畜牧業(yè)領(lǐng)域中轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)的應(yīng)用

達(dá) 賴，王鳳武，李向宇

（內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031）

畜牧業(yè)領(lǐng)域中轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)的應(yīng)用

達(dá) 賴，王鳳武，李向宇

（內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031）

轉(zhuǎn)基因技術(shù)以及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的出現(xiàn)是生物以及生命科學(xué)領(lǐng)域里程碑式的事件。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)是研究基因功能、生物治療醫(yī)學(xué)以及探索生命本質(zhì)關(guān)鍵事件的有效技術(shù)手段。雖然轉(zhuǎn)基因技術(shù)的研究和應(yīng)用在畜牧業(yè)領(lǐng)域起步較晚，但卻擁有廣闊的發(fā)展前景。綜述了轉(zhuǎn)基因動(dòng)物關(guān)鍵技術(shù)及其在轉(zhuǎn)基因家畜生產(chǎn)過(guò)程中所面臨的主要問題，以期為后續(xù)研究提供參考。

轉(zhuǎn)基因技術(shù)；轉(zhuǎn)基因家畜；畜牧生產(chǎn)

1 在模式動(dòng)物小鼠中干細(xì)胞及轉(zhuǎn)基因技術(shù)的研究應(yīng)用

1980年，Gordon等［1］發(fā)現(xiàn)外源DNA注射到由單一細(xì)胞胚胎而生成的轉(zhuǎn)基因鼠中能夠與小鼠基因組融合并表達(dá)，并且轉(zhuǎn)基因鼠所獲得的新的遺傳性狀是可以遺傳的。自此，原核注射技術(shù)得到廣泛應(yīng)用，同時(shí)，該技術(shù)也成為哺乳動(dòng)物基因功能研究的主要手段之一。轉(zhuǎn)基因家畜的生產(chǎn)也采用了原核注射技術(shù)。相對(duì)于小鼠，利用原核注射技術(shù)及胚胎移植技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因家畜的成功比率大為降低。對(duì)于所有物種來(lái)說(shuō)，應(yīng)用原核注射普遍存在2個(gè)方面的問題，即插入位點(diǎn)的不可預(yù)測(cè)性和能夠表達(dá)的轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)。另外，該技術(shù)對(duì)所需遺傳材料有著嚴(yán)格的限制。

隨著鼠胚胎干細(xì)胞轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，原核注射技術(shù)所面臨的障礙已經(jīng)被部分規(guī)避［2-4］。胚胎干細(xì)胞系分離自早期胚胎中未分化的細(xì)胞，培養(yǎng)過(guò)程中具有分化為胚胎各個(gè)組織的潛能。因此，胚胎干細(xì)胞經(jīng)體外修飾后，可返回到早期胚胎內(nèi)正常發(fā)育，該過(guò)程可以產(chǎn)生嵌合體動(dòng)物。嵌合體動(dòng)物的所有組織，包括生殖細(xì)胞在內(nèi)，通常由宿主胚胎和外源干細(xì)胞2種基因型構(gòu)成。通過(guò)利用同源重組原理，在胚胎干細(xì)胞內(nèi)以單拷貝外源基因?yàn)榘邢蚨c(diǎn)原位修飾現(xiàn)有基因，可實(shí)現(xiàn)更為精準(zhǔn)的遺傳修飾。目前，限制該技術(shù)廣泛應(yīng)用的主要問題在于僅能在小鼠中獲得類似全能的胚胎干細(xì)胞［5］。

2 在家畜中干細(xì)胞及轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用及所面臨的挑戰(zhàn)

缺乏可利用的胚胎干細(xì)胞以及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的維護(hù)費(fèi)用較高是導(dǎo)致利用原核注射技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因家畜效率較低的重要原因。雖然文獻(xiàn)描述的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物擁有廣闊的前景，但是成功的例子卻很少。利用轉(zhuǎn)基因家畜生產(chǎn)價(jià)格昂貴的藥用蛋白或許可以承受轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)的低效率和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物維護(hù)的高成本。以細(xì)胞為基礎(chǔ)的家畜克隆以及以細(xì)胞為基礎(chǔ)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展有可能改變這一現(xiàn)狀。但是，據(jù)此認(rèn)為轉(zhuǎn)基因家畜會(huì)顯著改變現(xiàn)有邏輯和生物界限的可能性并不大。

通過(guò)核移植或胚胎干細(xì)胞形成嵌合體的方式，在細(xì)胞層面上進(jìn)行轉(zhuǎn)基因的方法具有無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)［6-8］。該種轉(zhuǎn)基因方法不必直接對(duì)胚胎進(jìn)行操作，而是對(duì)可不斷進(jìn)行繁殖的細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾。這就解決了遺傳材料的限制性，同時(shí)使得操作更具有便利性和可行性，也可使轉(zhuǎn)基因操作以一定的規(guī)模進(jìn)行。因此，規(guī)模化操作后可以方便地檢測(cè)外源基因是否表達(dá)，經(jīng)篩選后可獲得大量的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。這些轉(zhuǎn)基因細(xì)胞可以無(wú)限量地克隆繁殖，而每個(gè)克隆繁殖的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞都具有產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的潛能。更方便的是，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中的DNA在進(jìn)行轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)前可進(jìn)行編輯和修飾，從而使得生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物更接近于試驗(yàn)和生產(chǎn)目標(biāo)。而后，利用這些轉(zhuǎn)基因細(xì)胞進(jìn)行核移植，從而生產(chǎn)克隆動(dòng)物，所產(chǎn)生的動(dòng)物100%將是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物［9］。該種基于細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因方法在家畜上已經(jīng)取得成功，世界首例轉(zhuǎn)基因綿羊“Polly”的生產(chǎn)就是基于該種方法。原則上講，DNA通過(guò)同源重組整合進(jìn)入基因組的比率非常低，因此，很難進(jìn)行篩選鑒別。但是，通過(guò)遺傳修飾的轉(zhuǎn)基因克隆細(xì)胞能夠提供可借鑒的手段和途徑。盡管這并未在進(jìn)行核移植的細(xì)胞中得到證明，但是，使用與鼠胚胎干細(xì)胞相同的常規(guī)技術(shù)已經(jīng)在人體細(xì)胞中成功實(shí)現(xiàn)了基因的靶向修飾。然而，轉(zhuǎn)基因克隆技術(shù)的一個(gè)主要應(yīng)用方面有可能是通過(guò)基因的靶向修飾從而使體細(xì)胞攜帶有細(xì)微改變的基因進(jìn)而生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。唯一障礙在于符合基因打靶修飾要求的細(xì)胞有可能與核移植的要求不兼容［10-11］。

轉(zhuǎn)基因家畜通常采用體細(xì)胞為靶細(xì)胞經(jīng)遺傳修飾進(jìn)而克隆生產(chǎn)，而胚胎干細(xì)胞則被認(rèn)為是沒有必要的。然而，鼠胚胎干細(xì)胞非常適合基因打靶，也可以為移植治療提供一個(gè)體外分化模型。這些有可能是科研工作者仍執(zhí)著于家畜胚胎干細(xì)胞研究的動(dòng)力所在。大量研究顯示，在倉(cāng)鼠、貂、鼠、雞、牛、羊、豬和獼猴等眾多的物種中都有類胚胎干細(xì)胞的存在。然而，目前沒有研究解決干細(xì)胞生產(chǎn)的嵌合體動(dòng)物的生殖傳遞問題。盡管研究者付出了大量的努力，但是生殖胚胎干細(xì)胞技術(shù)的應(yīng)用目前仍局限于小鼠。

即使胚胎干細(xì)胞的來(lái)源不存在問題，但是由胚胎干細(xì)胞克隆轉(zhuǎn)基因家畜必須經(jīng)歷嵌合體生產(chǎn)的額外環(huán)節(jié)，因而有可能面臨致命的缺陷。相比之下，通過(guò)體細(xì)胞克隆在第1代就會(huì)獲得轉(zhuǎn)基因個(gè)體。胚胎干細(xì)胞通過(guò)嵌合體途徑生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物最大的不利在于其必須檢測(cè)所有的嵌合體動(dòng)物以確定其是否擁有生殖傳遞能力。而體細(xì)胞克隆可通過(guò)直接在早期檢測(cè)受體是否受孕即可判定轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)的成功與否。

利用胚胎干細(xì)胞和體細(xì)胞克隆生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物各有優(yōu)缺點(diǎn)。研究者可以在核移植過(guò)程中對(duì)其進(jìn)行集成并加以利用，從而獲得良好效果。目前研究發(fā)現(xiàn)，家畜干細(xì)胞系與鼠干細(xì)胞系的不同之處在于其難以適應(yīng)單細(xì)胞克隆以及基因多次打靶的要求。另外，前期的體細(xì)胞核移植結(jié)果顯示核供體細(xì)胞必須處于細(xì)胞周期的G0期，這極有可能是因?yàn)楹斯w和受體卵細(xì)胞質(zhì)的細(xì)胞循環(huán)要有一定兼容性以及在這一狀態(tài)下核供體基因組更利于重編程［12］。此外，在體細(xì)胞發(fā)育程序被啟動(dòng)后，其基因表達(dá)程序?qū)?huì)被關(guān)閉也有可能是細(xì)胞處于G0期的一個(gè)重要原因。與成纖維細(xì)胞不同，胚胎干細(xì)胞在任何情況下，甚至是在血清饑餓狀態(tài)下都不會(huì)輕易進(jìn)入G0期狀態(tài)。因此，直到目前，有幾個(gè)重要問題仍處于探索階段：是否有新的方法使胚胎干細(xì)胞有效進(jìn)入G0期；分化后的胚胎干細(xì)胞能否進(jìn)入細(xì)胞G0期；家畜的類胚胎干細(xì)胞能否滿足基因打靶的要求。

3 動(dòng)物干細(xì)胞及轉(zhuǎn)基因技術(shù)在畜牧業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用展望

自“Polly”誕生以來(lái)，小鼠、大鼠、牛、山羊等多個(gè)物種的體細(xì)胞克隆動(dòng)物相繼獲得。該項(xiàng)技術(shù)無(wú)論在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)還是在家畜育種研究方面都具有極高的應(yīng)用價(jià)值。影響細(xì)胞克隆家畜生產(chǎn)效率的關(guān)鍵因素之一是細(xì)胞的選擇和篩選［13］。理想的核供體細(xì)胞至少應(yīng)該具備2個(gè)方面的特性：較高的增殖能力和細(xì)胞核較易被重編程并可獲得克隆家畜。隨著研究的深入，也遇到了一系列不可避免的問題，如：成體干細(xì)胞含量極微，分離和純化較難；成體干細(xì)胞增殖能力弱，而且在一些遺傳性疾病中，遺傳缺陷也會(huì)出現(xiàn)在成體干細(xì)胞中。因此，在畜牧業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐中，以該種干細(xì)胞作為家畜克隆的細(xì)胞系是有缺陷的。胚胎干細(xì)胞盡管增殖力強(qiáng)，但其面臨的無(wú)控制性、致瘤和倫理問題限制了它的應(yīng)用。當(dāng)前比較普遍使用的核供體細(xì)胞是成纖維細(xì)胞。利用成纖維細(xì)胞作為核供體細(xì)胞雖然較易得到克隆家畜，但其生產(chǎn)效率較低，特別是難以滿足作為種質(zhì)資源進(jìn)行長(zhǎng)期儲(chǔ)存和規(guī)?；a(chǎn)的需要。同時(shí)，多潛能干細(xì)胞在疾病的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中所扮演的重要角色長(zhǎng)期以來(lái)一直被研究者所忽視。干細(xì)胞在MHC的表達(dá)方面所具有的特性及其在生物進(jìn)化以及疾病發(fā)生方面的作用是值得深入研究的重要課題。

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S813.3；S818.9

A文章順序編號(hào)：1672-5190（2016）09-0105-03

2016－08－10

項(xiàng)目來(lái)源：內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)創(chuàng)新基金“蒙古羊機(jī)體組織中表達(dá)Oct-4、SSEA-1的多潛能干細(xì)胞的生物學(xué)特性研究”（2016CXJJM04）；國(guó)家科技計(jì)劃項(xiàng)目“特色肉用綿羊種質(zhì)資源群體選育與利用”（2015BAD 03B0505）；國(guó)家轉(zhuǎn)基因重大專項(xiàng)“高品質(zhì)毛轉(zhuǎn)基因羊新品種培育”（2014ZX08008-004）。

達(dá)賴（1979—），男，副研究員，碩士，主要研究方向?yàn)閯?dòng)物遺傳育種。

（責(zé)任編輯：趙俊利）