枸杞子多糖不同組分的雙向免疫調(diào)節(jié)機制研究進展

田 陽，龔桂萍，路 宇，黃雯琪，李 成，王仲孚，黃琳娟

（西北大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西省天然多糖資源利用研究中心，陜西 西安 710062）

枸杞（Lycium bararum）是茄科、枸杞屬植物，主要種植于中國、韓國、日本、歐洲、北美和地中海的干旱和半干旱地區(qū)[1]。目前，枸杞的主要產(chǎn)地是中國，其年均產(chǎn)量已達10萬 t[2]。枸杞的品種包括寧夏枸杞（Lycium bararumL.）、枸杞（Lycium chinenseMill.）、黑果枸杞（Lycium ruthenicumMurr.）、截萼枸杞（Lycium truncatumY. C. Wang）、新疆枸杞（Lycium dasystemumPojark）、柱筒枸杞（Lycium cylindricum）和云南枸杞（Lycium yunnanenseKuang）7種[3]，其中寧夏枸杞是唯一被2015年版《中華人民共和國藥典》收錄的品種[4]。

枸杞子是枸杞的果實，具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗衰老、抗糖尿病、抗腫瘤、細胞保護和神經(jīng)保護等功能活性[1,5]，在2002年被國家衛(wèi)生健康委員會確認為藥食同源食物[6]。枸杞子中成分復(fù)雜，包括多糖、類胡蘿卜素、莨菪亭（7-羥基-6-甲氧基香豆素）、黃酮、甜菜堿、多酚、腦苷脂、β-谷甾醇、蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸及微量元素等200多種物質(zhì)[1-2]。其中，枸杞子多糖（Lycium bararumpolysaccharides，LBP）是一組分子質(zhì)量為10～2 300 kDa的水溶性糖綴合物，占枸杞子干質(zhì)量的5%～8%，是枸杞子中主要的功能活性物質(zhì)[1]。截至目前，LBP已被證實在免疫調(diào)節(jié)、抗氧化和抗衰老等方面均能發(fā)揮顯著的功能活性[7-8]。

免疫系統(tǒng)與人體各項生命活動息息相關(guān)?，F(xiàn)有研究表明，LBP對外周免疫器官（脾臟、腸系膜淋巴結(jié)和扁桃體等）、中樞免疫器官（骨髓和胸腺）的生長均有促進作用，因而能夠提高機體免疫力[9]。另一方面，當(dāng)機體自身免疫水平過高時，LBP還能調(diào)節(jié)T淋巴細胞、B淋巴細胞、自然殺傷（natural killer，NK）細胞、抗原呈遞細胞的生長分化和細胞因子分泌[10]，下調(diào)機體免疫應(yīng)答水平，拮抗過度免疫應(yīng)答[11]。因此，LBP可通過多靶點、多途徑發(fā)揮雙向免疫調(diào)節(jié)作用，幫助機體恢復(fù)免疫穩(wěn)態(tài)。但現(xiàn)有研究多從LBP對某一免疫器官或某一免疫細胞的作用效果出發(fā)，探討其促進機體免疫功能的分子機制，缺乏對其雙向免疫調(diào)節(jié)機制的全面闡釋。本文將綜合考慮LBP對免疫系統(tǒng)的促進和抑制作用，對LBP在腸黏膜屏障、腸道菌群、免疫細胞、神經(jīng)內(nèi)分泌免疫系統(tǒng)的作用機制進行綜述（圖1）。

圖1 LBP對機體免疫系統(tǒng)的影響Fig. 1 Effect of Lycium barbarum polysaccharides on the immune system

近年來，病毒、癌癥和過敏等均已成為人類生存的重大威脅。多數(shù)病毒和癌細胞能夠嚴(yán)重破壞機體的免疫抵抗功能。因此，具有加速誘導(dǎo)免疫應(yīng)答功能的免疫增強劑已被廣泛地應(yīng)用于抗病毒治療、抗腫瘤治療、多種疫苗開發(fā)和動物飼料新配方中[12-13]。過敏一般指機體對自身或無害的食物/藥品/環(huán)境中的某些成分所產(chǎn)生的過度免疫反應(yīng)[14-15]，可引發(fā)各類癥狀：如皮膚方面的瘙癢、紅腫、蕁麻疹；呼吸道方面的哮喘、咳嗽；胃腸道方面的惡心、嘔吐、腹瀉等，嚴(yán)重時可引發(fā)過敏性休克甚至死亡[15]。免疫抑制劑可降低免疫應(yīng)答水平，阻礙免疫反應(yīng)的發(fā)生，因此對于過敏性疾病的預(yù)防和治療具有重要作用。本文對LBP發(fā)揮雙向免疫調(diào)節(jié)功能的作用途徑和分子機制進行綜述，以期為其進一步在抗病毒治療、抗腫瘤治療、多種疫苗開發(fā)、動物飼料免疫增強配方和抗過敏藥物/食品中的應(yīng)用提供參考。

1 枸杞子多糖對腸黏膜屏障的保護作用

人類小腸黏膜面積約300 m2，含有大量淋巴組織，并覆蓋有人體80%以上免疫球蛋白分泌細胞[16]。這些組織與細胞共同構(gòu)成了腸道黏膜屏障，保護機體免受細菌、病毒等致病性微生物的侵襲。石玉祥等[17]使用C57BL/J小鼠模型研究了LBP攝入對小腸上皮淋巴細胞（intestinal epithelial lymphocytes，IEL）和小腸絨毛上杯狀細胞（goblet cell，GC）的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LBP作用后，上述兩種細胞的數(shù)量增加且具有向腸內(nèi)層移動的趨勢，同時，腸黏膜白細胞介素（interleukin，IL）-2的含量也顯著增加。IEL是腸道相關(guān)淋巴組織的重要組成部分，其數(shù)量與腸道吞噬抗原能力和殺滅病原微生物效果密切相關(guān)[18-19]。IEL的數(shù)量增加，證明小腸局部黏膜免疫屏障的完整性有所提升，小腸的免疫防御功能更加完善。GC作為一種分泌細胞，可大量分泌黏蛋白（mucin，MUC）2[20-21]，從而形成黏液層，保護腸上皮表面免受細菌、病毒及水解酶的侵害[22]。石玉祥等[17]的研究證明，LBP可通過增加GC數(shù)量、改變GC在不同腸段的數(shù)量分布，保護小腸上皮黏液層結(jié)構(gòu)，進而增強機體的特異性免疫。但該研究中所使用的LBP純度僅有50%左右，結(jié)構(gòu)特征尚未得到表征。Kang Yifei等[23]的研究也證實，日常攝入枸杞可增加腸道內(nèi)MUC1的分泌，對結(jié)腸炎具有一定治療和緩解作用。Zhao Qihan等[24]研究發(fā)現(xiàn)，灌胃枸杞和黃芪的粗多糖混合物后，兔血液中的D-乳酸和細菌內(nèi)毒素含量顯著降低。D-乳酸是腸道菌群的主要代謝產(chǎn)物。細菌內(nèi)毒素主要存在于腸桿菌的細胞壁中[25]。當(dāng)腸黏膜屏障破壞時，腸道通透性隨之改變，D-乳酸和細菌內(nèi)毒素會被大量釋放到血液中[26]。

理論上，LBP可作為一種非消化性多糖被腸道微生物代謝，從而避免了微生物因營養(yǎng)物質(zhì)匱乏而去分解腸道內(nèi)的黏蛋白（圖2）。非消化性多糖如卡拉膠、硫酸軟骨素、海藻酸鈉、菊粉等均能通過該途徑維持黏液層厚度，避免有害微生物跨越腸黏膜屏障[27-28]。值得注意的是，不同腸道微生物對不同多糖的分解效率并不一致，而這與多糖的結(jié)構(gòu)特征具有密不可分的關(guān)系。具體來說，革蘭氏陽性雙歧桿菌更傾向于利用聚合度較低的多糖；變形菌門只能降解單糖和雙糖，半乳糖胺含量太高則會降低炎癥性變形菌的豐度；擬桿菌屬最善于利用糖胺聚糖[29]。Ding Yu等[30]的研究證實，攝入LBP后的小鼠腸隱窩更深，絨毛更長，結(jié)腸GC數(shù)量更多且排列更加整齊。此外，有些多糖還能通過提升腸道內(nèi)MUC2、緊密連接蛋白（閉鎖小帶蛋白1（zonula occludens 1，ZO-1）、Claudin-1、Claudin-4等）的表達水平，從而提高腸黏膜免疫屏障的完整性[31]。除保護腸道屏障外，腸道黏蛋白還能促進抗原呈遞細胞的表型和功能成熟[32]，從而提高機體對外源危害性微生物的免疫應(yīng)答水平。

圖2 非消化性多糖對胃腸黏膜的保護作用Fig. 2 Protective effect of non-digestible polysaccharides on gastrointestinal mucosa

本課題組前期用柱層析法分離得到均一性的LBP組分，其結(jié)構(gòu)為以β-(1→6)-半乳糖為主鏈，C3位被少量半乳糖和大量阿拉伯糖取代的多分支阿拉伯半乳聚糖結(jié)構(gòu)[33]。為了提升LBP提取的效率和得率，本課題組進一步優(yōu)化了其分離純化工藝，通過分步沉淀法可以快速大量制備均一性的枸杞子阿拉伯半乳聚糖組分LBGP-I-3（mw91.2 kDa）[33]，為充分解析LBP結(jié)構(gòu)與其功能之間的構(gòu)效關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。后期實驗結(jié)果表明，LBGP-I-3是LBP主要的功能性成分，能發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)、抗衰老、抑制癌細胞生長等多種生物功能[34-37]。攝入LBGP-I-3后，結(jié)腸炎小鼠的腸黏膜屏障損傷明顯得到修復(fù)，腸道黏蛋白MUC2和ZO-1的表達水平顯著升高，說明LBGP-I-3能保障腸道黏膜屏障的完整性，維持機體正常的免疫功能[36]。然而，目前有關(guān)LBP對不同腸道上皮細胞（如GC和微褶皺細胞）的具體影響及LBP調(diào)控腸道黏蛋白分泌的分子機制尚未闡明，后期研究可針對以上問題繼續(xù)深入探究，為進一步理解LBP保護腸黏膜屏障的具體機理奠定基礎(chǔ)。

2 枸杞子多糖對腸道菌群結(jié)構(gòu)及其代謝產(chǎn)物的調(diào)節(jié)作用

2.1 腸道菌群結(jié)構(gòu)

腸道菌群及其代謝產(chǎn)物可與機體免疫系統(tǒng)相互作用，因此能夠?qū)C體產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)作用[38]。某些高分子質(zhì)量的LBP可作為能量物質(zhì)被腸道菌群利用，由此改變菌群的結(jié)構(gòu)、豐度和代謝產(chǎn)物，從而調(diào)控機體免疫狀態(tài)。此外，由于不同菌群所表達的糖苷酶體系不同，LBP可對不同菌種產(chǎn)生促生長或抑制生長的不同影響[39]。王瑩[9]利用水提醇沉提取、DEAE-52纖維素柱和HW-65色譜柱層析法純化到了兩個均一性的LBP組分（LBP1和LBP2），其分子質(zhì)量分別為1 207.4 kDa和125 kDa。經(jīng)體外模擬消化和Caco-2細胞模型轉(zhuǎn)運實驗發(fā)現(xiàn)，LBP1和LBP2均能耐受消化，且不易被小腸吸收。上述LBP1顯著提高了雙歧桿菌、乳桿菌、擬桿菌、普雷沃氏菌科和理研菌科的相對豐度，降低了大腸桿菌、副擬桿菌和瘤胃球菌的相對豐度[9]。有研究表明，當(dāng)小鼠結(jié)腸中的雙歧桿菌和乳桿菌豐度增加時，機體針對β-乳球蛋白的過度免疫反應(yīng)得到了明顯抑制[40]。

Zhou Fang等[41]使用水溶醇沉和大孔樹脂S-8純化得到LBP（阿拉伯糖、鼠李糖、木糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖的物質(zhì)的量比為0.18∶0.81∶0.07∶2.17∶0.23∶6.52），并重點研究了LBP對腸道內(nèi)乳酸菌的調(diào)控作用，發(fā)現(xiàn)LBP促進了乳酸菌中的長雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌Bi-26和嗜酸乳桿菌NCFM的增殖，其作用機制可能是LBP促進了菌體內(nèi)丙酮酸代謝、碳代謝和糖酵解/糖異生等生物代謝過程。此外，LBP還提高了嬰兒雙歧桿菌Bi-26中β-半乳糖苷酶（β-galactosidase，β-GAL）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）的活性[41]。嗜酸乳桿菌NCFM與LBP共培養(yǎng)時，β-GAL、LDH、己糖激酶、6-磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶的活性也顯著升高[41]。與該結(jié)果類似的是，Zhu Wei等[42]使用LBP（阿拉伯糖、鼠李糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖物質(zhì)的量比為0.18∶0.81∶0.07∶2.17∶0.23∶6.52）刺激昆明小鼠后發(fā)現(xiàn)，嗜酸乳桿菌和長雙歧桿菌的相對豐度明顯增加。嗜酸乳桿菌可刺激人外周血單核細胞分泌抗炎細胞因子（如腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-β和IL-10），雙歧桿菌可誘導(dǎo)機體分泌免疫球蛋白（如免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）G和IgA）[43]。這些益生菌都能提高人體的自身免疫功能，同時避免過度免疫的發(fā)生。

程翔[44]使用LBP刺激腸道菌群失調(diào)的昆明小鼠，發(fā)現(xiàn)小鼠腸道內(nèi)的腸桿菌、雙歧桿菌和乳桿菌豐度明顯增加。Ding Yu等[45]使用水提醇沉法得到枸杞粗多糖LBPS，并以此刺激BALB/c小鼠，發(fā)現(xiàn)LBPS可以有效改善環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫抑制，提升腸道中乳桿菌和擬桿菌的相對豐度。本課題組的研究也同樣表明，小鼠經(jīng)口攝入枸杞子阿拉伯半乳聚糖后，腸道中Muribaculaceae、Lachnospiraceae、Ruminococcaceae、Prevotellaceae和Rikenellaceae等有益菌豐度上升[36]。已有研究使用Pearson法對上述部分菌種的相對豐度與免疫功能指數(shù)之間的相關(guān)性進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Prevotellaceae和Rikenellaceae豐度越高，免疫器官指數(shù)（脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)）、淋巴細胞（T細胞和B細胞）數(shù)量、免疫球蛋白（IgG和IgM）水平以及CD4+T細胞數(shù)量越高[3]。

2.2 腸道菌群的代謝產(chǎn)物

LBP可作為能量物質(zhì)促進部分腸道菌群生長，同時產(chǎn)生乙酸、丙酸等短鏈脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs）。SCFAs可通過多種途徑調(diào)控機體免疫狀態(tài)：1）抑制組蛋白脫乙酰酶的活性，從而下調(diào)促炎因子和腫瘤壞死因子的表達[46]；2）負向調(diào)控核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）通路，降低氧化應(yīng)激水平，減輕機體炎癥反應(yīng)[39]；3）通過腸道上皮細胞或免疫細胞表面的G蛋白偶聯(lián)受體（G protein-coupled receptors，GPR）（包括GPR43和GPR41）傳遞信號[47]，抑制腺苷酸環(huán)化酶的活性，減少環(huán)磷酸腺苷的產(chǎn)生，同時提升細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）和促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路的應(yīng)答水平[48]。MAPK、ERK通路的激活往往伴隨著細胞因子（如IL-4、IL-10、TNF-β）分泌量的增加，從而改變機體的免疫/炎癥水平。

從SCFAs對機體免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)效果來看，雙向調(diào)控作用較為多見。一方面，SCFAs可通過GPR43受體刺激抗炎型巨噬細胞M2的增殖與極化[49]，促進中性粒細胞的遷移[50]，提高機體的免疫應(yīng)答水平；另一方面，SCFAs可誘導(dǎo)形成促炎因子TNF-α，激活NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）炎癥小體[51]，最后誘導(dǎo)炎癥小體釋放IL-18[52]。IL-18可與抗原呈遞細胞和初始T細胞反應(yīng)，誘導(dǎo)形成調(diào)節(jié)型T細胞，防止機體產(chǎn)生Th2型過度免疫應(yīng)答[53]。

近年來，精準(zhǔn)解析LBP對腸道菌群和其代謝產(chǎn)物的調(diào)節(jié)機制已成為研究熱點。Ding Yu等[54]利用水提醇沉法提取得到LBP，其單糖組成的物質(zhì)的量分數(shù)為葡萄糖酸5.12%、半乳糖醛酸12.40%、葡萄糖2.15%、半乳糖39.67%和阿拉伯糖40.66%。研究證實，LBP在腸道菌群的作用下代謝生成了乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸、己酸和異己酸，其中乙酸含量最高，約占SCFAs總產(chǎn)量的55%，戊酸含量最低，約占SCFAs總產(chǎn)量的6%[54]。Cao Cui等[36]的研究表明，枸杞子阿拉伯半乳聚糖LBP-3顯著促進了結(jié)腸炎模型小鼠腸道中乙酸、丙酸、丁酸的生成，恢復(fù)了腸道穩(wěn)態(tài)，提升了機體免疫抵抗水平。

3 枸杞子多糖對免疫細胞的作用

3.1 枸杞子多糖進入機體內(nèi)循環(huán)的機制

免疫細胞大多存在于機體的血液、淋巴組織、黏膜等部位，多糖需首先跨越腸道屏障吸收入血，才能與各免疫細胞作用。現(xiàn)有研究對于多糖能否跨越上皮細胞屏障進入機體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)尚存在爭議。王瑩[9]借助Caco-2細胞模型研究小腸上皮細胞對LBP中兩個組分（LBP1和LBP2，mw1 207.4 kDa和125 kDa）的轉(zhuǎn)運效率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其累積轉(zhuǎn)運率極低，分別為0.99%和1.15%。說明上述兩組分在小腸中不易吸收。相較于大分子物質(zhì)，低分子質(zhì)量、體積較小的分子更易跨過腸道上皮細胞屏障而進入機體內(nèi)循環(huán)。如唐華麗[55]的研究表明，LBP3（mw4.92 kDa）能夠以原型形式參與吸收和代謝?？诜惲蚯杷狨晒馑兀╢luorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標(biāo)記的LBP3（LBP3-FITC）1 h后，大鼠的小腸和胃部檢測到了大量的LBP3-FITC；口服6 h后，小腸和胃部的LBP3-FITC含量降低，但肝臟、腎臟和大腸中的LBP3-FITC含量顯著上升[55]。針對上述研究結(jié)果不一致的情況，分析其原因主要在于各研究中使用的多糖提取及純化手段不一樣，導(dǎo)致提取得到組分的分子質(zhì)量差異較大。其次，各研究中借助的細胞或動物模型并不一致，也對研究結(jié)果影響較大。

一些支持多糖可以進入內(nèi)循環(huán)的研究者認為，人體消化系統(tǒng)內(nèi)缺乏針對多糖類物質(zhì)的水解酶，因此口服多糖可通過與胃腸道上皮細胞或腸相關(guān)淋巴組織結(jié)合，從而進入機體內(nèi)循環(huán)[56]。根據(jù)相關(guān)文獻，可總結(jié)出3 條多糖跨越腸道上皮細胞的途徑（圖3）。途徑一：腸道相關(guān)的淋巴組織（gut associated lymphoid tissue，GALT）中某些組織，如派氏淋巴結(jié)和孤立淋巴濾泡中的微褶皺細胞，可通過跨細胞途徑從腸腔中攝取大分子物質(zhì)（包括多糖）。隨后，這些物質(zhì)被呈遞給位于上皮細胞下方或者M細胞基底表面“口袋”中的樹突狀細胞（dendritic cell，DC），推動下一步生化反應(yīng)[57-58]。途徑二：DC通過延伸“觸角”攝取腸腔中的多糖，并將免疫信號傳遞給血液中的淋巴細胞[59]。途徑三：多糖被腸道微生物分解為寡糖片段，菌群將多糖代謝后也可產(chǎn)生SFAC，這些小分子物質(zhì)可經(jīng)腸上皮細胞的跨細胞途徑進入血液，從而與諸多免疫細胞反應(yīng)，調(diào)節(jié)機體免疫狀態(tài)。

圖3 多糖跨越腸道上皮細胞的可能途徑Fig. 3 Possible pathways for polysaccharides to cross intestinal epithelial cells

3.2 枸杞子多糖對抗原呈遞細胞的影響

機體內(nèi)存在多種免疫細胞，不同細胞的功能各不相同?？乖蔬f細胞（主要包括巨噬細胞和DC）可與入侵機體的病原微生物或抗原直接反應(yīng)，隨后合成和分泌趨化因子和細胞因子[60]，激活T/B淋巴細胞或調(diào)整T淋巴細胞的分化方向[38]，從而調(diào)節(jié)整個免疫反應(yīng)的進程。

3.2.1 巨噬細胞

LBP對巨噬細胞的影響效果呈現(xiàn)雙向特征，一方面，LBP可增強巨噬細胞的吞噬能力[61]，促進其分泌TNF-α[34]、IL-1β、IL-6以及NO等炎癥介質(zhì)，提升機體對外源有毒有害物質(zhì)的免疫應(yīng)答水平[62]；另一方面，在細胞脂多糖與LBP共同刺激巨噬細胞時，LBP抑制了TNF-α、IL-6和NO的過度產(chǎn)生，降低了脂多糖的毒害作用[63]，而且這種抑制作用可能與對c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）通路和ERK1/2/MAPK通路的抑制效果有關(guān)[11]。此外，LBP還能調(diào)節(jié)促炎型巨噬細胞M1與抗炎型巨噬細胞M2之間的相互轉(zhuǎn)化[64-65]，從而發(fā)揮“提升機體對病原微生物的免疫應(yīng)答”和“抑制過度免疫應(yīng)答”的雙向調(diào)節(jié)作用。

LBP調(diào)控巨噬細胞的分子機制已被眾多學(xué)者反復(fù)探究，目前多項證據(jù)顯示，LBP可與巨噬細胞表面的Toll樣受體（toll-like receptor，TLR）2/4結(jié)合，刺激細胞內(nèi)的髓樣分化因子（myeloid differentiation factor，MyD）88、TIR結(jié)構(gòu)域銜接蛋白（TIR domain-containing adaptor，TRIF）等信號蛋白，進而激活MAPK、NF-κB等信號通路，誘使巨噬細胞分泌TNF-α、IL-1、IL-6等炎癥因子[39,66]。張小銳[67]使用水溶醇沉和DEAE纖維素柱純化法得到了LBP與蛋白的復(fù)合物L(fēng)BPF4，又通過Pronase E降解釋放得到均一性的多糖組分LBPF4-OL（mw81 kDa）。通過使用抗體封閉、3H-胸腺嘧啶核苷摻入法、TLR基因突變小鼠實驗等手段，證明了LBPF4在巨噬細胞表面的作用受體為TLR4和TLR2[67]。王瑩[9]借助小鼠單核巨噬細胞白血病細胞（RAW264.7）模型研究均一性枸杞子多糖組分LBP1（1 207.5 kDa）和LBP2（125 kDa）的免疫調(diào)節(jié)活性，發(fā)現(xiàn)LBP1和LBP2均能顯著促進RAW264.7細胞增殖，提高細胞中IL-6、TNF-α、IL-1β和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS） mRNA表達量，同時誘導(dǎo)p-JNK MAPKs信號通路的激活。

另外，LBP對巨噬細胞的增殖、細胞活力和吞噬功能均有促進作用[68]。如Zhang Xiaorui等[69]發(fā)現(xiàn)LBPF4-OL（mw181 kDa）可顯著刺激BALB/c小鼠體內(nèi)的巨噬細胞增殖；楊青[65]發(fā)現(xiàn)LBP可刺激RAW264.7細胞的增殖；Gong Guiping等[34]的研究顯示，枸杞子阿拉伯半乳聚糖（mw91.2 kDa）不僅能將RAW264.7細胞活力提升到126.39%（空白組的細胞活力設(shè)置為100%），同時還能提升RAW264.7細胞的吞噬能力和酸性磷酸酶（acid phosphatase，AP）活力。AP是巨噬細胞的標(biāo)志性酶，可協(xié)助細胞完成吞噬行為[70]。AP活力越高，代表巨噬細胞的免疫活性越強[2]。

從主鏈-支鏈的結(jié)構(gòu)特征來看，LBP對巨噬細胞的刺激可能與其多支鏈結(jié)構(gòu)有著密切聯(lián)系：Peng Qiang等[71]在前期通過凝膠滲透色譜法對黑果枸杞中的多糖進行分離純化，得到了多糖組分LRGP3，并表征其為以β-(1→3)-Gal為主鏈，O6位被大量半乳糖和阿拉伯糖取代的多分支結(jié)構(gòu)。隨后，該團隊繼續(xù)對LRGP3進行化學(xué)改性，通過乙?；⒉糠炙崴夂兔赶瘜RGP3的主鏈與測鏈分離，發(fā)現(xiàn)與主鏈結(jié)構(gòu)相比，側(cè)鏈結(jié)構(gòu)（阿拉伯糖、半乳糖、鼠李糖的物質(zhì)的量比為16.8∶1.4∶1.0）更能刺激巨噬細胞的增殖[72]。

許多研究中提取得到的LBP都是阿拉伯半乳聚糖，而阿拉伯半乳聚糖具有許多功能性基團，可影響其免疫調(diào)節(jié)活性。Xie Gang等[73]的研究表明，阿拉伯半乳聚糖中硫酸基的含量與其激活巨噬細胞的能力有關(guān)。Li Ningyang等[74]推測，這是由于硫酸基含量越高，多糖在水中的溶解性越強，也越容易通過與其他功能性基團接枝來發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)活性。Wang Xuesong等[75]的研究表明，半乳糖醛酸骨架中的乙?；吭礁?，其免疫調(diào)節(jié)活性越差。Ferreira等[76]報道稱，具有脫酯化同型半乳糖醛酸骨架的阿拉伯半乳聚糖往往具有免疫抑制活性，而該現(xiàn)象的產(chǎn)生與半乳糖醛酸殘基中帶負電荷的羧基有關(guān)。

3.2.2 樹突狀細胞

DC廣泛分布于機體的皮膚、氣道、口腔黏膜、胃腸道上皮和淋巴器官等部位，可通過攝取、加工處理和遞呈抗原介導(dǎo)細胞免疫應(yīng)答，對機體的免疫狀態(tài)起到至關(guān)重要的作用[77]。根據(jù)DC的發(fā)育狀態(tài)可將其分為4 類，分別是DC前體細胞、未成熟DC、遷移期DC和成熟DC[78]。在病原體感染、炎癥因子或病原微生物的刺激下，DC前體細胞會分化為未成熟DC。未成熟DC主要發(fā)揮吞噬功能，具有極強的抗原攝取能力，但往往不能呈遞抗原或活化初始T細胞[78]。而成熟DC能夠加工、處理抗原，并將抗原以抗原肽——主要組織相容性復(fù)合體2類分子復(fù)合物（major histocompatibility complex class II，MHCII）形式呈遞給初始T細胞，誘導(dǎo)下一步免疫反應(yīng)[78]。遷移期DC是處于未成熟DC和成熟DC中間階段的一類DC[77]。與其他3種類別相比，未成熟DC在機體內(nèi)的含量最高[79]。

LBP對DC的影響可概括為4個方面：1）促進DC增殖；2）誘導(dǎo)DC表型和功能的成熟；3）刺激DC產(chǎn)生不同細胞因子，推動后續(xù)免疫反應(yīng)；4）改變DC的吞噬效率。如郝習(xí)等[80]研究表明，LBP可促進DC的增殖；Zhu Jie等[81]研究表明，LBP（mw31 kDa）可與DC表面的TLR2/4受體結(jié)合，繼而激活NF-κB通路，誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生炎性介質(zhì)IL-12 p40（圖4）。Duan Xiangguo等[82]發(fā)現(xiàn)LBP可通過TLR4-MAPK-Erk1/2-Blimp1通路刺激DC表型成熟，表現(xiàn)為細胞表面MHC-II、CD80和CD86表達量上升，炎性介質(zhì)IL-6分泌量上升（圖4）。此外，還有研究表明LBP可通過TLR2/4受體刺激p38 MAPK等通路，從而釋放IL-6、IL-10、單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）、干擾素（interferon，IFN）-γ、TNF等細胞因子[83-84]。但也有研究表明，LBP既可以促進未成熟的DC吞噬抗原，也能適度抑制DC的成熟[85]。

圖4 LBP對樹突狀細胞中部分信號通路的影響[81-82]Fig. 4 Effect of LBP on some signaling pathways in dendritic cells[81-82]

廖海峰[83]研究表明，不同分子質(zhì)量的LBP刺激DC成熟的效果各不相同。與其他分子質(zhì)量范圍的LBP相比，LBP3（mw40～350 kDa）可顯著誘導(dǎo)DC表面共刺激因子CD80、CD86、MHC-II的表達，促進細胞的成熟。此外，LBP3還能刺激DC分泌NO[83]。在抗感染免疫機制中，NO與含鐵酶活性部位中的Fe-S基團結(jié)合，形成鐵-亞硝酞基復(fù)合物，促使感染病原體的細胞中鐵含量迅速降低，從而破壞許多含鐵細胞酶的活性，阻斷細胞的ATP合成及DNA復(fù)制，提升機體對病原體的免疫應(yīng)答水平[86]。相似地，Zhang Minghui等[87]的研究顯示，DC可通過分泌NO抑制T淋巴細胞的增殖，從而起到抑制過度免疫的作用。由此可見，DC可雙向調(diào)節(jié)機體的免疫應(yīng)答，LBP借助DC發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能的具體機制還需要全面而系統(tǒng)的研究。

3.3 枸杞子多糖對淋巴細胞的影響

淋巴細胞主要存在于淋巴管中循環(huán)的淋巴液中，是機體免疫應(yīng)答功能的重要細胞成分。淋巴細胞是一類具有免疫識別功能的細胞系，按其發(fā)生遷移、表面分子和功能的不同，可分為T淋巴細胞（又名T細胞）、B淋巴細胞（又名B細胞）和NK細胞。與LBP對DC的影響類似，LBP也可對淋巴細胞增殖、T細胞分化方向、細胞因子分泌等進行調(diào)控。

3.3.1 T細胞

除了可以刺激活化的T細胞增殖[88]，LBP還能影響T細胞內(nèi)凋亡因子的表達量，從而調(diào)控T細胞的凋亡[89]。Bo Ruonan等[90]研究發(fā)現(xiàn)，卵清蛋白和LBP的合成脂質(zhì)體有效刺激了體內(nèi)CD4+T和CD8+T細胞增殖。CD4+和CD8+T細胞是T淋巴細胞的兩個亞群，它們的數(shù)量及比例與機體的免疫功能息息相關(guān)。王瑩[9]的研究表明，LBP1（1 207.4 kDa）和LBP2（125 kDa）能有效上調(diào)CD4+T和CD8+T細胞的數(shù)量，同時提高CD4+T/CD8+T的比值。除了直接刺激T淋巴細胞外，LBP也能通過促進DC細胞功能和表型的成熟，促使DC呈遞抗原，從而推動CD4+T大量分化為Th1、Th2細胞或濾泡輔助T（follicular helper T，Tfh）細胞[91]。Th1細胞能夠激活巨噬細胞、CD8+T細胞和CD4+T細胞?；罨木奘杉毎淌刹⑾毎麅?nèi)細菌，IFN-γ激活iNOS合成NO從而直接殺死細胞內(nèi)細菌和其他病原微生物。Th2細胞可通過分泌IL-4、IL-5、IL-9、IL-10、IL-13和IL-25等細胞因子，刺激漿細胞產(chǎn)生抗體或激活嗜酸性粒細胞攻擊微生物，從而提升機體免疫應(yīng)答水平[38]或誘發(fā)超敏反應(yīng)[38]。作為輔助T細胞的一個亞群，Tfh細胞能調(diào)節(jié)B細胞成熟，促使其發(fā)揮抗體分泌功能。Su Chunxia等[92]研究發(fā)現(xiàn)，LBP激活了CXCR5+PD-1+Tfh細胞并誘導(dǎo)其分泌炎性因子IL-21。IL-21可推動初始B細胞的分化，同時介導(dǎo)IgG1和IgG3之間的轉(zhuǎn)換。因此，LBP可作為促進Tfh細胞生成的免疫佐劑來增強T細胞依賴性免疫反應(yīng)。

3.3.2 B細胞

B細胞主要位于淋巴結(jié)皮質(zhì)淺層的淋巴小結(jié)和脾臟的淋巴小結(jié)內(nèi)，在抗原刺激下可分化為漿細胞，漿細胞可合成和分泌抗體，從而參與調(diào)節(jié)機體的免疫應(yīng)答。口服LBP可以刺激漿細胞分泌抗體IgG、IgM、IgA，維護機體對氟化鈉的抵抗力[93]。Zhang Xiaorui等[94]的研究表明，LBPF4-OL（mw181 kDa）可通過刺激巨噬細胞分泌TNF-α和IL-1β，而后引發(fā)B細胞增殖。該學(xué)者又繼續(xù)對LBPF4-OL的化學(xué)結(jié)構(gòu)進行研究，發(fā)現(xiàn)LBPF4-OL的單糖組成為鼠李糖、阿拉伯糖和半乳糖（物質(zhì)的量比為0.05∶1.33∶1.0），其主鏈的重復(fù)單元由β-(1,4)-鍵連接的半乳糖組成，主鏈上的分支糖包括少量β-(1,3)-半乳糖和大量的阿拉伯糖[94]。經(jīng)過酸水解去除支鏈后，LBPF4-OL的生物活性明顯降低，提示LBPF4的分支結(jié)構(gòu)和高聚合度是其發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)活性的重要條件[94]。此外，LBP也可通過刺激Th2細胞分泌IL-4，從而誘導(dǎo)B細胞產(chǎn)生IgE[92]。IgE是介導(dǎo)I型變態(tài)反應(yīng)最重要的媒介，它可刺激肥大細胞和嗜堿性粒細胞釋放組胺、5-羥色胺和白三烯，從而誘發(fā)支氣管痙攣、腹瀉、過敏性休克等過敏癥狀[38,95]。但也有報道稱，肥大細胞和嗜堿性粒細胞脫顆粒所釋放的β-氨基己糖苷酶等物質(zhì)可以刺激胃腸蠕動和支氣管收縮、降低胃液的pH值，從而有效去除影響機體健康的微生物[96]。

3.3.3 NK細胞

NK細胞能夠識別靶細胞、殺傷介質(zhì)，參與機體的抗腫瘤、抗感染和超敏反應(yīng)。與T、B淋巴細胞不同的是，NK細胞無需預(yù)先致敏就能非特異性殺傷腫瘤細胞和病毒感染后的細胞[97]。Yan Tinghu等[98]驗證了灰樹花多糖、香菇多糖、靈芝多糖、酵母葡聚糖和LBP對NK細胞的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些多糖均可促進NK細胞分泌IFN-γ和穿孔素，顯著增加NK細胞的細胞毒性。劉彥平等[99]的研究表明，LBP能提高被環(huán)磷酰胺抑制的NK細胞活性，恢復(fù)機體免疫功能。Li Qi等[100]使用不同植物多糖刺激NK細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)枸杞多糖能提高NK細胞的細胞毒活性。黃振華等[101]借助免疫抑制小鼠模型，發(fā)現(xiàn)LBP提高了NK細胞的殺傷活性，并進一步推測LBP的免疫促進功能與Band-3蛋白（能維持正常紅細胞形態(tài)和功能）表達水平的恢復(fù)有關(guān)。肖芳等[102]的研究表明，LBP能夠通過上調(diào)人前髓細胞HL-60表面靶細胞相應(yīng)配體的表達水平，刺激NK細胞增強殺傷活性，提升機體對白血病等腫瘤疾病的抵抗作用。

4 枸杞子多糖對神經(jīng)內(nèi)分泌免疫系統(tǒng)的作用

免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)三者相互影響，形成神經(jīng)內(nèi)分泌免疫系統(tǒng)（圖5）。脊髓、腦干、下丘腦、海馬體和大腦皮層中都存在調(diào)節(jié)免疫活動的神經(jīng)中樞。這些神經(jīng)中樞可以支配免疫器官的神經(jīng)末梢釋放神經(jīng)遞質(zhì)如乙酰膽堿（acetylcholine，Ach）、去甲腎上腺素（noradrenaline，NA）和5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT），也能刺激下丘腦-垂體-巴腺體軸釋放促甲狀腺激素和生長素[103]。LBP對神經(jīng)內(nèi)分泌免疫系統(tǒng)具有明顯影響[39]。聶偉等[104]報道稱LBP能降低脾臟和下丘腦中NA、5-HT的水平。而NA和5-HT均能夠激活B細胞從而提升機體免疫功能[105]。

圖5 神經(jīng)內(nèi)分泌免疫系統(tǒng)[103]Fig. 5 Neuroendocrine immune system[103]

Xiao Zhiyong等[39]推測LBP還能通過下丘腦-垂體腎上腺/性腺軸或下丘腦-自主神經(jīng)系統(tǒng)-外周免疫器官（如脾臟）等通路發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。王瑩[9]、蔣艷[106]等均發(fā)現(xiàn)LBP顯著提高了小鼠體內(nèi)免疫器官（脾臟和胸腺）的臟器指數(shù)，證明LBP可以促進機體免疫器官的生長發(fā)育，也有研究發(fā)現(xiàn)LBP可以增加腸道內(nèi)PP的數(shù)目[107]，增強機體免疫功能。

5 結(jié) 語

由于各研究中所使用的提純方法并不一致，導(dǎo)致LBP的免疫調(diào)節(jié)效果和作用機制也并不相同。但這些不同的LBP組分可通過多種途徑作用于機體的不同靶點，由此發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。在LBP作用的眾多靶點中，腸道菌群及其產(chǎn)生的SCFAs、巨噬細胞、DC、T細胞、B細胞和神經(jīng)內(nèi)分泌免疫系統(tǒng)均能雙向調(diào)節(jié)機體的免疫應(yīng)答狀態(tài)，使LBP發(fā)揮免疫增強/抑制的雙重作用。雖然眾多研究已從不同角度揭示了LBP的部分免疫調(diào)節(jié)機制，但還有以下問題尚待解決：1）從結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系的解析情況來看，部分研究使用從生物公司購買的LBP開展實驗，研究內(nèi)容側(cè)重于探究LBP對腸道菌群生長的調(diào)控機制及其在不同細胞中的作用靶點和作用通路[11,82,93]等功能活性方面。這些研究對明確LBP發(fā)揮生物活性的具體機制具有重要意義，但因研究重點有所側(cè)重，該類報道中LBP的化學(xué)結(jié)構(gòu)特征并不十分明確。此外，LBP不同組分中存在不同的支鏈結(jié)構(gòu)[34,108]，這些支鏈各自發(fā)揮什么樣的免疫調(diào)節(jié)功能，又分別能與免疫細胞表面哪一種受體結(jié)合，多糖組分中的主鏈與支鏈在免疫調(diào)節(jié)過程中扮演了什么樣的角色？這些問題尚需闡明。因此，LBP發(fā)揮免疫功能的效用成分和其作用機制有待進一步明確，LBP結(jié)構(gòu)及其免疫調(diào)節(jié)活性之間的緊密聯(lián)系也有待進一步解析[109]。2）從受體結(jié)合方面來看，雖然目前的研究已經(jīng)表明，LBP能夠與樹突細胞、巨噬細胞表面的TLR2/4受體結(jié)合[69]，但究竟是多糖中的哪一段糖鏈與TLR2/4受體中的哪一段氨基酸結(jié)合，多糖的受體結(jié)合位點有著什么樣的結(jié)構(gòu)特征？這些問題都缺乏深入的研究。Xiao Zhiyong等[39]推測，通過對特定糖苷鍵和殘基進行化學(xué)修飾，同時利用蛋白酶對TLR受體蛋白進行可控性水解，再結(jié)合表面等離子共振、等溫滴定量熱法、親和電泳等技術(shù)手段，將能有效解決上述難題。3）從代謝產(chǎn)物方面來看，LBP是一種非消化性多糖，被胃腸微生物分解后可以形成多糖/寡糖片段和不同的短鏈脂肪酸等代謝產(chǎn)物[110-111]，后續(xù)研究可深入解析代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)，探究多糖代謝過程及其代謝產(chǎn)物對機體免疫系統(tǒng)的影響。4）從免疫調(diào)節(jié)方面來看，現(xiàn)有文獻對LBP的免疫增強功能挖掘較多，而對其免疫抑制活性的關(guān)注較少。目前僅有少量研究報道了LBP在抗腫瘤方面所起到的“降低抗腫瘤藥物的免疫毒性/增加機體對腫瘤的免疫抵抗”的雙向功能[11,112-113]。后續(xù)研究可著重關(guān)注多糖在下調(diào)機體免疫應(yīng)答方面的效果與機制。此外，LBP的免疫調(diào)節(jié)功能涉及機體多種器官、細胞和通路，后續(xù)研究需綜合考慮多糖對不同組織、細胞的影響，全面而深入地探索其免疫調(diào)節(jié)機制。

綜上，LBP的提取純化方式、結(jié)構(gòu)特征、對不同免疫細胞的作用效果、與細胞表面受體結(jié)合的分子機制、刺激細胞內(nèi)部信號通路的情況等均需進行更深入的研究。未來研究也可從多糖組分的化學(xué)修飾和代謝產(chǎn)物入手，開發(fā)新型免疫調(diào)節(jié)活性物質(zhì)，為LBP的精深利用提供理論基礎(chǔ)。