EDTA對(duì)鎘脅迫下紫云英種子萌發(fā)及幼苗生理抗性的影響

楊 鵬，陳興銀，田玲玲，張凱凱，徐玲玲，關(guān) 萍

(貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025)

EDTA對(duì)鎘脅迫下紫云英種子萌發(fā)及幼苗生理抗性的影響

楊 鵬，陳興銀，田玲玲，張凱凱，徐玲玲，關(guān) 萍*

(貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025)

采用水培法研究不同濃度EDTA(乙二胺四乙酸)對(duì)鎘脅迫下紫云英(AstragalussinicusL.)種子萌發(fā)及幼苗生理抗性的影響，為重金屬污染植物復(fù)合修復(fù)提供科學(xué)依據(jù)。結(jié)果表明：?jiǎn)我坏逆k(濃度為100 mg/L)脅迫紫云英時(shí)，能促進(jìn)種子萌發(fā)，增加幼苗中丙二醛(MDA)的含量以及過氧化物酶(POD)的活性，但是會(huì)抑制幼苗的生長(zhǎng)、降低幼苗的葉綠素含量以及超氧化物歧化酶(SOD)的活性。當(dāng)在鎘溶液中添加不同濃度的EDTA時(shí)，隨著EDTA濃度的增加，其種子發(fā)芽率、幼苗長(zhǎng)勢(shì)、葉綠體含量以及POD活性都呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢(shì)。就供試材料而言，在一定濃度范圍內(nèi)的EDTA能緩解鎘脅迫紫云英幼苗的傷害作用，其中以0.05 mmol/L的EDTA處理效果最為明顯。

紫云英；種子萌發(fā)；鎘；EDTA；葉綠素

環(huán)境污染問題已成為當(dāng)今社會(huì)關(guān)注的一大熱點(diǎn)話題。近年來，隨著我國(guó)工業(yè)的快速發(fā)展，極大促進(jìn)了我國(guó)經(jīng)濟(jì)高速提升的同時(shí)也加劇了我國(guó)的環(huán)境污染。據(jù)調(diào)查顯示，當(dāng)前我國(guó)重金屬超標(biāo)點(diǎn)位占全部超標(biāo)點(diǎn)位的82.8%，其中鎘(Cd)污染最為嚴(yán)重，超標(biāo)率高達(dá)7.0%[1]。由于重金屬污染具有隱蔽性、長(zhǎng)期性、表聚性和不可逆性等特點(diǎn)，尋求經(jīng)濟(jì)、高效、環(huán)保等重金屬污染解決辦法已迫在眉睫[2]。報(bào)道顯示[3]，植物修復(fù)機(jī)理技術(shù)是當(dāng)前最具有價(jià)值的解決重金屬污染問題的途徑之一，即利用植物本身生長(zhǎng)的過程來清理或降低環(huán)境中重金屬濃度，具有環(huán)境友好、經(jīng)濟(jì)適用等特點(diǎn)。植物修復(fù)機(jī)理可分為植物吸取中的螯合誘導(dǎo)修復(fù)、植物揮發(fā)中的植物轉(zhuǎn)化修復(fù)以及根際降解中的植物刺激或根際強(qiáng)化生物降解修復(fù)[4-5]。已有研究表明螯合劑的添加可增加某些重金屬的可溶性，從而為植物的吸收創(chuàng)造了有利的條件，所以螯合劑誘導(dǎo)修復(fù)技術(shù)作為一種高效吸取重金屬的修復(fù)技術(shù)備受關(guān)注和青睞[6]。

紫云英(AstragalussinicusL.)，又名紅花草，是我國(guó)冬季主要的綠肥植物，有改善土壤理化性狀、提升土壤肥力等特點(diǎn)[7]。王文軍等[8]研究表明，紫云英對(duì)鎘有較強(qiáng)的耐性，低濃度的鎘對(duì)紫云英的生長(zhǎng)發(fā)育沒有顯著影響，甚至具有一定的生長(zhǎng)促進(jìn)作用。目前有關(guān)EDTA對(duì)植物鎘污染方面的研究較多[9-11]，但對(duì)紫云英幼苗生理生化特性影響的研究還未見報(bào)道。本研究初步探討了EDTA對(duì)鎘脅迫下紫云英幼苗某些生理生化特性的影響，為重金屬污染植物復(fù)合修復(fù)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本實(shí)驗(yàn)在貴州大學(xué)生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。供試的紫云英購(gòu)于杭州鑫源花卉有限公司，脅迫試劑所用氯化鎘(CdCl22·5H2O)為分析純，螯合劑為EDTA(乙二胺四乙酸)。

1.2 方法

1.2.1 植物材料的培養(yǎng)

選擇大小均勻且飽滿的紫云英種子，70%酒精消毒3～5 min，蒸餾水反復(fù)沖洗并浸泡24 h。拿出浸泡過的種子用濾紙將水吸干，選取直徑為9 cm的培養(yǎng)皿，培養(yǎng)皿內(nèi)墊三層濾紙作為發(fā)芽床，每個(gè)培養(yǎng)皿放入100粒種子，并添加10 mL相應(yīng)處理液。處理液含鎘液和EDTA液，其中鎘濃度均為100 mg/L(按氯化鎘中Cd2+計(jì)算)，EDTA分為5個(gè)濃度(0.025、0.05、0.1、0.5、1.0、3.0 mmol/L)，實(shí)驗(yàn)設(shè)置兩個(gè)對(duì)照CK0和CK1，CK0用蒸餾水培養(yǎng)，CK1用單一的鎘液培養(yǎng)(不含EDTA)，材料置于溫度為25±1℃的光照培養(yǎng)箱中催芽，催芽期間每天更換一次相應(yīng)的處理液，每個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)。

1.2.2 幼苗長(zhǎng)勢(shì)及生理指標(biāo)的測(cè)定

紫云英發(fā)芽后第7 d測(cè)定根長(zhǎng)和苗長(zhǎng)并統(tǒng)計(jì)種子發(fā)芽率[12]，發(fā)芽率(%)=(供試種子的發(fā)芽數(shù)/供試種子數(shù))×100%，根長(zhǎng)和苗長(zhǎng)用數(shù)顯游標(biāo)卡尺測(cè)量，每個(gè)處理分別測(cè)量30株。第8 d測(cè)定幼苗的生理指標(biāo)，葉綠素用95%的酒精抽提[13]，并用分光光度法測(cè)定；丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法測(cè)定[14]；過氧化物酶(POD)活性采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定[15]；超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮藍(lán)四唑(NBT)光化還原法測(cè)定[16]。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2007軟件進(jìn)行處理，并采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 EDTA對(duì)鎘脅迫下紫云英種子發(fā)芽率的影響

由圖1可以看出，單一的鎘脅迫處理(CK1)明顯提高了紫云英種子的萌發(fā)，其發(fā)芽率較對(duì)照CK0增加了58.4%(p<0.05)，表明當(dāng)用濃度為100 mg/L的鎘培養(yǎng)液處理紫云英種子時(shí)，對(duì)其種子的萌發(fā)有促進(jìn)作用。當(dāng)在鎘溶液中添加不同濃度的EDTA，其發(fā)芽率隨著EDTA的濃度的增加呈現(xiàn)先增高后降低趨勢(shì)，當(dāng)EDTA=0.05 mmol/L時(shí)，發(fā)芽率達(dá)到最大值，分別較對(duì)照組CK0、CK1提高了29.86%和-17.98%；當(dāng)EDTA=3 mmol/L時(shí)，發(fā)芽率降到最低值，分別較對(duì)照組CK0、CK1降低了13.75%和45.54%，說明單一的鎘脅迫(100 mg/L)和添加0.05 mmol/L的EDTA均能促進(jìn)紫云英種子的萌發(fā)，低濃度(0.025 mmol/L)和高濃度(3 mmol/L)的EDTA的鎘復(fù)合液在不同程度上均抑制紫云英種子的萌發(fā)。

圖1 EDTA對(duì)鎘脅迫下紫云英種子發(fā)芽率的影響Fig.1 Effects of EDTA on seed germination rate of Astragalus sinicusunder Cd Stress注：小寫字母表示0.05水平差異顯著，下同。

2.2 EDTA對(duì)鎘脅迫下紫云英幼苗長(zhǎng)勢(shì)的影響

重金屬脅迫下植物的長(zhǎng)勢(shì)是衡量其對(duì)重金屬耐受性的重要指標(biāo)之一。同時(shí)植物對(duì)重金屬的吸收在很大程度上取決于它在培養(yǎng)液中存在的形態(tài)，其中容易被植物吸收的形態(tài)也容易對(duì)植物的生長(zhǎng)產(chǎn)生影響[17]。由圖2可知，無鎘脅迫、同時(shí)不添加EDTA的對(duì)照(CK0)，根長(zhǎng)均高于其他對(duì)照組，表明鎘和EDTA均可影響根的生長(zhǎng)。單一的鎘脅迫(CK1)處理，其根長(zhǎng)、苗長(zhǎng)分別較對(duì)照CK0降低了65.57%和8.56%，表明濃度為100 mg/L的鎘脅迫對(duì)紫云英幼苗生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用，且對(duì)根的抑制作用大于苗。當(dāng)鎘脅迫處理液中添加不同濃度的EDTA時(shí)，紫云英幼苗的長(zhǎng)勢(shì)隨EDTA濃度的增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。當(dāng)復(fù)合液中EDTA=0.5 mmol/L時(shí)，其根長(zhǎng)達(dá)到最大值(8.63 mm)，較對(duì)照CK1增加了98.4%(p<0.05)，當(dāng)EDTA=0.05 mmol/L時(shí)，紫云英幼苗的苗長(zhǎng)達(dá)到最大值(10.75 mm)，分別較對(duì)照CK0、CK1增加了24.4%和36.1%，表明當(dāng)在100 mg/L的鎘溶液中添加0.05 mmol/L的EDTA時(shí)，能緩解鎘脅迫對(duì)紫云英幼苗地下部分的抑制作用，當(dāng)在100 mg/L的鎘溶液中混合0.5 mmol/L的EDTA時(shí)，能緩解鎘脅迫對(duì)紫云英幼苗地上部分的抑制作用。

圖2 EDTA對(duì)鎘脅迫下紫云英幼苗長(zhǎng)勢(shì)的影響Fig.2 effects of EDTA on the growth of Astragalus sinicus seedlings under Cd stress

2.3 EDTA對(duì)鎘脅迫下紫云英幼苗葉綠素含量的影響

葉綠素是植物進(jìn)行光合作用的重要物質(zhì)，植物中葉綠素含量變化在一定程度上顯示了逆境下植物所遭受的危害程度[18]。由圖3可知，單一的鎘脅迫(CK1)導(dǎo)致紫云英幼苗葉綠素含量較對(duì)照CK0降低了20.25%，原因可能是培養(yǎng)液中重金屬鎘離子含量過多，使葉綠體內(nèi)蛋白質(zhì)合成受到破壞，導(dǎo)致葉綠體分解[19]。當(dāng)用含低濃度EDTA(<0.05 mmol/L)的鎘復(fù)合溶液培養(yǎng)后，葉綠素含量開始逐步上升，這說明了EDTA減緩了鎘脅迫對(duì)紫云英幼苗的葉綠體內(nèi)蛋白質(zhì)的破壞程度。當(dāng)EDTA=0.05 mmol/L時(shí)，葉綠素含量達(dá)到峰值(1.4 mg/g·FW)，此后，隨著EDTA的濃度增加，葉綠素含量開始降低，當(dāng)EDTA=3 mmol/L時(shí)，葉綠素含量達(dá)到最低值(0.75 mg/g·FW)，此時(shí)紫云英幼苗葉片出現(xiàn)了不同程度的發(fā)黃和萎蔫等癥狀，說明高濃度EDTA(3 mmol/L)復(fù)合鎘溶液脅迫紫云英幼苗時(shí)，對(duì)葉綠體中蛋白質(zhì)的合成影響較大[19]。

圖3 EDTA對(duì)鎘脅迫下紫云英幼苗葉綠素含量的影響Fig.3 Effects of EDTA on chlorophyll content under Cd stress

2.4 EDTA對(duì)鎘脅迫下紫云英幼苗MDA含量的影響

植物器官在衰老或逆境脅迫時(shí)，會(huì)發(fā)生膜質(zhì)過氧化作用，丙二醛(MDA)是其終產(chǎn)物之一，其含量可以反映膜脂過氧化物和植物遭受逆境傷害的程度[20]。由圖4可知，單一的鎘(CK1)脅迫對(duì)紫云英幼苗MDA的含量較對(duì)照CK0增加了3.32%(p>0.05)，說明用100 mg/L的鎘脅迫對(duì)MDA的傷害程度不大，當(dāng)添加一定濃度EDTA時(shí)，MDA含量開始下降，當(dāng)EDTA=0.5 mmol/L時(shí)，其MDA含量最低(2.14 mol/g·FW)，分別較對(duì)照組CK0、CK1降低了28.9%和31.19%。此后隨EDTA濃度的增加其MDA含量逐漸增大，表明在一定濃度范圍內(nèi)，低濃度和高濃度的EDTA能緩解鎘脅迫對(duì)紫云英幼苗MDA的傷害。

圖4 EDTA對(duì)鎘脅迫下紫云英幼苗MDA含量的影響Fig.4 Effects of EDTA to content of MDA under cadmium stress

2.5 EDTA對(duì)鎘脅迫下紫云英幼苗SOD含量的影響

SOD是自然界唯一的以氧自由基為底物的酶，在活性氧代謝中處于重要地位，可猝滅超氧負(fù)離子O2-的毒性，終止由O2-啟動(dòng)的一系列自由基連鎖反應(yīng)所造成的生物毒性損傷，為生物體內(nèi)最重要的清除活性氧自由基的酶類[21]。由圖5可知，與對(duì)照組(CK0)相比，濃度為100 mg/L的鎘(CK1)脅迫，SOD活性降低。添加EDTA后，除最低濃度EDTA(0.025 mmol/L)下SOD活性明顯升高外，其余濃度下SOD活性均不同程度降低。當(dāng)EDTA=0.1 mmol/L時(shí)，其SOD活性達(dá)到最低，分別較對(duì)照CK0、CK1降低了71.6%和67.4%，此后SOD活性隨EDTA濃度的增加而增大，表明在一定濃度范圍內(nèi)，低濃度和高濃度的EDTA能緩解Cd脅迫對(duì)紫云英幼苗SOD活性的影響，達(dá)到清除鎘脅迫產(chǎn)生的活性氧[22]。

圖5 EDTA對(duì)鎘脅迫下紫云英幼苗SOD含量的影響Fig.5 Effects of EDTA to content of SOD under cadmium stress

2.6 EDTA對(duì)鎘脅迫下紫云英幼苗POD含量的影響

過氧化物酶(POD)是植物體內(nèi)重要的保護(hù)酶，能有效清除逆境條件下細(xì)胞中產(chǎn)生的自由基，在抗逆境脅迫中起著關(guān)鍵作用[23]，由圖6可知，當(dāng)紫云英幼苗被濃度為100 mg/L的鎘脅迫(CK1)時(shí)，其POD活性急劇增強(qiáng)，較對(duì)照組CK0增加了1.5倍(p<0.05)。與對(duì)照組(CK0)相比，在鎘溶液中添加低濃度(0.025 mmol/L)的EDTA時(shí)，POD的活性降低，隨著EDTA濃度的增加，POD活性與EDTA濃度呈正相關(guān)，當(dāng)EDTA=0.5 mmol/L時(shí)，POD活性達(dá)到峰值(13803.4 U/g·FW)，分別較對(duì)照CK0、CK1增加了94.71%和-21.07，當(dāng)添加的EDTA大于0.5 mmol/L時(shí)，POD活性與EDTA濃度呈負(fù)相關(guān)。當(dāng)EDTA=3 mmol/L時(shí)，POD活性降到最低(5630.4 U/g·FW)，分別較對(duì)照CK0、CK1降低了20.58%和67.8%，說明高濃度(3 mmol/L)的EDTA對(duì)鎘脅迫下抑制紫云英幼苗POD活性。

圖6 EDTA對(duì)鎘脅迫下紫云英幼苗POD含量的影響Fig.6 Effects of EDTA to content of POD under cadmium stess

3 結(jié)論

3.1 EDTA對(duì)鎘脅迫下紫云英種子萌發(fā)的影響

有報(bào)道顯示[24]，重金屬對(duì)植物種子萌發(fā)具有“低促高抑”現(xiàn)象，低濃度的重金屬可以提高種子胚生理活性，促進(jìn)萌發(fā)；高濃度重金屬對(duì)胚、芽等產(chǎn)生了傷害作用，抑制種子萌發(fā)。本實(shí)驗(yàn)研究顯示，單一的鎘脅迫極大促進(jìn)了紫云英種子萌發(fā)，推測(cè)100 mg/L的鎘脅迫提高了紫云英種子中胚的生理活性，促進(jìn)了種子胚芽的生長(zhǎng)[25]。這與Kaplan等[26]研究鉈毒脅迫大豆生長(zhǎng)毒害作用相一致。當(dāng)用一定濃度的EDTA混合鎘溶液處理時(shí)，在不同程度上也促進(jìn)了紫云英種子的萌發(fā)。隨著EDTA的濃度增加，其萌發(fā)率呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢(shì)，但較單一的鎘處理(CK1)相比，其發(fā)芽率總體是降低的，說明用單一的鎘脅迫處理對(duì)提高紫云英種子的萌發(fā)率比EDTA與鎘復(fù)合處理要大，這可能與螯合態(tài)的鎘對(duì)紫云英種子呼吸機(jī)制有關(guān)[27]。

3.2 EDTA對(duì)鎘脅迫下紫云英幼苗生長(zhǎng)的影響

有報(bào)道表明[28]，重金屬進(jìn)入植物根部細(xì)胞后，首先與蛋白質(zhì)、多糖或核酸等分子結(jié)合，大部分累積在植物的根部，僅少量向地上部分遷移。本研究表明，低濃度的鎘脅迫對(duì)紫云英幼苗的根和苗長(zhǎng)都有抑制作用，且這種抑制影響是地下部分>地上部分，這與張杰，孫圓圓等的研究一致[29-30]。當(dāng)在鎘溶液中復(fù)合一定濃度的EDTA時(shí)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不僅能緩解鎘脅迫對(duì)紫云英幼苗根的生長(zhǎng)，且對(duì)苗的生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用。由此可見，加入適宜濃度的EDTA能促進(jìn)植物生長(zhǎng)。

3.3 EDTA對(duì)鎘脅迫下紫云英幼苗生理特征的影響

重金屬脅迫導(dǎo)致植物體內(nèi)活性氧的積累，致使植株組織的氧化脅迫和膜損傷。改變酶系活性，對(duì)植株生長(zhǎng)產(chǎn)生影響[31]。然而植株本身可以通過自身組織系統(tǒng)來?xiàng)l件其耐受性。通常通過POD、SOD和CAT組成的抗氧化酶系統(tǒng)清除體內(nèi)活性自由基來提高植株對(duì)逆境的抗性[32]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，葉綠素含量和POD活性隨EDTA濃度的增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，MDA含量和SOD活性隨EDTA濃度的增加呈現(xiàn)先降低后增加的趨勢(shì)，表明隨著EDTA濃度的增加，植株通過自身的調(diào)劑機(jī)制進(jìn)行綜合調(diào)控，由于植物對(duì)重金屬的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)理很復(fù)雜，其吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)重金屬離子能力的大小不僅與植物種類有關(guān)，而且與重金屬離子在溶液中存在的形式等因素有關(guān)，本實(shí)驗(yàn)中一定濃度的EDTA復(fù)合鎘脅迫紫云英幼苗生理的影響機(jī)制更為顯著，其原因有待進(jìn)一步分析。

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Effects of EDTA mixedCadmium Stress on the Seed Germination an Physiological Resistance Characters of Initial Growth inAstragalussinicus

YANGPeng,CHENXing-yin,TIANLing-ling,ZHANGKai-kai,XULing-ling,GUANPing*

(CollegeofLifeSciences,GuizhouUniversity,Guiyang,Guizhou550025,China)

The effects of different concentrations of EDTA(ethylene diamine tetraacetic acid) on theseed germination and seedling physiological resistance ofAstragalussinicusundercadmium (Cd) stress were studied by hydroponic method to provide scientific basis for remediation of heavy metal polluted plants. The results showedthat single cadmium stress(100 mg / L)promoted the seed germination, increased the seedling malondialdehyde (MDA) content and peroxidase (POD) activity, but inhibited the seedling growth, reduced the seedling chlorophyll content and the superoxide dismutase (SOD)activity. When different concentrations of EDTA were added into Cd solution and with the increase of EDTA concentration,the seed germination rate, seedling growth, chloroplast content and POD activity first increased and then decreased. Therefore, certain range of concentrations of EDTAcould relievethe damage of Astragalus sinicus seedlingsinduced by Cd stress, with the treatment of EDTAconcentration at 0.05 mmol/Lbeing the most effective.

Astragalussinicus; seed germination;cadmium; EDTA;chlorophyll

2016-07-24；

2016-10-11

貴州省社會(huì)發(fā)展攻關(guān)課題(201303137)。

Q945.78

A

1008-0457(2016)06-0026-05 國(guó)際

10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2016.06.004

*通訊作者：關(guān)萍(1961-)，女，博士，教授，主要研究方向：植物學(xué)、分子生物學(xué)及植物生物技術(shù)； E-mail:guanp@163.com。