萬山礦區(qū)土壤汞對蚯蚓的生物有效性研究

趙　杰，李程程，楊周生，黨　菲②，周東美

(1.安徽師范大學環(huán)境科學與工程學院，安徽 蕪湖　241003；2.中國科學院土壤環(huán)境與污染修復重點實驗室，江蘇 南京　210008)

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萬山礦區(qū)土壤汞對蚯蚓的生物有效性研究

趙杰1,2，李程程2，楊周生1①，黨菲2②，周東美2

(1.安徽師范大學環(huán)境科學與工程學院，安徽 蕪湖241003；2.中國科學院土壤環(huán)境與污染修復重點實驗室，江蘇 南京210008)

摘要：以威廉環(huán)毛蚓(Pheretima guillemi)為試驗生物，研究貴州萬山礦區(qū)水稻土中汞〔w(總汞)為0.14~76 mg·kg-1，w(甲基汞)為0.65~3.8 μg·kg-1〕的生物有效性。暴露試驗結果表明，礦區(qū)土壤中甲基汞的生物富集因子(BAF)為5.37~17.55，高于無機汞的生物富集因子(0.14~1.14)，說明甲基汞生物有效性比無機汞更高，具有潛在的生物放大效應。對蚯蚓體內(nèi)汞形態(tài)的分析表明，蚯蚓體內(nèi)甲基汞占總汞比例為0.26%~4.23%，高于土壤中甲基汞占總汞比例(< 0.1%)。隨著土壤中汞濃度的增加，蚯蚓體內(nèi)w(無機汞)(0.20~10.20 mg·kg-1)和w(甲基汞)(7.2~47.8 μg·kg-1)增加。土壤無機汞濃度與蚯蚓體內(nèi)無機汞濃度之間呈極顯著線性相關(P<0.01)，但土壤甲基汞濃度與蚯蚓體內(nèi)甲基汞濃度之間則不存在顯著相關關系(P>0.05)。綜合文獻調(diào)研結果，發(fā)現(xiàn)土壤無機汞濃度能較好地預測蚯蚓體內(nèi)無機汞的富集。盡管萬山礦區(qū)汞被認為是“惰性汞”，但研究表明這些汞對蚯蚓仍具有較高的有效性，并可能在陸生生態(tài)系統(tǒng)中對蚯蚓捕食者產(chǎn)生潛在的生態(tài)風險。

關鍵詞：汞礦區(qū)；總汞；甲基汞；蚯蚓；生物有效性

汞是人體非必需的有毒重金屬元素。我國汞污染問題非常嚴重[1-4]。貴州省汞礦區(qū)土壤汞濃度可高達790 mg·kg-1[5],遠超GB 15618—1995《土壤環(huán)境質量標準》規(guī)定的限值(1.5 mg·kg-1)。區(qū)域性土壤汞污染對于生態(tài)環(huán)境和人體健康的威脅已引起廣泛關注。

目前大多數(shù)研究集中于土壤汞對植物的有效性,對土壤動物如蚯蚓的有效性研究較少[6]。蚯蚓生物量占土壤無脊椎動物生物量的80%,在農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)功能方面具有重要作用,常常作為土壤污染的重要指示生物[7]。而且蚯蚓位于陸生食物鏈的低端,汞富集不僅會對蚯蚓產(chǎn)生直接致毒作用,還會通過食物鏈傳遞到捕食者,如鳥類、小型哺乳動物等。例如,荷蘭Blokland地區(qū)土壤汞污染導致蚯蚓體(以干重計)內(nèi)w(汞)達到1.1 mg·kg-1,以蚯蚓為食的黑尾豫(Limosalimosa)蛋(以干重計)中w(汞)顯著增高到0.33 mg·kg-1[8]。此外,由于蚯蚓蛋白含量高達70%,微量元素含量豐富,是禽畜和水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的優(yōu)質蛋白質飼料[9]。因此,研究蚯蚓的汞富集對土壤汞污染監(jiān)測和陸生食物鏈汞傳遞的風險評估都具有重要意義。

近期野外研究已表明汞能在蚯蚓體內(nèi)富集。我國葫蘆島區(qū)域蚯蚓總汞含量可高達5.5 mg·kg-1,具有潛在的生態(tài)與環(huán)境風險[10-11]。由于甲基汞具有較強的生物可利用性和毒性,因此其比無機汞更能引起人們的關注。事實上,甲基汞在蚯蚓體內(nèi)的生物富集因子(bioaccumulation factor,BAF,Fb,a)可達10.2～249[11-13],遠高于無機汞的生物富集因子(通常<10[13])。因此,研究蚯蚓體內(nèi)汞的化學形態(tài)對準確地進行風險評估具有重要意義。

在土壤重金屬的生物有效性研究中,人工標記土壤由于具有易控性而被廣泛使用。鑒于人工標記土壤和實際污染土壤重金屬的生物有效性差別[14],實際污染土壤在重金屬的生物風險評估中更具有現(xiàn)實意義[7]。貴州省萬山汞礦是我國最大的汞礦[15],萬山地區(qū)稻米甲基汞含量嚴重超標[16-17]。該研究擬采用中國常見的蚯蚓種屬威廉環(huán)毛蚓(Pheretimaguillemi)作為試驗材料來分析比較萬山礦區(qū)土壤中無機汞和甲基汞生物有效性的差異,以期為全面評估萬山礦區(qū)汞污染風險提供基礎數(shù)據(jù)。

1材料與方法

1.1供試材料

1.1.1供試動物

供試蚯蚓為威廉環(huán)毛蚓,購自江蘇省句容市蚯蚓飼養(yǎng)基地。將蚯蚓置于空白對照土壤,在人工氣候箱中馴養(yǎng)30 d。箱中溫度為(20±1) ℃(貴陽花溪水稻土),相對濕度為60%,t(光)∶t(暗)=8 h∶16 h,[光]照度為400 lx。每周按照每g 蚯蚓(濕重)配給0.75 g干牛糞的比例喂食蚯蚓[18]。每次喂食前移走未進食的干牛糞,并用去離子水調(diào)節(jié)土壤濕度為最大飽和含水率的60%。

1.1.2供試土壤

供試土壤取自貴州萬山礦區(qū)附近水稻田(汞污染土壤)和貴陽花溪水稻田(空白對照土壤)。取樣深度為0～20 cm。所有土樣取回后自然風干,研磨過2 mm孔徑篩后常溫保存。

暴露試驗設置6個處理,每個處理設置3個重復。用自動攪拌機混合污染土壤和空白對照土壤形成混合均勻的試驗土壤,總汞濃度梯度為0.1、1、3、27、50和76 mg·kg-1，分別以CK、T1、T3、T27、T50和T76表示?？偣瘽舛葹?.1 mg·kg-1的試驗土壤采自貴陽花溪水稻土，作為空白對照土壤；總汞濃度為76 mg·kg-1的試驗土壤采自貴州萬山礦區(qū)附近水稻土，作為最高濃度汞污染土壤。多次測定土壤中汞濃度以確保混合的均一性。根據(jù)《土壤農(nóng)業(yè)化學分析方法》[19],測定土壤pH值〔0.01 mol·L-1CaCl2,V(水)∶m(土)=10∶1〕、有機質含量(OM,重鉻酸鉀容量法)、陽離子交換量(CEC,醋酸銨法)、土壤最大飽和含水率(WHC,飽和重力排水法)、礦物組成(X射線衍射)和顆粒組成(激光粒度分析)等基本的土壤理化性質。

將含不同濃度梯度汞土壤250 g分別置于PP材質燒杯中,用去離子水調(diào)節(jié)土壤濕度為最大飽和含水率的60%,放在人工氣候箱中預培養(yǎng)平衡4 d。

1.2暴露試驗

暴露試驗開始前,挑選體質量相近的〔(1.8±0.23) g〕具有環(huán)帶的健康成年蚯蚓隨機放在濕潤的濾紙上24 h,使其排除腸道內(nèi)容物[20]。濾紙每12 h更換1次。參照OECD No. 317[21]方法進行蚯蚓暴露試驗。簡而言之,經(jīng)過清腸處理的蚯蚓隨意放置于任意一個盛有試驗土壤的燒杯內(nèi),每個燒杯放入5條蚯蚓,任意選擇其中3條測定汞濃度,暴露條件與馴養(yǎng)條件(同1.1.1節(jié)所述)保持一致。每天觀察并記錄蚯蚓活性,同時每2 d用去離子水調(diào)節(jié)土壤濕度為最大飽和含水率的60%。21 d時結束試驗,先后用w=0.8%的NaCl[22]、10 mmol·L-1的半胱氨酸溶液[23]和去離子水清洗蚯蚓,以移除蚯蚓體表的微生物,去除附著的土壤顆粒及吸附的汞。蚯蚓在濕潤濾紙上清腸24 h后稱重。暴露前后的土壤和蚯蚓樣品在-70 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3土壤和蚯蚓樣品中總汞和甲基汞的測定

蚯蚓和土壤樣品冷凍干燥(ALPHA 1-2 LD plus,德國)48 h后磨碎過<0.15 mm孔徑篩備用。根據(jù)EPA 7473方法[24]用直接測汞儀(DMA-80,Milestone,意大利)測定樣品總汞濃度,儀器檢測限為0.01 ng。根據(jù)EPA 1630方法[25]和閻海魚等[26]的方法采用氣相色譜-冷原子熒光法(GC-CVAFS,MERX,Brooks Rand Labs,美國)測定樣品甲基汞濃度,檢測限為0.01 pg。簡而言之,0.01～0.05 g樣品用2 mLw=25%的氫氧化鉀-甲醇溶液在65 ℃條件下消解4 h。先調(diào)節(jié)消解液pH值,再經(jīng)四乙基硼化鈉(NaBEt4)乙基化后測定。

1.4試驗數(shù)據(jù)的質量控制

分析所用試劑均為優(yōu)級純(GR),試驗用水為去離子水(Milipore,18.2 MΩ)。用空白試驗、標準工作曲線、土壤標準物質(GBW07423,GSS-9,國家標準測量研究所)和生物標準物質(龍蝦,TORT-2,加拿大國家研究委員會;海魚,DORM-3,加拿大國家研究委員會)對試驗數(shù)據(jù)進行質量控制。土壤標準物質和生物標準物質的總汞回收率分別為90%～110%和85%～96%,甲基汞回收率分別為77%～123%和85%～88%。

1.5統(tǒng)計分析

Fb,a用于評價汞在蚯蚓體內(nèi)的富集能力[27]:Fb,a=Ce/Cs。其中,Ce為蚯蚓體內(nèi)甲基汞或無機汞濃度,μg·kg-1或mg·kg-1;Cs為土壤中甲基汞或無機汞濃度,μg·kg-1或mg·kg-1。

采用SPSS 16.0軟件進行相關分析。

2結果與討論

2.1土壤中總汞和甲基汞的濃度

所采集的貴州萬山礦區(qū)土壤(處理T76)總汞濃度為76 mg·kg-1(表1),約為GB 15618—1995三級標準限值的51倍,此與前人報道結果[5,28]一致；土壤中w(甲基汞)為2.7 μg·kg-1,占總汞濃度比例<0.1%(表1),此與文獻報道結果[5,29-30]一致,說明在萬山礦區(qū)土壤中,汞主要以無機汞形式存在。萬山礦區(qū)土壤中80%的無機汞以硫化汞形態(tài)存在[15]。貴陽花溪未污染水稻土(CK)w(總汞)為0.14 mg·kg-1,w(甲基汞)為0.65 μg·kg-1。

表1供試不同汞濃度土壤的基本理化性質

Table 1Physicochemical properties of the test soils different in mercury concentration

處理pH值1)w(OM)/%CEC/(cmol·kg-1)WHC1)/%w(總汞)1)/(mg·kg-1)w(甲基汞)1)/(μg·kg-1)甲基汞占總汞比例/%CK7.8±0.028.626.259±1.00.14±0.000.65±0.130.46T17.7±0.088.426.359±1.01.2±0.271.0±0.230.083T37.6±0.158.525.859±1.03.0±1.01.1±0.040.037T277.8±0.096.920.459±1.023±4.63.1±0.050.013T507.9±0.125.415.859±1.069±123.8±0.010.0055T768.0±0.034.013.259±1.076±0.082.7±0.210.0036處理w/%蒙脫石蛭石水云母高嶺石綠泥石黏土CK91510103056T141914123056T36131582853T2751719142155T500925141851T76082291250

處理CK、T1、T3、T27、T50和T76分別指試驗土壤總汞濃度梯度為0.1、1、3、27、50和76 mg·kg-1。OM為有機質;CEC為陽離子交換量;WHC為土壤最大飽和含水率。1)平均值±標準偏差(n=3)。

將萬山土和花溪土混合均勻形成不同梯度的汞濃度〔表1,w(總汞)為0.14～76 mg·kg-1,w(甲基汞)為0.65～3.8 μg·kg-1〕,均為環(huán)境暴露濃度[13,28-29]。盡管甲基汞濃度隨土壤總汞濃度的增加而增加,但土壤中甲基汞的比例仍均小于0.1%(除CK以外，表1)。

2.2無機汞和甲基汞的生物富集

2.2.1蚯蚓體內(nèi)汞濃度及形態(tài)

蚯蚓體內(nèi)無機汞和甲基汞濃度見表2。在整個試驗過程中,汞污染土壤培養(yǎng)的蚯蚓總汞和甲基汞濃度均高于CK,尤其是處理T76(萬山礦區(qū)稻田土)蚯蚓w(無機汞)和w(甲基汞)分別達(10.20±2.20) mg·kg-1和(47.8±12.5) μg·kg-1,其中,蚯蚓w(總汞)高于我國葫蘆島地區(qū)蚯蚓w(總汞)(5.5 mg·kg-1)[10-11]。這說明盡管萬山礦區(qū)汞主要以硫化汞等“惰性汞”形式存在[15],但仍然對土壤無脊椎動物(蚯蚓)具有生物有效性。

表221 d暴露后蚯蚓體內(nèi)無機汞和甲基汞濃度

Table 2Inorganic mercury and methylmercury concentrations in earthworms after 21-days of exposure

處理組w(無機汞)/(mg·kg-1)w(甲基汞)/(μg·kg-1)CK0.20±0.037.2±1.2T10.22±0.049.6±0.9T30.87±0.5414.7±8.9T275.00±2.8016.8±1.6T505.70±2.5031.7±7.6T7610.20±2.2047.8±12.5

處理CK、T1、T3、T27、T50和T76分別指試驗土壤總汞濃度梯度為0.1、1、3、27、50和76 mg·kg-1。

蚯蚓體內(nèi)甲基汞占總汞比例為0.26%～4.23%(表3),略低于一些文獻報道值：瑞士森林蚯蚓體內(nèi)甲基汞占總汞比例為5.7%～10%[12],我國葫蘆島地區(qū)杜拉蚓和異唇蚓體內(nèi)甲基汞占總汞比例分別為3%和12%[11]?？梢?蚯蚓體內(nèi)汞主要以無機汞形式存在。但考慮到土壤中甲基汞占總汞比例小于0.1%(表1),而蚯蚓體內(nèi)甲基汞占總汞比例達0.26%～4.23%(表3),說明在土壤-蚯蚓體系中可能存在甲基汞的生物放大現(xiàn)象。關于甲基汞生物放大現(xiàn)象早有研究[11-13],說明土壤-蚯蚓體系內(nèi)存在甲基汞生物放大現(xiàn)象不是某一地區(qū)土壤或者某一種屬蚯蚓的特例,這是一種普遍現(xiàn)象,這也是蚯蚓可以作為土壤汞污染指示生物的最直接證據(jù)。

表3蚯蚓和土壤中甲基汞占總汞的比例

Table 3Proportions of MeHg to total Hg in earthworms and soils

處理組甲基汞占總汞比例/%蚯蚓土壤CK3.64±0.580.38±0.06T14.23±0.800.09±0.04T32.04±0.050.04±0.01T270.26±0.020.01±0.00T500.44±0.140.01±0.00T760.46±0.240.00±0.00

處理CK、T1、T3、T27、T50和T76分別指試驗土壤總汞濃度梯度為0.1、1、3、27、50和76 mg·kg-1。

為進一步了解無機汞和甲基汞的生物有效性,計算其Fb,a。蚯蚓對無機汞的Fb,a為0.14～1.14(表4),此與文獻[11-12]報道結果基本一致。而蚯蚓對甲基汞的Fb,a可達5.37～17.55,略低于文獻報道值,如10.2～31.4[11]、15.1～191.5[12]和175～249[13],進一步說明存在甲基汞在土壤-蚯蚓體系中的生物放大現(xiàn)象。

表4蚯蚓對無機汞和甲基汞的生物富集因子

Table 4Bioaccumulation factors (BAF) of inorganic mercury and methylmercury in earthworms

處理組生物富集因子無機汞甲基汞CK1.14±0.0811.26±1.78T10.19±0.0710.00±2.84T30.32±0.2412.80±7.32T270.19±0.135.37±0.45T500.14±0.088.40±2.01T760.16±0.1517.55±3.63

處理CK、T1、T3、T27、T50和T76分別指試驗土壤總汞濃度梯度為0.1、1、3、27、50和76 mg·kg-1。

2.2.2土壤中汞濃度對汞富集的影響

蚯蚓體內(nèi)無機汞濃度與土壤無機汞濃度呈極顯著正相關(圖1a,P<0.01),且土壤無機汞濃度可解釋蚯蚓無機汞濃度變化的94%。但蚯蚓體內(nèi)甲基汞濃度與土壤甲基汞濃度之間卻不存在顯著相關關系(圖1b，P>0.05)。無機汞及甲基汞的Fb,a均不受土壤總汞濃度的影響(表4,P>0.05)。然而蚯蚓體內(nèi)甲基汞占總汞比例隨著土壤中甲基汞濃度的增加而呈下降趨勢(表1和表3,P<0.05)。美國馬里蘭州污染土壤中的汞在蚯蚓體內(nèi)富集也存在類似現(xiàn)象[13]。

為進一步研究土壤中無機汞濃度或甲基汞濃度對蚯蚓汞富集的影響,對有關蚯蚓富集總汞和甲基汞數(shù)據(jù)的文獻進行分析總結(圖1)。若將瑞士34個地區(qū)[12]土壤中蚯蚓體內(nèi)無機汞濃度和甲基汞濃度分別與土壤無機汞和甲基汞濃度作相關分析,發(fā)現(xiàn)蚯蚓體內(nèi)無機汞濃度與土壤無機汞濃度不呈顯著相關關系(圖1c,P>0.05),同樣地，蚯蚓甲基汞濃度與土壤甲基汞濃度也不呈顯著相關關系(圖1 d)。造成上述結果的原因可能是瑞士地區(qū)所采集的蚯蚓種屬是多樣的,不同種屬蚯蚓之間對汞的富集存在差異,且土壤甲基汞濃度都很低(絕大部分地區(qū)≤1 μg·kg-1)。如將筆者研究結果與美國馬里蘭州的汞污染土壤[13]以及遼寧省葫蘆島地區(qū)[11]研究結果進行整合分析(圖1e～f),發(fā)現(xiàn)蚯蚓體內(nèi)無機汞濃度與土壤無機汞濃度呈現(xiàn)極顯著線性相關(圖1e,R2=0.47,P<0.01),土壤無機汞濃度可以解釋蚯蚓體內(nèi)無機汞濃度變化的47%,而蚯蚓體內(nèi)甲基汞濃度與土壤甲基汞濃度則未呈現(xiàn)顯著線性關系(圖1f,P>0.05)。筆者研究結果(圖1a～b)與之一致,說明土壤中無機汞濃度可以預測蚯蚓體內(nèi)無機汞濃度的變化,而土壤甲基汞濃度不能很好地預測蚯蚓體內(nèi)甲基汞濃度的變化。

分圖a和b中數(shù)據(jù)來自筆者研究;分圖c和d中數(shù)據(jù)來自文獻[12];分圖e和f中空心方塊表示的數(shù)據(jù)來自文獻[11-13],實心方塊表示的數(shù)據(jù)來自筆者研究。

圖1蚯蚓體內(nèi)無機汞和甲基汞濃度與土壤中無機汞和甲基汞濃度的關系

Fig.1Relationships of earthworm and soil in inorganic mercury and methylmercury concentration

值得注意的是,除了土壤中無機汞和甲基汞濃度存在差異以外,土壤性質和蚯蚓生理因素也可能同時影響土壤中無機汞和甲基汞的富集。例如土壤有機質能增強汞對蚯蚓的生物有效性[31],而HNO3可提取態(tài)汞則能很好地預測蚯蚓體內(nèi)汞濃度[32]。此外,蚯蚓的不同攝食方式也會產(chǎn)生汞富集能力的差異,例如,攝食土壤過程中總汞的富集效率高于攝食植物葉和根的過程[33]。這些生物生理因素和土壤性質對蚯蚓富集汞尤其是甲基汞的影響,將是下一步工作的重點。

3結論

(1)萬山礦區(qū)汞污染土壤的無機汞和甲基汞均能被蚯蚓富集,說明“惰性汞”仍然具有生物有效性。

(2)生物富集因子計算結果表明蚯蚓對甲基汞的富集能力遠高于無機汞。因此,蚯蚓體內(nèi)甲基汞占總汞比例為0.26%～4.23%,高于土壤中甲基汞占總汞比例(<0.1%)?？梢?土壤甲基汞可能沿著陸生食物鏈進行生物放大。

(3)威廉環(huán)毛蚓對土壤無機汞的富集與土壤中無機汞濃度之間呈現(xiàn)極顯著線性相關關系(P<0.01),但對土壤甲基汞的富集與土壤中甲基汞濃度之間卻不存在顯著線性關系,說明土壤甲基汞濃度不是甲基汞富集的限制性因素。

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(責任編輯： 李祥敏)

Bioavailability of Mercury to Earthworm (Pheretimaguillemi) in Soil of the Wanshan Mining District.

ZHAOJie1,2,LICheng-cheng2,YANGZhou-sheng1,DANGFei2,ZHOUDong-mei2

(1.College of Environmental Science and Engineering, Anhui Normal University, Wuhu 241003, China;2.Key Laboratory of Soil Environment and Pollution Remediation, Institute of Soil Science, Chinese Academy of Sciences, Nanjing 210008, China)

Abstract:Earthworms (Pheretima guillemi) were used as subject in an exposure experiment in mercury contaminated paddy soil, with inorganic mercury (IHg) ranging from 0.14-76 mg·kg-1and methylmercury (MeHg), from 0.65-3.8 μg·kg-1, in a mining area of Wanshan, Guizhou Province. Substantial IHg and MeHg bioaccumulation, i.e., 0.20-10.20 mg·kg-1and 7.2-47.8 μg·kg-1,were observed in earthworms after twenty-one days of exposure. Obviously, the bioaccumulation factor (BAFs) for MeHg (5.37-17.55) was 9.9-75 fold higher than that for IHg (0.14-1.14), which indicates that MeHg is much higher in bioavailability than IHg and possess potential biomagnification effect. Analysis of forms of Hg in earthworms reveals that MeHg contributed 0.26%-4.23% of the total mercury in the earthworm, while it did only <0.1% in the soil. With rising Hg concentration in the soil, MeHg and IHg both increased in the earthworms. MeHg and IHg BAFs were little influenced by soil mercury concentrations, although the proportion of MeHg in earthworm tended to decrease with increasing MeHg concentration in the soil. Furthermore, IHg content in the earthworms displayed an apparent linear relationship with soil mercury concentration, explaining 94% of the variation of IHg in the earthworms. Yet no significant relationship was observed for MeHg. After a comprehensive review of relevant literature and data, it was found that soil inorganic mercury concentration may serve as an indicator for bio-accumulation of IHg in earthworms. Nevertheless, although mercury in the mining-area is thought to be “inert Hg”, this study demonstrated that it′s still quite highly bioavailable to earthworms, and may pose a potential ecological risk to predators of earthworms in the terrestrial environment.

Key words:Hg-mining area;total mercury;methylmercury;earthworm;bioavailability

作者簡介：趙杰(1991—),男,安徽合肥人,碩士生,主要研究方向為汞在食物鏈傳遞過程中的生物有效性。E-mail: zjfootball@foxmail.com

通信作者①E-mail: yzhoushe@mail.ahnu.edu.cn ②E-mail: fdang@issas.ac.cn

基金項目：國家自然科學基金(43101559);江蘇省自然科學基金(BK20141041);污染控制與資源化研究國家重點實驗室開放課題(PCRRF13002)

收稿日期：2015-02-03

DOI：10.11934/j.issn.1673-4831.2016.01.020

中圖分類號：X131.3;X503.22;X8

文獻標志碼：A

文章編號：1673-4831(2016)01-0120-06