DMED）DMED是糖尿病的主要并發(fā)癥之一，有報道EPCs可治療糖尿病引起的ED。王英俊利用超聲輻照微泡聯(lián)合EPCs移植治療DMED大鼠，7 d后觀察發(fā)現(xiàn)與單純EPCs移植組相比，微泡干預(yù)后大鼠的陰莖勃起次數(shù)、勃起率均明顯提高，組織學(xué)觀察海綿體組織新生毛細(xì)血管密度、VEGF蛋白表達(dá)均明顯增加，認(rèn)為微泡聯(lián)合細(xì)胞移植能夠進(jìn)一步促進(jìn)缺血海綿體組織的血管新生并最終改善其功能。

5 存在問題與展望

超聲介導(dǎo)微泡促進(jìn)干/祖細(xì)胞移植在缺血性疾病中的實驗研究已取得了一定成果，但仍存在一些問題：如何避免操作不當(dāng)引起的過度炎癥反應(yīng)、栓塞和腎損傷等并發(fā)癥；如何制定細(xì)胞移植劑量、微泡濃度等標(biāo)準(zhǔn)化方案；如何實現(xiàn)針對不同組織器官、不同治療對象的個體化治療等方面都值得我們關(guān)注。

目前超聲微泡聯(lián)合細(xì)胞移植治療尚局限于心梗和肢體缺血等疾病的動物實驗中，隨著細(xì)胞生物學(xué)、干細(xì)胞組織工程和生物工程等學(xué)科的發(fā)展，基于此方法的干/祖細(xì)胞移植有望取得突破性進(jìn)展，并可安全、有效地應(yīng)用于臨床治療中。

略，讀者需要可向編輯部索?。?/p>

10.3969/j.issn.1671-0800.2016.03.003

R445.1

C

1671-0800（2016）03-0285-04

2015-01-15

（本文編輯：姜曉慶）

寧波市自然科學(xué)基金（2012A610214）

315100寧波，寧波市鄞州第二醫(yī)院

馬蘇亞，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，中國超聲醫(yī)學(xué)工程學(xué)會常務(wù)理事，浙江省醫(yī)學(xué)會超聲醫(yī)學(xué)分會常務(wù)委員，寧波市醫(yī)學(xué)會超聲醫(yī)學(xué)分會主任委員，寧波市超聲醫(yī)學(xué)工程學(xué)會會長。主持了多項科研項目，并先后在國家及省級專業(yè)雜志上發(fā)表論文20余篇。Email：masuyasunjian@163.com