Ca2+/CaN/NFATc信號通路及其抑制劑與心血管疾病的研究進展

朱明利，唐 碧，康品方，張先林

NFATc基因起源于脊椎動物，參與脊椎動物特有的功能，例如復雜的神經(jīng)系統(tǒng)、重組免疫系統(tǒng)和具有復雜心臟的血管系統(tǒng)[1]。心肌的生理和病理生長通常由膜結(jié)合受體啟動，該膜結(jié)合受體通過多種GTP酶蛋白、激酶和磷酸酶促進細胞內(nèi)信號傳導[2]。近期研究結(jié)果表明，細胞內(nèi)持續(xù)升高Ca2+激活鈣調(diào)磷酸酶(CaN)使活化的T淋巴細胞的核因子(NFAT)去磷酸化，促進其向核內(nèi)轉(zhuǎn)運，從而參與T淋巴細胞中各種免疫應(yīng)答基因以及其他細胞類型中具有多種功能的基因的轉(zhuǎn)錄誘導。CaN調(diào)節(jié)的NFAT轉(zhuǎn)錄因子有4種：NFATc1、NFATc2、NFATc3、NFATc4，各自在心肌中表達[3]。Ca2+/CaN/NFATc信號通路在心血管疾病的發(fā)生中起重要的作用，認識該信號通路作用機制將為心血管疾病的診療提供新的依據(jù)。

1 Ca2+

Ca2+是所有真核細胞類型中普遍存在的關(guān)鍵信號傳導元素，能調(diào)節(jié)各種基本的生理過程，例如細胞分化、增殖和運動、凋亡、分泌、興奮、收縮和神經(jīng)元可塑性。在心臟中，Ca2+最明顯的關(guān)鍵作用是其參與電活動和心臟收縮，除了直接參與興奮收縮(excitation contraction，EC)耦合外，還是各種信號級聯(lián)中的重要元素，調(diào)節(jié)各種下游效應(yīng)子的活性[4-5]。因此，Ca2+不但可以發(fā)揮急性作用，還可以參與基因表達的調(diào)控，稱為激發(fā)轉(zhuǎn)錄(excitation transcription，ET)耦合。這些ET偶聯(lián)途徑不僅能夠維持心臟動態(tài)平衡而且在心臟病的發(fā)展中都起著至關(guān)重要的作用[6]。

2 CaN

CaN是由催化亞基A(CnA)和調(diào)節(jié)性亞基B(CnB)組成。CnA包含1個磷酸酶催化結(jié)構(gòu)域、1個CnB結(jié)合結(jié)構(gòu)域、1個鈣調(diào)蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域和羧基末端自動抑制結(jié)構(gòu)域(AID)。活化狀態(tài)下，細胞質(zhì)Ca2+濃度的升高有助于鈣調(diào)蛋白取代AID，并通過激活CnB中的Ca2+結(jié)合EF-手基序來促進CnB與CnA的結(jié)合，從而導致CaN的活化[7]?；罨腃aN使NFAT同源區(qū)域(NHR)中的多個磷酸殘基去磷酸化，從而導致NFAT胞質(zhì)-核轉(zhuǎn)運并與內(nèi)皮轉(zhuǎn)錄因子-4(GATA4)協(xié)同作用[8]。因此，鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶在NFAT脫磷酸作用中起關(guān)鍵作用。

3 NFATc

NFAT的轉(zhuǎn)錄因子NFATc家族，有5個亞型：NFAT1(NFATc2)、NFAT2(NFATc1)、NFAT3(NFATc4)、NFAT4(NFATc3)及NFAT5(NFATL1)[2]。NFAT1-4是由NHR、Rel同源區(qū)域(RHR)和C端結(jié)構(gòu)組成。NHR包含1個N末端反式激活結(jié)構(gòu)域(TAD)即CaN結(jié)合位點，核定位序列(NLS)和核輸出信號(NES)，此外其帶有SRR1、SRR2、SP1、SP2和SP3富含絲氨酸的基序；RHR包含DNA結(jié)合域和具有其他轉(zhuǎn)錄結(jié)合伴侶(例如Fos和Jun)的識別點[9]。因此，Ca2+/CaN途徑調(diào)節(jié)NFAT1-4，但不能激活NFAT5，因為其缺乏NHR。靜息狀態(tài)下，NFAT位于細胞核中，當NHR絲氨酸基序去磷酸化時，NFAT中的核定位序列(NLS)暴露，導致NFAT蛋白從細胞核轉(zhuǎn)到細胞質(zhì)[10-11]。

4 Ca2+/CaN/NFATc信號通路的激活

NFAT的顯著特征是受Ca2+/CaN途徑的調(diào)節(jié)。NFAT蛋白被磷酸化并駐留在靜息細胞的細胞質(zhì)中，細胞表面的受體與配體結(jié)合可誘導磷脂酶C(PLCy)的活化并水解成二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)、二?；视?DAG)和肌醇三磷酸(IP3)[12]。IP3與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)膜上的Ca2+滲透性IP3受體(IP3R)結(jié)合，并刺激Ca2+從存儲區(qū)釋放到細胞質(zhì)中，NFAT蛋白受到刺激后，被鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶去磷酸化，易位從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細胞核，并具有轉(zhuǎn)錄活性。同時細胞質(zhì)Ca2+的增加導致Ca2+傳感器鈣調(diào)蛋白(CaM)的激活，而CaM進一步激活CaN[13]。因此，細胞內(nèi)Ca2+/CaN/NFATc信號傳導與基因表達之間具有直接聯(lián)系。

5 Ca2+/CaN/NFATc信號通路與心血管疾病

5.1 Ca2+/CaN/NFATc信號通路與原發(fā)性高血壓 原發(fā)性高血壓是最常見的心血管疾病之一，也是心血管疾病的主要危險因素。原發(fā)性高血壓的發(fā)病機制包括遺傳、飲食、心理因素以及神經(jīng)內(nèi)分泌機制。研究表明，淋巴細胞，特別是T淋巴細胞參與高血壓的發(fā)生、發(fā)展和血管重塑。NFAT的核因子在許多免疫細胞中表達，包括T淋巴細胞、B淋巴細胞、自然殺傷細胞、肥大細胞、嗜酸性粒細胞和單核細胞[14]。NFAT鉀通道可增強鉀離子外排，從而增加細胞膜兩側(cè)的電勢梯度，產(chǎn)生超極化作用以促進Ca2+流入，引起Ca2+濃度的瞬時增加，以及隨后CaN介導的NFAT去磷酸化和NFAT信號通路激活[15]。激活NFAT信號通路并導致進一步的淋巴細胞激活，活化的淋巴細胞產(chǎn)生其他炎性細胞因子，例如白細胞介素(IL)-17，并促進血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)釋放。這種包括IL-6、IL-17和AngⅡ在內(nèi)的炎性環(huán)境以及其他細胞因子會促進鈉在腎臟系統(tǒng)和血管中的滯留，導致血管收縮和血管重塑，最終導致高血壓[16]。

5.2 Ca2+/CaN/NFATc信號通路與冠心病 冠心病是一種以動脈粥樣硬化為基本病變的心血管疾病。轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)信號分子家族在心外膜途徑控制的冠狀動脈發(fā)育中起著重要作用[17]。CaN-NFAT通過激活Smad 2的表達，以控制TGF-β/活化素受體樣激酶5(Alk5)信號轉(zhuǎn)導對冠狀動脈的發(fā)育。有研究通過在小鼠心肌實驗發(fā)現(xiàn)CaN-NFATc3/c4信號通路通過抑制不同血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)配體與受體的結(jié)合來控制冠狀血管的發(fā)育[18]。血管鈣化是動脈粥樣硬化的主要特征，是一個復雜的過程，與骨骼鈣化有許多相似之處。目前研究顯示許多因素參與血管鈣化，氧化低密度脂蛋白(oxLDL)是最主要的因素，其既可以促進動脈粥樣斑塊的形成又可促進血管鈣化[19]。Brown等[20]在研究主動脈平滑肌細胞(BASMC)原代培養(yǎng)中成骨細胞分化的機制發(fā)現(xiàn)oxLDL通過增強β-甘油磷酸酯激活Smad 1、Smad 5、Smad 8信號分子促進Runx2、 Osterix(Osx)成骨細胞轉(zhuǎn)錄因子表達和血管鈣化的形成。有研究發(fā)現(xiàn)NFAT信號可以介導oxLDL損傷血管平滑肌，從而誘導血管平滑肌鈣化和向成骨細胞分化[21]。

5.3 Ca2+/CaN/NFATc信號通路與心肌肥大 心肌肥大對心室壁張力的增加或神經(jīng)體液刺激的適應(yīng)性反應(yīng)起初有益，但持續(xù)的心肌肥大可導致心力衰竭和其他不良心血管事件的發(fā)生。目前認為CaN/NFAT信號傳導可作為介導多種形式病理性心肌肥大的關(guān)鍵控制點，但該途徑需要與其他信號傳導效應(yīng)因子協(xié)同作用[22]。已證明有絲分裂原激活的蛋白激酶(MAPK)影響CaN，NFAT信號傳導也受其影響。MAPK信號通路通常分為3個主要分支，包括p38激酶、c-Jun N末端激酶(JNK)和細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)，一旦激活，p38、JNK和ERK就會磷酸化一系列細胞內(nèi)靶標，其中包括許多轉(zhuǎn)錄因子，導致心臟基因表達重新編程為肥大性程序的一部分[23-24]。有研究顯示，無論在細胞培養(yǎng)還是整個動物研究發(fā)現(xiàn)Ras直接激活Raf-1激酶，從而激活促分裂原激活的蛋白激酶(MEK1)-ERK1/2信號增強NFAT轉(zhuǎn)錄活性[1]。此外，顯性負性MEK1突變體可以阻斷T淋巴細胞中的NFAT活化，即ERK1可以通過一種涉及NFAT蛋白N端調(diào)節(jié)域內(nèi)直接磷酸化的機制直接拮抗COS細胞中NFATc1的核輸入。這類似于糖原合酶激酶3(GSK3)、JNK1/2、p38、蛋白激酶A(PKA)和酪蛋白激酶1(CK1)這5個激酶直接磷酸化多個NFAT因子中的N末端調(diào)節(jié)域，從而拮抗CsN介導的去磷酸化和隨后的NFAT核易位[25]。

5.4 Ca2+/CaN/NFATc信號通路與心肌纖維化 心肌纖維化是心臟病理性重塑的標志性特征，其病理機制是細胞外基質(zhì)(ECM)的過量沉積和成纖維細胞(CF)的不斷增生，導致心臟僵硬度增加、心臟收縮和舒張功能降低，心臟的正常電生理結(jié)構(gòu)改變會誘發(fā)心律失常，甚至猝死[26]。大量證據(jù)表明，Ca2+是一種通用的細胞內(nèi)信使，參與了心臟纖維化。存儲的Ca2+(SOCE)是細胞外Ca2+進入細胞的重要機制，基質(zhì)相互作用分子1(STIM1)和鈣釋放激活鈣通道蛋白1(Orai1)是SOCE的兩個主參與者。心肌受到刺激后，成纖維細胞中的Ang Ⅱ激活導致STIM1與細胞內(nèi)的Orai1和Ca2+相互作用從而引發(fā)心肌纖維化級聯(lián)反應(yīng)。NFAT途徑響應(yīng)Ca2+信號傳導途徑，參與纖維形成過程[27]。TGF-β/ Smad途徑也是與纖維化相關(guān)的重要信號途徑，Ang Ⅱ的激活顯著上調(diào)了轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)的mRNA，并增加了TGF-β下游信號標記的磷酸化。研究表明，Ca2+內(nèi)流激活Smad 2、Smad 3依賴性TGF-β信號傳導，從而促進平滑肌肌動蛋白(a-SMA)和膠原蛋白的表達上調(diào)，因此，推測Ang Ⅱ刺激通過SOCE誘導了連續(xù)的Ca2+流入，隨著胞質(zhì)Ca2+濃度升高這足以激活CaN/NFAT信號通路以啟動轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)/Smad途徑，最終導致心肌纖維化[20]。

6 Ca2+/CaN/NFATc信號通路抑制劑

CaN-NFAT信號已成為調(diào)節(jié)心肌和血管平滑肌細胞(VSMC)炎癥和增生的關(guān)鍵治療靶標。目前，臨床常用鈣信號特異性阻斷藥免疫抑制劑CsA和FK506通過形成CsA-親環(huán)蛋白或FK506-FKBP12復合物而破壞了CaN的活性。盡管已被證明有效，但在破壞CaN活性的同時也影響了CaN下游信號通路的轉(zhuǎn)導，對機體產(chǎn)生不可避免的副作用和毒性[28]。針對于此開發(fā)出針對CaN下游信號NFAT選擇性更強、毒性更小的免疫抑制劑VIVIT，其通過阻止CaN和NFAT的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用來選擇性抑制NFAT活化，但不會影響CaN的活性。與傳統(tǒng)的鈣信號抑制劑CsA和FK506相比，VIVIT顯示出更高的選擇性，VIVIT可以有效抑制鈣調(diào)蛋白激活的NFATc1、NFATc2和NFATc3的去磷酸化和NFATc2的核轉(zhuǎn)運，阻斷了NFAT介導IL-2、IL-3、IL-13、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)的活性，但不會影響NFAT和促分裂原激活的MEK-ERK通路協(xié)同觸發(fā)VSMC增殖的作用[29]。因此，VIVIT作為選擇性NFAT抑制劑是進一步研究的首選。

7 小 結(jié)

Ca2+/CaN/NFATc信號通路在心血管疾病(高血壓、冠心病、心肌肥大，心肌纖維化)發(fā)病機制中涉及的信號通路非常復雜，具體的機制還需進一步探究。目前，開發(fā)出的以CaN底物NFAT為靶點的VIVIT免疫抑制劑在體外和體內(nèi)試驗中顯示出了無數(shù)的前景，其不僅是探索CaN-NFAT信號傳導的有用工具，而且還為治療心血管疾病的新型療法開辟了道路。