Legumain在惡性腫瘤中的表達及意義*

王健君綜述，鐘樹志，李曉敏審校（皖南醫(yī)學(xué)院：.組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室；2.病理學(xué)教研室，安徽蕪湖24002）

Legumain在惡性腫瘤中的表達及意義*

王健君1綜述，鐘樹志1，李曉敏2△審校
（皖南醫(yī)學(xué)院：1.組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室；2.病理學(xué)教研室，安徽蕪湖241002）

天冬酰胺；腫瘤；內(nèi)皮細胞；巨噬細胞；腫瘤侵潤；細胞外基質(zhì)；綜述

Legumain又稱天冬酰胺內(nèi)肽酶（asparaginylendopeptidase，AEP），是一種溶酶體半胱氨酸蛋白酶，最初是在豆類植物（legumainous plants）種子中發(fā)現(xiàn)的。隨后在人體也發(fā)現(xiàn)了Legumain，其基因定位于14號染色體，與動脈粥樣硬化、腦退行性變、肝臟纖維化、抗原加工處理等病理生理過程密切相關(guān)。2003年，Liu等［1］最先報道了Legumain與腫瘤關(guān)系密切，并通過免疫組織化學(xué)方法檢測了人乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、卵巢癌及中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤等組織中Legumain的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Legumain在這些腫瘤組織中均呈高表達，而在相應(yīng)的正常組織中不表達或表達水平極低。隨后的研究表明，Legumain在人胃癌［2］、葡萄膜黑色素瘤［3］、橫紋肌肉瘤［4］等惡性腫瘤中也高表達，其表達能夠增強腫瘤細胞的運動、增殖和遷移能力，對腫瘤微環(huán)境也有重要作用。根據(jù)Legumain能夠特異性地在惡性腫瘤高表達這一特點，以Legumain為靶點進行的腫瘤疫苗研制、腫瘤體內(nèi)成像和藥物靶向性研究等也取得了一些進展。本文就Legumain在惡性腫瘤組織中的表達特點、意義及相關(guān)靶向性研究作一綜述。

1　Legumain在惡性腫瘤中的表達及作用

1.1Legumain在惡性腫瘤組織中高表達的原因及機制腫瘤組織普遍存在的缺氧環(huán)境是Legumain高表達的主要原因［5］，這也解釋了最初發(fā)現(xiàn)Legumain在多種腫瘤組織中高表達，而在體外培養(yǎng)的相應(yīng)腫瘤細胞株中卻不表達的原因［1］，缺氧條件下培養(yǎng)腫瘤細胞則能夠誘導(dǎo)Legumain高表達。此外，在細胞內(nèi)存在天然的半胱氨酸蛋白酶抑制物E/M（cystatin E/M），又稱Cystatin 6（CST6），其在腫瘤組織內(nèi)表達缺失也是Legumain高表達的原因之一［6-7］。為探討Legumain在腫瘤組織內(nèi)表達水平增高的分子機制，Yamane等［8］通過計算機分析及染色質(zhì)免疫共沉淀發(fā)現(xiàn)并驗證了p53與人Legumain基因內(nèi)含子1區(qū)域存在結(jié)合位點，通過體外培養(yǎng)人大腸癌細胞HCT116和人肺癌細胞H1299，分別沉默和上調(diào)p53基因的表達，證實p53可在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控Legumain的表達。同樣，在對乳腺癌的研究中也發(fā)現(xiàn)p53與Legumain的表達呈正相關(guān)［9］。此外，有研究表明，Legumain也是核質(zhì)內(nèi)第二信使Ca2+調(diào)控細胞增殖的靶基因之一，生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，Legumain啟動子區(qū)可能存在轉(zhuǎn)錄因子Elk-1的結(jié)合位點，核質(zhì)內(nèi)Ca2+可能是通過Elk-1調(diào)控Legumain表達［10］。

1.2Legumain在惡性腫瘤細胞中的表達特點及臨床意義在人大腸癌、前列腺癌、乳腺癌、胃癌、卵巢癌等惡性腫瘤組織高表達的Legumain與患者的不良預(yù)后相關(guān)，Legumain是判斷患者預(yù)后和總體生存率的新型標記物。有學(xué)者進一步研究了人惡性腫瘤細胞Legumain免疫組化陽性染色方式及部位與患者預(yù)后的關(guān)系。Gawenda等［11］在人浸潤性乳腺癌組織中觀察到Legumain在乳腺癌細胞細胞質(zhì)的陽性表達方式有3種：彌漫性（diffuse）、細點狀（tiny dots）和囊泡狀（vesicles），其中呈囊泡狀陽性與患者的不良預(yù)后相關(guān)，而呈彌漫性陽性與細點狀陽性與患者的預(yù)后并不具有相關(guān)性。Ohno等［12］在前列腺癌手術(shù)切除標本的免疫組化染色中同樣觀察到Legumain在腫瘤細胞質(zhì)中有彌漫性和囊泡狀2種陽性表達方式，表現(xiàn)為囊泡狀陽性的腫瘤常同時具有包膜侵犯、神經(jīng)侵犯、Gleason評分高的特征，并且患者生存率明顯低于彌漫性陽性者。最近，有研究在人結(jié)腸癌手術(shù)切除標本中觀察到Legumain除在腫瘤細胞質(zhì)表現(xiàn)為彌漫性或顆粒狀（granulated）陽性外，大約30%的結(jié)腸癌標本Legumain陽性表達于腫瘤細胞核 （nuclear），統(tǒng)計分析表明，腫瘤細胞核陽性的患者總體生存率明顯降低，而腫瘤細胞質(zhì)顆粒狀與彌漫性陽性患者生存率并無差異［13］。Legumain在腫瘤細胞的陽性表達方式有望成為預(yù)測惡性腫瘤患者預(yù)后的標記物，但需要更多的研究進一步支持并驗證這種相關(guān)性。

1.3Legumain在腫瘤微環(huán)境中的表達及作用腫瘤微環(huán)境是腫瘤細胞賴以生長的復(fù)雜環(huán)境，包括腫瘤細胞外基質(zhì)及多種細胞成分，如腫瘤相關(guān)巨噬細胞（tumor-associated macrophages，TAM）、成纖維細胞，血管內(nèi)皮細胞等，腫瘤細胞與腫瘤微環(huán)境之間相互作用共同促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移［14］。Legumain在腫瘤微環(huán)境中的新生血管內(nèi)皮細胞、腫瘤相關(guān)巨噬細胞中也高表達。腫瘤相關(guān)巨噬細胞是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，屬于M2型巨噬細胞，通過分泌多種生長因子、血管生成因子、蛋白酶等促進腫瘤基質(zhì)重構(gòu)、新生血管生成、腫瘤細胞增殖及轉(zhuǎn)移。Solberg等［15］在體外誘導(dǎo)單核細胞向巨噬細胞分化過程中觀察到Legumain的表達升高，特別是在M2型巨噬細胞中的表達更顯著。Luo等［16］發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織中腫瘤相關(guān)巨噬細胞高表達Legumain，而起到免疫監(jiān)視和抗原提呈作用的M1型巨噬細胞則不表達Legumain，由于這一表達特點，靶向Legumain殺傷腫瘤相關(guān)巨噬細胞的藥物不會干擾M1型巨噬細胞的細胞毒反應(yīng)及抗原提呈等生物學(xué)功能。吳文苑等［17］為研究腫瘤新生血管內(nèi)皮細胞高表達的Legumain對血管內(nèi)皮的影響，在低氧條件下培養(yǎng)人血管內(nèi)皮細胞株HUVEC，使Legumain高表達，血管內(nèi)皮細胞的管腔形成增多，表明在腫瘤組織血管內(nèi)皮細胞高表達的Legumain可能促進腫瘤新生血管的形成，改善腫瘤血供，促進腫瘤生長。

1.4Legumain高表達對惡性腫瘤細胞的作用及機制Legumain在惡性腫瘤組織的表達增高主要起到促進惡性腫瘤細胞侵襲及轉(zhuǎn)移的作用。Wu等［9］對人乳腺癌切除標本通過免疫組化方法觀察到乳腺癌細胞Legumain的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，認為Legumain可能參與了乳腺癌的轉(zhuǎn)移過程。同樣，國內(nèi)吳文苑等［17］體外培養(yǎng)人乳腺癌細胞系MDA MB231，在不同濃度Legumain蛋白的作用下，隨著Legumain蛋白濃度的增加，乳腺癌細胞的遷移能力明顯增強。在體外培養(yǎng)的胃癌［2］和卵巢癌［18］細胞中，也同樣觀察到Legumain過表達能夠促進惡性腫瘤細胞的遷移及浸潤。Li等［2］進一步通過制備穩(wěn)定過表達Legumain的裸鼠胃癌腫瘤模型，注射給予Legumain抑制劑（APEI）抑制Legumain表達，證實Legumain在體內(nèi)也能夠明顯抑制腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移。Legumain促進惡性腫瘤細胞侵襲及轉(zhuǎn)移的機制目前仍不明確，研究認為，Legumain主要通過蛋白水解作用活化組織蛋白酶［19］，如組織蛋白酶B、L（cathepsins B、L），降解腫瘤基質(zhì)，促進腫瘤細胞的侵襲及轉(zhuǎn)移。此外，在多種惡性腫瘤組織中，Legumain的表達與基質(zhì)金屬蛋白-2（MMP-2）的表達及活性也呈正相關(guān)［1-2］，但Legumain能否直接調(diào)控MMP-2的表達及活化仍需進一步研究。除MMP-2外，另一備受關(guān)注的分子為整合素，在遷移中的大腸癌、乳腺癌等惡性腫瘤細胞前端均發(fā)現(xiàn)Legumain與整合素有重疊［1，9］，Legumain可能通過整合素途徑促進腫瘤細胞的遷移及轉(zhuǎn)移。

雖然Legumain在體內(nèi)能夠促進腫瘤的生長，但對體外培養(yǎng)的胃癌及卵巢癌細胞卻沒有促進增殖的作用［2，18］，這可能與腫瘤在體內(nèi)及體外的生長環(huán)境不同有關(guān)。但是，Andrade等［10］在體外培養(yǎng)人肝癌細胞系SKHep1，通過RNA干擾（RNAi）技術(shù)沉默Legumain的表達，發(fā)現(xiàn)細胞增殖受到明顯抑制，并且通過Legumain抑制劑抑制Legumain活性后，并未影響Legumain促進腫瘤細胞增殖的作用，認為Legumain促進腫瘤細胞增殖的作用是獨立于其蛋白水解酶活性之外的，進一步研究發(fā)現(xiàn)，Legumain基因沉默抑制腫瘤細胞增殖是由于影響了細胞周期，減少了處于G2/M期細胞的比例，而不是通過促進凋亡作用。而吳文苑等［20］的研究發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)能夠穩(wěn)定過表達Legumain的人胚胎腎細胞株HEK293，應(yīng)用腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和放線菌酮（CHX）共同誘導(dǎo)細胞凋亡，表明Legumain過表達能夠抑制凋亡。D′Costa等［7］也在實驗中發(fā)現(xiàn)，Legumain過表達能夠抑制體外培養(yǎng)的乳腺癌細胞的凋亡，進而促進乳腺癌細胞的增殖。因此，Legumain在體外是否具有促進腫瘤細胞增殖及抑制凋亡的作用仍存在不同觀點。

2　Legumain在腫瘤診斷成像技術(shù)中的應(yīng)用

腫瘤診斷成像技術(shù)主要包括磁共振成像（MRI）、正電子發(fā)射計算機斷層掃描（PET）、X射線斷層掃描光影像（CT）、超聲造影、熒光分子成像等［21］。利用熒光探針對腫瘤早期病變進行靶向性識別和診斷是研究的熱點。已有多項研究以Legumain為靶點進行熒光探針的開發(fā)。Edginfton等［22］設(shè)計開發(fā)了基于Legumain活性的熒光標記探針，能夠與Legumain特異性共價結(jié)合而發(fā)出熒光，實現(xiàn)體內(nèi)腫瘤的無創(chuàng)性成像，更具特異性和有效性。此外，Chen等［23］開發(fā)了一種新型的MRI對比劑和近紅外熒光探針，能夠增強表達Legumain腫瘤的成像。而Jiang等［24］基于分子動力學(xué)模擬方法設(shè)計了熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）探針，用于檢測體內(nèi)Legumain，能夠靈敏地檢測早期腫瘤。

3　以Legumain為靶點研制腫瘤基因疫苗

基因疫苗是將編碼抗原的基因通過載體導(dǎo)入體內(nèi)，使其在一定時限內(nèi)能持續(xù)表達抗原蛋白，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，達到防病治病的作用。由于基因疫苗可以激活細胞毒T淋巴細胞而誘導(dǎo)細胞免疫，因此是抗腫瘤免疫領(lǐng)域的研究熱點。近年來，有研究針對Legumain進行了抗腫瘤基因疫苗的研制。Smahel等［25］為提高Legumain基因疫苗誘導(dǎo)的有效免疫效應(yīng)，對Legumain基因進行了一些修改，首先，使Legumain保守序列RGD序列突變?yōu)镚GD或RGG，然后插入破傷風(fēng)毒素p30表位，從而減少了成熟Legumain的產(chǎn)生，增強了免疫原性，通過基因槍給藥后，顯著增強了機體對legumain的免疫應(yīng)答反應(yīng)。而Lewēn等［26］構(gòu)建了編碼Legumain的H-2D 和H-2K的小基因病毒表達載體，轉(zhuǎn)染入鼠傷寒沙門菌中制成疫苗，可口服給藥，小基因疫苗具有與全基因疫苗相似的抗腫瘤效果，能夠抑制小鼠乳腺癌的生長及轉(zhuǎn)移，且比全基因疫苗更具有靈活性。Karyampudi等［27］為解決腫瘤微環(huán)境普遍存在的免疫抑制作用對基因疫苗誘導(dǎo)的免疫效應(yīng)的消減問題，提出聯(lián)合用藥能夠增強疫苗的抗腫瘤效應(yīng)，針對腫瘤抑制免疫的主要機制PD-1/B7-H1抑制軸，應(yīng)用抗PD-1抗體和包括Legumain在內(nèi)的多肽疫苗聯(lián)合給藥觀察其對小鼠乳腺癌的治療作用，發(fā)現(xiàn)這種方法能提高抗腫瘤免疫效應(yīng)，延長小鼠的生存期，具有重要的臨床應(yīng)用價值。

4　開發(fā)Legumain激活的抗腫瘤前體藥物

化療藥物由于對細胞沒有選擇性而常導(dǎo)致一些不良反應(yīng)，如心臟、腎臟損害、骨髓抑制、脫發(fā)等，Legumain是人體內(nèi)唯一一種天冬酰胺肽鏈內(nèi)切酶，在腫瘤組織特異性高表達，而正常組織不表達，這一表達特點為化療藥物的靶向性研究提供了新思路。Smith等［28］設(shè)計合成了秋水仙素的前體藥物，能夠被Legumain特異性地裂解而激活，不但提高腫瘤細胞對前體藥物的攝取率，而且高濃度藥物集中在癌灶內(nèi)也降低了對正常細胞的毒副作用，增強抗癌活性，改善腫瘤患者對藥物的耐受性。Liu等［29］設(shè)計合成了有絲分裂抑制劑E（MMAE）的前體藥物8，該前體藥物能夠與腫瘤細細胞膜表面高表達的糖蛋白整合素αvβ3相連，并被Legumain催化為有活性的MMAE，在動物實驗中能有效抑制乳腺癌的生長和轉(zhuǎn)移，并且對白細胞的毒性極低。此外，Liu等［30］通過改造攜帶化療藥物的載體以實現(xiàn)藥物高效、特異性地靶向腫瘤，他們設(shè)計開發(fā)了一種Legumain蛋白激活的AANTAT-脂質(zhì)體載體，該脂質(zhì)體所攜帶的AAN為Legumain的底物丙氨酸-丙氨酸-天冬酰胺，TAT為一種細胞穿膜肽，能攜帶大分子物質(zhì)進入細胞，AAN的添加使TAT的跨膜轉(zhuǎn)運能力下降，通過實驗證實，在腫瘤部位高表達的Legumain的催化下，TAT脂質(zhì)體能夠被釋放并恢復(fù)穿膜能力，進入腫瘤細胞發(fā)揮殺癌效應(yīng)，為提高抗癌藥物的靶向性、高效性、低毒性提供了一種新方法。

綜上所述，Legumain作為一種新發(fā)現(xiàn)的與腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的蛋白酶，對腫瘤細胞和腫瘤微環(huán)境都有重要的作用，進一步闡明Legumain在腫瘤生長和轉(zhuǎn)移中的作用及機制，以及Legumain表達的調(diào)控機制，可為惡性腫瘤的診斷、治療和預(yù)防提供新的靶點。

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（2015-12-08）