人臍帶間充質(zhì)干細胞制劑創(chuàng)制的關鍵技術研究

潘興華，龐榮清，阮光萍，朱向情，蔡學敏，何 潔，趙 晶，劉高米洋

人臍帶間充質(zhì)干細胞制劑創(chuàng)制的關鍵技術研究

潘興華，龐榮清，阮光萍，朱向情，蔡學敏，何 潔，趙 晶，劉高米洋

臍帶；間充質(zhì)干細胞；制劑；關鍵技術

臍帶間充質(zhì)干細胞 （human umbilical cord mesenchymal stem cells,HUC-MSC）來源于新生兒臍帶，具有自我復制和多向分化能力，在體內(nèi)外特定環(huán)境誘導下，可分化為骨、軟骨、肌肉、肝、內(nèi)皮和心肌等功能細胞[1]。與骨髓和脂肪來源的間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells,MSC）相比，HUC-MSC采集方便、來源充足、可規(guī)?；?、標準化生產(chǎn)與儲存，無倫理學爭論，是最具有產(chǎn)業(yè)化和臨床應用前景的干細胞之一。鑒于HUC-MSC的可塑性和免疫調(diào)節(jié)作用，在臨床上可用于衰老、退變、損傷性疾病的治療，例如肝腎損傷、脊髓損傷、退行性病變、移植物抗宿主?。℅VHD）以及自身免疫性疾病等的治療[2]。筆者對研制UC-MSC制劑的關鍵技術進行了概述。

1 HUC-MSC及其臨床制劑制備

1.1 HUC-MSC制備實驗室基本要求 實驗室總體設計、布局、建造、改造、維護必須符合細胞制備的流程要求和人流物流分流的原則，最大限度地有利于環(huán)境凈化，避免污染和交叉污染，便于清潔、操作和維護。建筑平面和空間布局應具有靈活性，主體結(jié)構(gòu)應具有耐久性。實驗室潔凈區(qū)應包括細胞采集室、準備室、細胞分離室、細胞培養(yǎng)室、細胞檢測室、質(zhì)量控制室，非潔凈區(qū)應包括氣體儲存室、物料儲存室、試劑儲存室、辦公室、監(jiān)控中心、資料檔案室、質(zhì)量控制室，潔凈區(qū)應與非潔凈區(qū)不可交叉過往。細胞制備實驗室潔凈區(qū)主要以微粒和微生物為主要控制對象，動態(tài)環(huán)境要求達到B級,即≥5.0 μm懸浮粒子不超過352000,≥0.5 μm懸浮粒子不超過2900,浮游菌(cfu/m2）和沉降菌(cfu/皿）均≤1操作臺要求達到A級，即≥5.0 μm懸浮粒子不超過3520,≥0.5 μm懸浮粒子不超過20,浮游菌(cfu/m2）≤5，沉降菌(cfu/皿）3≤1。

1.2 HUC-MSC的采集 體外制備并用于臨床治療的HUC-MSC是一種特殊“藥物”，首先必須符合生物制劑基本要求，其次要符合臨床輸血標準，還要保證細胞的均一性和生物活性。因此，在體外制備的每一個環(huán)節(jié)都應在潔凈環(huán)境中進行，防止微生物及病毒等有害因子污染，要在特定的環(huán)境中進行操作，以保持細胞的功能。

臍帶采集是質(zhì)量保證的第一關，應對采集細胞的技術方法和安全性、可行性、穩(wěn)定性進行質(zhì)量控制。采集前應對產(chǎn)婦進行健康檢查，按臨床輸血標準排除病源生物，包括愛茲病毒（HIV）、乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）、巨細胞病毒（CMV）、人類皰疹病毒（EB）病毒，同時要存留血樣存2個月后重復檢查，排除潛伏期感染，有條件的還應進行染色體遺傳分析和有針對性的遺傳病基因檢測，盡可能從源頭上排除不利因素[3]。采集過程應在無菌條件下進行，盡可能使用一次性無菌器材，防止共用設備和設施帶來的交叉污染。采集后的臍帶應立即置于無菌器皿的營養(yǎng)液中并迅速轉(zhuǎn)移到細胞制備實驗室進行加工處理。

1.3 HUC-MSC的制備 UC-MSC生產(chǎn)制備的每一個環(huán)節(jié)都有可能影響制劑的質(zhì)量，直接決定著臨床的安全性和有效性，需對UC-MSC制備的每一個環(huán)節(jié)進行標準化研究和控制。本實驗室采取設施條件、設備、試劑固定，技術操作人員分組相對穩(wěn)定，技術操作方法一致的方式實施。體外細胞制備過程應制定詳細的技術操作規(guī)程（SOP），嚴格按照操作規(guī)范對臍帶進行洗滌、去除外膜和血管等，盡可能剪碎至1 mm3以下，充分離心洗滌后采用組織塊貼壁培養(yǎng)法進行分離培養(yǎng)，為提高效率和節(jié)約資源，可對組織塊反復3次進行貼壁培養(yǎng)。一般采集長40～50 cm的臍帶，可用75 cm2的塑料培養(yǎng)瓶進行培養(yǎng),按0.8～1 cm/瓶分散。保守計算，一般原帶培養(yǎng)12～14 d可達到80%～90%細胞融合水平，按常規(guī)方法傳代后4～6 d可長滿瓶底，收集儲存1～2代細胞作為種子細胞。一條長50 cm的臍帶可獲得2代種子細胞2×109個，培養(yǎng)至第5代可獲得6×109個細胞，至少可滿足900人的臨床治療需要[4]。本項目組通過重復實驗和優(yōu)化技術方法建立一套簡單、穩(wěn)定且高效的標準化UC-MSCs制備技術以及一種可直接復蘇回輸?shù)呐R床級UC-MSCs制劑，結(jié)果為臨床治療和相關研究提供了技術和標準化UC-MSCs制劑。該研究用首次貼壁洗脫下來組織塊繼續(xù)接種培養(yǎng)，能使原代產(chǎn)量翻倍，且都獲得了均一性較好的HUC-MSC。將收集生長較好的第3代UC-MSC，以臨床治療用平衡液為基礎，添加白蛋白、二甲基亞砜等細胞保護劑，按1×106細胞/ml的密度配制成臨床級UC-MSC制劑，以60 ml/袋的標準分裝于細胞儲存袋中，采用程序降溫和液氮（-196℃）保存法長期低溫儲存。

2 HUC-MSC臨床制劑的安全性評價

UC-MSC研究的最終目標是用于臨床疾病治療，必須把安全性作為前提條件。本項目組按新生物制劑安全性評價要求對HUC-MSC制劑進行了體外溶血試驗、急性毒性試驗、過敏試驗、致瘤與促瘤試驗和慢性毒性實驗[5]。（1）急性毒性試驗：以×108個細胞/kg的劑量標準通過靜脈輸入小鼠體內(nèi)，系統(tǒng)觀察了臨床表現(xiàn)、血液細胞學、血液生化、主要器官病理組織學等指標，結(jié)果未見與UC-MSC輸入相關的異常表現(xiàn)。（2）體外溶血試驗：分別進行了0.5、0.4、0.3、0.2、0.1 ml的UC-MSC制劑 （濃度為4×105個細胞/ml）的體外溶血觀察均未見溶血現(xiàn)象。（3）過敏試驗：通過反復3次給豚鼠靜脈輸入不同劑量（1× 106～5×106細胞/kg）的HUC-MSC，末次輸注14 d后，足部靜脈注射HUC-MSC觀察過敏現(xiàn)象，未見異常臨床表現(xiàn)。（4）致瘤試驗：采用軟瓊脂克隆生長和體內(nèi)皮下接種致瘤試驗，大體解剖未見臟器或組織有異?，F(xiàn)象，鏡檢未見接種局部節(jié)節(jié)生長。（5）慢性毒性試驗：反復8次給食蟹猴靜脈注射1×106細胞/kg～5×106細胞/kg的HUC-MSC和食蟹猴臍帶間充質(zhì)干細胞（MUC-MSC），各劑量組動物臨床觀察、體重、體溫、心電圖、凝血功能和病理學檢查均未見有異常改變?？梢娧錋ST、CK升高、無機磷輕度降低、外周血CD3+細胞減少、IL-6分泌增加，但停止輸注4 w后恢復。MUC-MSCs重復靜脈給予食蟹猴，MUCMSC在血內(nèi)的暴露程度隨劑量增加而增大，在血內(nèi)有一定的蓄積。 結(jié)果顯示，HUC-MSC治療無急性毒性、過敏、溶血和慢性毒性反應，無致瘤現(xiàn)象，長期、反復多次注射無明顯慢性毒性，安全范圍為1× 106細胞/kg～5×106細胞/kg。

3 HUC-MSC制劑的質(zhì)量控制技術

HUC-MSC制劑的質(zhì)量是保證臨床治療的安全性和有效性的基礎，建立質(zhì)量控制技術及標準是關鍵。本研究建立了如下檢測技術體系及標準。

3.1 生物學特性檢測 （1）存活率：采用臺盼藍（Trypan blue）染色法，活細胞比例≥95%；（2）形態(tài)學：組織貼壁法培養(yǎng)HUC-MSC于第7 d后可見成纖維樣細胞爬出，傳代后呈典型的漩渦狀生長，倍增時間為30～36 h；（3）表型：第3代細胞高表達CD29、CD44、CD90、CD105≥95%，低表達或不表達CD34、CD14、CD45、CD31和HLA-DR≤2%；（4）生長特性：細胞生長曲線呈“S”型；（4）分化潛能：體外誘導可成脂、成骨、成軟骨分化；（5）分泌功能：分泌27種細胞生長因子；（6）細胞均一性:細胞純度≥95%，G0～G1期細胞比例為76～81%，M期細胞比例為8～12%；(7)免疫調(diào)節(jié)功能：體外共培養(yǎng)方法，抑制PHA刺激的T淋巴細胞增殖和IFN-γ分泌，抑制率與HUC-MSC數(shù)量呈正相關[6]。

3.2 病原生物及殘留物檢測 （1）細菌檢測：于UC-MSCs培養(yǎng)前后分別參照現(xiàn)行《中國藥典》細胞無菌實驗規(guī)程進行。在進行臨床治療前，應檢測外源感染因子，結(jié)果陰性方可用于臨床治療；（2）支原體檢測：采用快速PCR法（支原體檢測試劑盒）；（3）病毒檢測：HIV、HAV、HBV、HCV、梅渡螺旋體（TPPA）、CMV、EB病毒檢測分別采用抗體檢測發(fā)和PCR技術兩種方法同時進行，除常規(guī)檢測方法外，也可用電鏡、免疫組化、免疫熒光抗體、放射免疫、酶聯(lián)免疫吸附法和多聚酶聯(lián)反應等方法進行；（4）內(nèi)毒素檢測：用鱟試劑檢測法進行量化檢測，內(nèi)毒素含量符合臨床制劑規(guī)定限量，低于0.25 Eu/ml；（5）殘留成份檢測：血清蛋白、抗體、血清、抗生素、固相微粒等，采用相應試劑進行檢測，血清殘留＜50 ng每袋制劑。

結(jié)果顯示，HUC-MSCs制劑無細菌、支原體和特定病毒污染，制劑在凍存前細胞活性＞90%，復蘇后活性＞85%，細胞表型和生物學功能符合HUC-MSC制劑要求[8]。

4 HUC-MSC制劑的臨床應用技術問題與展望

本項目組參照生物制劑研發(fā)模式創(chuàng)制出1種新型干細胞臨床制劑-HUC-MSC注射液，建立了相應細胞庫，解決了UC-MSC產(chǎn)業(yè)化和臨床應用前的HUC-MSC制備規(guī)范化、HUC-MSC制劑標準化和療效、安全等問題，通過疾病模型治療實驗，探討了UC-MSC的治療原理并擬定了臨床治療方案[7]。目前，課題組創(chuàng)制的HUC-MSC注射液已具備臨床轉(zhuǎn)化應用的技術條件，但要實現(xiàn)該技術和產(chǎn)品廣泛應用，還需要研究和完善一些臨床準入、技術及管理問題[8]：（1）按現(xiàn)行干細胞制劑和臨床研究管理要求進行HUC-MSC制劑的臨床研究申報，獲得相應資質(zhì)方可進入臨床研究；（2）通過規(guī)范化臨床治療研究，進一步驗證臨床療效和安全性，完善臨床治療技術；（3）探討適應證和個性化治療方案及機制；（4）建立系統(tǒng)化的UC-MSC制備、質(zhì)控、儲存與運輸及與臨床接軌的技術和管理流程，利用物聯(lián)網(wǎng)信息技術建立質(zhì)量監(jiān)督體系；（5）通過疾病模型治療或臨床研究，優(yōu)化適應癥選擇和治療途徑、劑量、時機、次數(shù)等基本參數(shù)，建立療效評價技術及標準。

HUC-MSC制劑可廣泛用于涉及組織細胞變性、壞死和缺失的各種損傷、退變性疾病治療，對自身免疫性疾病、繼發(fā)性炎癥反應、創(chuàng)傷性多器官功能不全、移植免疫排斥反應等疾病的治療有重要意義[10]。預計將在心腦血管病的康復治療、肢體創(chuàng)傷和系統(tǒng)性紅斑狼瘡、糖尿病、延緩衰老和老年性器官功能衰退、器官移植排斥反應、輔助造血干細胞移植治療、肝硬化、慢性腎功能不全等疾病治療中發(fā)揮重要作用。由于異體甚至是異種UC-MSC治療不產(chǎn)生明顯的免疫排斥反應[10]，UC-MSC在軍事醫(yī)學領域可用于核輻射和 次聲、微波、電磁武器等現(xiàn)代高新技術武器傷及生化武器造成的中毒性疾病治療。在輻射傷治療中可促進損傷修復和造血免疫重建，提高造血干細胞移植治療的療效[11]。對于常規(guī)武器導致的局部或復合傷，HUC-MSC治療可有效防治系統(tǒng)性炎癥反應和多器官功能不全并促進創(chuàng)傷修復。

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潘興華，E-mail：Xinghuapan@sohu.com.cn