自噬在惡性腫瘤中的研究進展*

張　露，蔣夢彤 綜述，陳　罡，李　佳審校（廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，廣西南寧530021）

自噬在惡性腫瘤中的研究進展*

張露，蔣夢彤 綜述，陳罡，李佳△審校
（廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，廣西南寧530021）

自噬；腫瘤；溶酶體；細胞器；綜述

自噬（autophagy）是真核細胞內(nèi)的一種降解途徑，能通過溶酶體使細胞內(nèi)受損的細胞器及蛋白質(zhì)等成分降解，廣泛存在于人體的正常細胞和惡性腫瘤細胞中。自噬與惡性腫瘤的關(guān)系是近年生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點，多數(shù)研究采用不同的方法探討二者的關(guān)系，而研究結(jié)論偏向于自噬在惡性腫瘤中起著促進與抑制的雙重作用，但針對這些研究方法的文獻綜述較少。本文針對自噬在惡性腫瘤中常用的研究方法及其優(yōu)缺點進行綜述，以期為惡性腫瘤研究工作中自噬研究方法的選擇及結(jié)果解釋提供幫助。

1　自噬與惡性腫瘤

自噬的概念最先由比利時科學(xué)家Christian de Duve提出，它是真核細胞內(nèi)的一種降解途徑，能通過溶酶體使細胞內(nèi)受損的細胞器及蛋白質(zhì)等成分降解。自噬性降解是機體內(nèi)的一種病理生理過程，這一過程主要包括隔離膜（isolation membrane）或吞噬泡（phagophore）的形成及延伸、自噬體（autophagosome）的形成、自噬體和溶酶體融合形成自噬溶酶體（autolysosome），最終胞內(nèi)物質(zhì)降解，產(chǎn)生的降解產(chǎn)物如氨基酸、脂肪酸等可被細胞再利用。自噬現(xiàn)象的出現(xiàn)是以實現(xiàn)細胞的穩(wěn)態(tài)和細胞器的更新為目的，對細胞來說是一種有利的修復(fù)與防御機制。Meijer等［1］的研究表明，哺乳動物細胞有著基礎(chǔ)的自噬來降解并回收損傷的細胞器及蛋白質(zhì)，同時，自噬降解后的產(chǎn)物可為細胞提供生存所必需的能量。而Gozuacik等［2］的研究提出了一些惡性腫瘤的發(fā)生伴隨有自噬水平的抑制。自噬與惡性腫瘤的關(guān)系吸引了眾多研究人員的關(guān)注，成為國際學(xué)術(shù)界的研究熱點。大量研究發(fā)現(xiàn)，自噬與惡性腫瘤的耐藥、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移相關(guān)［3］，而自噬相對惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展來說是一把“雙刃劍”［4］，既可起到促進的作用又可表現(xiàn)出抑制的效果。作者認為這除了與自噬本身的復(fù)雜性和其作用于惡性腫瘤的方式、途徑及分子機制不盡相同相關(guān)外，還與研究自噬所采用的方法相關(guān)。

2　自噬的人工干預(yù)和調(diào)節(jié)

正常情況下培養(yǎng)的細胞自噬活性很低，而一些惡性腫瘤的自噬水平又是受抑制的［2］。這不利于自噬現(xiàn)象的觀察，對自噬進行人工干預(yù)和調(diào)節(jié)就顯得很有必要。研究中常用工具藥實現(xiàn)，有時根據(jù)研究目的，使用到一些遺傳學(xué)技術(shù)，可以在基因的分子水平上對自噬進行干預(yù)。

2.1工具藥自噬的工具藥可分為與自噬相關(guān)的抑制劑和誘導(dǎo)劑2種。常用的自噬抑制劑有3-甲基腺嘌呤（3-MA）［5］、巴弗洛霉素A1［6］及氯喹［7］，而常用的自噬誘導(dǎo)劑有西羅莫司、氯化鋰［8］及構(gòu)造營養(yǎng)缺乏的環(huán)境［9］。工具藥可以根據(jù)不同的原理干預(yù)和調(diào)節(jié)自噬，例如，3-MA可抑制ClassⅢ磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）信號通路來抑制自噬體的形成，以此阻斷自噬發(fā)生的步驟，而西羅莫司可抑制mTOR通路，以此誘導(dǎo)自噬活性增強。因此，工具藥的選擇應(yīng)根據(jù)研究目的而定。

2.2遺傳學(xué)技術(shù)自噬的遺傳學(xué)技術(shù)包括RNA干擾（RNAi）技術(shù)與近年發(fā)展起來的CRISPR-Cas9技術(shù)［10］（最新出現(xiàn)的一種由RNA指導(dǎo)的Cas9核酸酶對靶向基因進行編輯的技術(shù)）。RNAi是指利用與靶基因序列同源的雙鏈RNA（dsRNA）可誘導(dǎo)特異性基因沉默的一種現(xiàn)象，因此RNAi技術(shù)可用于沉默或直接敲除目標(biāo)基因的表達，同時具有較高特異性的特點，該技術(shù)目前普遍用于基因分子水平上的研究。通過RNAi技術(shù)沉默惡性腫瘤中與自噬相關(guān)的基因，觀察自噬活性的變化，從而得出自噬與惡性腫瘤間的聯(lián)系，可以為惡性腫瘤的靶向治療提供新思路［11］。CRISPR-Cas9技術(shù)被稱為接近目標(biāo)基因組編輯的最終工具包，因其在基因組編輯中所體現(xiàn)出的超高的效率和簡易的技術(shù)而吸引著眾多科研工作者，同時被認為是在體細胞基因分子水平治療上的一個新機遇［12］。Kim等［13］通過CRISPR-Cas9技術(shù)成功敲除自噬相關(guān)基因ATG5［14］，用以研究敲除ATG5后的黑色素瘤細胞中自噬抵抗BH3模擬棉酚所起的保護作用。CRISPR-Cas9技術(shù)開啟了自噬與惡性腫瘤關(guān)系研究方法上的新篇章，而對于通過自噬相關(guān)分子及基因治療惡性腫瘤，更是提供了無限的可能與巨大的探索空間。綜上，遺傳學(xué)技術(shù)相比工具藥特異性更強，二者相互結(jié)合，可以更好地使研究者根據(jù)研究目的對自噬進行人工干預(yù)和調(diào)節(jié)。

3　自噬的檢測方法

自噬在體內(nèi)是一個隨時間不斷變化的過程，自噬發(fā)生的步驟猶如一條“流水線”，先是隔離膜或吞噬泡的集結(jié)和延伸，接著自噬體形成，形成的自噬體與溶酶體融合，最后自噬性底物降解，產(chǎn)物就會被輸送至細胞質(zhì)中為細胞提供能量。為了保證細胞快速適應(yīng)惡劣環(huán)境的變化，這一“流水線”的過程就會非?？?，使自噬現(xiàn)象的檢測比較困難。目前，自噬的檢測方法主要基于這條“流水線”中的某一“時空點”或者某一“時空段”，相對自噬這一動態(tài)過程，這些檢測方法本質(zhì)上均是靜態(tài)的。

3.1基于“時空點”的檢測該類檢測常用的有透射電子顯微鏡、LC3免疫印跡及LC3單熒光檢測，這些均基于自噬體的直接或間接檢測原理。

3.1.1透射電子顯微鏡透射電子顯微鏡主要通過觀察自噬性結(jié)構(gòu)［15］的形成及數(shù)量來判斷自噬的發(fā)生，所觀察的自噬性結(jié)構(gòu)中最主要的是自噬體，因此是自噬體的直接檢測方法［16］。透射電子顯微鏡檢測結(jié)果的準確性基于觀察者對自噬體在鏡下結(jié)構(gòu)的準確判斷，這就不可避免地存在一定的主觀性，同時，樣本的制備也可影響觀察者的判斷。例如，脂質(zhì)雙分子層受制備過程所用試劑的影響而發(fā)生改變，影響對自噬體膜的判斷，也可因不同切面自噬體數(shù)量不一而在推算整個細胞的自噬情況時結(jié)果出現(xiàn)誤差。由此可見，透射電子顯微鏡探索自噬現(xiàn)象是基于形態(tài)學(xué)的觀察，同樣存在著不足的地方，使用時應(yīng)結(jié)合其他檢測來相互驗證。

3.1.2LC3免疫印跡LC3為自噬體膜上多功能標(biāo)記蛋白［17］。自噬形成時，彌漫于細胞質(zhì)中的LC3（即LC3-Ⅰ）與磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE）偶聯(lián)，轉(zhuǎn)變成LC3-Ⅱ附著于自噬體膜上，當(dāng)自噬體向溶酶體呈遞后方才降解消失。因此，通過免疫印跡檢測LC3-Ⅱ的表達或測定LC3-Ⅱ與LC3-Ⅰ比值可以從一定程度反映自噬體數(shù)量的多少［18］，這種檢測即是基于自噬體間接的檢測原理。這一方法的缺陷在于LC3抗體對LC3蛋白的2種類型親和力不相同，對LC3-Ⅱ有更高的親和力，因此會出現(xiàn)較高的假陽性率。

3.1.3綠色熒光蛋白（GFP）-LC3單熒光檢測該方法的檢測原理也是基于LC3在自噬形成過程中與PE偶聯(lián)并錨定于自噬體膜上的現(xiàn)象，利用GFP與LC3融合，根據(jù)熒光顯微鏡下綠色熒光斑點來示蹤自噬形成［19］。自噬沒有發(fā)生時，GFP-LC3融合蛋白彌漫分布于細胞質(zhì)中，而當(dāng)自噬發(fā)生之后，GFP-LC3融合蛋白就會集結(jié)且錨定在自噬體膜上，此時使用熒光顯微鏡即可觀察到相對明顯的綠色熒光斑點，而這些斑點代表的就是自噬體，再通過計數(shù)斑點數(shù)，就可以估測自噬體的數(shù)量。

3.2基于“時空段”的檢測該種檢測有別于“時空點”檢測。“時空點”檢測得出的結(jié)果大多解釋為自噬體數(shù)量的多少，而這可能由于自噬某一通路受阻使得自噬體數(shù)量多少與自噬活性強弱不相符［20］?！皶r空段”的檢測包含了自噬形成的多個步驟及自噬降解過程的檢測，因此可檢測到自噬流（autophagic flux）［21］，這使得在形態(tài)學(xué)檢測基礎(chǔ)上進一步進行功能學(xué)檢測成為可能，可在一定程度上得知自噬活性的強弱，但仍舊無法實時地監(jiān)測自噬現(xiàn)象所發(fā)生的全部過程。“時空段”常見的檢測方法有紅色熒光蛋白（RFP）-GFP-LC3雙熒光檢測、LC3動態(tài)檢測、長壽命蛋白降解檢測。

3.2.1RFP-GFP-LC3雙熒光檢測在GFP-LC3單熒光指示體系的基礎(chǔ)上，增加RFP，利用GFP在酸性環(huán)境下其綠色熒光會發(fā)生淬滅而RFP對酸性環(huán)境不敏感及其紅色熒光不會發(fā)生淬滅的原理進行自噬活性的檢測［22］。結(jié)果判讀時，通過顯微鏡成像后紅綠熒光融合，融合后出現(xiàn)的黃色斑點即是自噬體，紅色斑點是自噬溶酶體。因此，可通過計數(shù)不同顏色的斑點來反映自噬流的強弱。這種檢測方法的缺點在于不能反映出自噬降解的過程，同時，溶酶體酶的活力及其pH值也可影響信號的檢測。

3.2.2LC3動態(tài)檢測從自噬體形成、自噬體向溶酶體呈遞，到自噬性底物降解，這些步驟的發(fā)生均伴隨著LC3量的不斷變化。通過LC3動態(tài)檢測，即可將這個變化的過程反映出來，從而反映自噬活性的強弱。LC3動態(tài)檢測所采用的技術(shù)手段有免疫印跡，也可通過流式細胞儀檢測，也有研究通過加入一種溶酶體抑制劑來比較LC3-Ⅱ前后的差別，得出加入溶酶體抑制劑后LC3-Ⅱ表達增多的那部分，代表的即是被溶酶體所要降解的自噬體［23］。

3.2.3長壽命蛋白降解檢測哺乳動物體內(nèi)蛋白質(zhì)的降解可通過蛋白酶體ATP依賴的泛素降解和溶酶體ATP非依賴降解2種途徑，蛋白酶體主要負責(zé)降解短壽命蛋白，而長壽命蛋白則主要通過溶酶體途徑降解。根據(jù)溶酶體降解長壽命蛋白并在自噬誘導(dǎo)后與自噬體相融合的特性，將同位素標(biāo)記法應(yīng)用于細胞培養(yǎng)基，細胞合成的蛋白就會被同位素標(biāo)記，而后把細胞轉(zhuǎn)移至不含同位素的普通細胞培養(yǎng)基，使被標(biāo)記的短壽命蛋白優(yōu)先降解，隨后開始自噬誘導(dǎo)，誘導(dǎo)后自噬活性增強，長壽命蛋白隨之降解，此時測定上清液的放射活度，即反映出細胞經(jīng)由自噬來降解底物的能力［24］。

4　自噬在體內(nèi)的研究方法

自噬在體內(nèi)的研究方法已有先例，Mizushima［25］已成功構(gòu)建GFP-LC3轉(zhuǎn)基因小鼠，使得體內(nèi)實時監(jiān)控自噬成為可能。但目前有關(guān)自噬在體內(nèi)的研究方法的文獻不多，因此，使用GFP-LC3轉(zhuǎn)基因小鼠進行體內(nèi)自噬研究時，要結(jié)合體外自噬的檢測方法，以避免單一方法的局限性。

5　小結(jié)與展望

本文簡單概述了自噬與惡性腫瘤的研究現(xiàn)狀并列舉了自噬的人工干預(yù)和調(diào)節(jié)方法、自噬的檢測方法及自噬在體內(nèi)的研究方法，這些方法普遍應(yīng)用于惡性腫瘤中自噬現(xiàn)象的研究。遺憾的是，目前還沒有一種方法可以準確可靠而特異地檢測自噬，因此，自噬在惡性腫瘤中表現(xiàn)出的抑制與促進的雙重作用也可能與自噬的研究方法使用不當(dāng)相關(guān)。為了避免研究方法引起實驗結(jié)果解釋上的錯誤，就需要研究者理性地評估每一個研究結(jié)論。同時，自噬研究方法上的不足也為有志研究這一領(lǐng)域的科研工作者提供了巨大的探索空間，自噬與惡性腫瘤關(guān)系的研究也有望為惡性腫瘤的臨床治療提供新靶點。

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10.3969/j.issn.1009-5519.2016.07.020

A

1009-5519（2016）07-1018-04

廣西壯族自治區(qū)自然科學(xué)基金青年基金（2015GXNSFBA139158）。

△，E-mail：jialee2005@126.com。

（2015-12-19）