體外精子發(fā)生條件研究進(jìn)展

孫雯亮，云志中，馬玉珍.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特　000；.內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院泌尿外科，內(nèi)蒙古呼和浩特　0007；.內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院生殖中心，內(nèi)蒙古呼和浩特　0007

體外精子發(fā)生條件研究進(jìn)展

孫雯亮1，云志中2，馬玉珍3
1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特010110；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院泌尿外科，內(nèi)蒙古呼和浩特010017；3.內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院生殖中心，內(nèi)蒙古呼和浩特010017

對(duì)體外精子發(fā)生進(jìn)行研究，并構(gòu)建相應(yīng)的體外誘導(dǎo)環(huán)境，實(shí)現(xiàn)在體外環(huán)境中形成具有正常功能的精子，對(duì)于男科醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有重大科研價(jià)值和實(shí)際應(yīng)用意義，同時(shí)也為生殖科學(xué)技術(shù)的發(fā)展與進(jìn)步做出貢獻(xiàn)。然而在生物體內(nèi)精子發(fā)生所需的條件十分復(fù)雜，并且至今對(duì)于精子發(fā)生的詳細(xì)機(jī)制尚不明確，從而使精子發(fā)生過(guò)程在體外條件下實(shí)現(xiàn)的難度極大。本文主要針對(duì)近年體外精子發(fā)生條件的研究進(jìn)展做一綜述。

精子發(fā)生；體外誘導(dǎo)；培養(yǎng)條件

［Abstract］It has great value in scientific study and clinical practice that we do research in spermatogenesis ex vivo，establish the induction conditions and obtain the functional sperm in vitro，which would make contribution to the improvement of reproductive science.However，the conditions needed for spermatogenesis in vivo are so complicated that the detail mechanism of spermatogenesis has not been defined to date.Consequently，it is highly difficult to achieve spermatogenesis in vitro.In this review，the current state and recent advances in the research of the conditions for spermatogenesis in vitro will be reported.

［Key words］Spermatogenesis；In vitro induction；Culture conditions

在體外培養(yǎng)環(huán)境中完成精子發(fā)生過(guò)程為保存雄性生育力以及治療雄性不育都指明了新的方向，同時(shí)也為在可控的實(shí)驗(yàn)條件下探究雄性生殖細(xì)胞的詳細(xì)分化過(guò)程提供了新的手段。距離科研人員首次嘗試探索精子發(fā)生過(guò)程并尋求建立體外精子發(fā)生的培養(yǎng)環(huán)境已有一個(gè)世紀(jì)，然而只取得了有限的進(jìn)展。本文主要針對(duì)近年體外精子發(fā)生條件的研究進(jìn)展做一綜述。

1　通過(guò)睪丸組織碎片的體外培養(yǎng)進(jìn)行體外精子發(fā)生

對(duì)于雄性生殖細(xì)胞的體外培養(yǎng)與誘導(dǎo)分化的首次嘗試發(fā)生于1915年，Goldschmidt通過(guò)對(duì)睪丸組織碎片進(jìn)行體外培養(yǎng)希望能夠在體外培養(yǎng)條件下維持完整的精子發(fā)生過(guò)程。1959年Trowell研發(fā)了一種氣-液界面器官/組織培養(yǎng)系統(tǒng)，并對(duì)成年鼠的睪丸組織進(jìn)行了培養(yǎng)，在其研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)了組織培養(yǎng)過(guò)程中的一項(xiàng)重要問(wèn)題，即組織缺氧。1964年Steinberger繼承了Trowell團(tuán)隊(duì)前期發(fā)明的氣-液界面培養(yǎng)系統(tǒng)并進(jìn)行了改進(jìn)，同時(shí)將培養(yǎng)對(duì)象改為新生幼鼠的不成熟睪丸組織。在此項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)了保證精子發(fā)生順利進(jìn)行所需的另一個(gè)關(guān)鍵條件，即睪丸微環(huán)境的調(diào)節(jié)作用，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)當(dāng)向培養(yǎng)液中加入含有維生素A、E、C的血清后精原干細(xì)胞才開(kāi)始分化為初始A型精原細(xì)胞。此研究在20世紀(jì)60年代進(jìn)展迅速，這主要?dú)w功于A.Steinberger與E.Steinberger兩位學(xué)者對(duì)器官培養(yǎng)系統(tǒng)所做的大量研究，他們選用幼鼠的不成熟睪丸組織成功地將精原細(xì)胞誘導(dǎo)分化至減數(shù)分裂粗線期。1983年P(guān)arvinen證實(shí)了Steinberger的研究中精子發(fā)生進(jìn)程停滯在減數(shù)分裂粗線期的原因是當(dāng)時(shí)的培養(yǎng)條件所限，但通過(guò)利用Steinberger的研究成果Boitani在1993年證實(shí)卵泡刺激素在A型精原細(xì)胞分化為精母細(xì)胞的過(guò)程中具有重要作用。而Steinberger的另一項(xiàng)研究開(kāi)創(chuàng)性的界定了培養(yǎng)液pH介于6.8～7.0的培養(yǎng)條件有利于睪丸組織的體外培養(yǎng)，同時(shí)進(jìn)一步嘗試將這種體外培養(yǎng)方法應(yīng)用與人類(lèi)的精子發(fā)生過(guò)程，Steinberge證實(shí)利用器官培養(yǎng)法可以將人類(lèi)的睪丸細(xì)胞在體外培養(yǎng)數(shù)周，并使精母細(xì)胞從細(xì)線期分化至粗線期。此后陸續(xù)出現(xiàn)關(guān)于體外精子發(fā)生的報(bào)道，但結(jié)果都始終無(wú)法使精母細(xì)胞的分化進(jìn)程突破粗線期，從而使此項(xiàng)研究的進(jìn)展停滯數(shù)十年。

2010年Gohbara選用出生后4.5～14.5 d的Acr-GFP幼鼠［1］和Gsg2-GFP幼鼠［2］的睪丸，將睪丸切分成組織碎片后放置到分別浸泡在添加了胎牛血清，α-MEM，DMEM，StemPro-34SFM培養(yǎng)液中的瓊脂糖凝膠塊上進(jìn)行培養(yǎng)。結(jié)果在顯微鏡下觀察到了精子細(xì)胞。

2011年Sato等［3-4］取得里程碑意義的突破，Sato團(tuán)隊(duì)首先選用出生后0.5～11.5 d的Gsg2-GFP鼠和Acr-GFP鼠睪丸組織。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)氣-液界面培養(yǎng)法，將睪丸組織碎片放置到浸泡于培養(yǎng)液中的瓊脂糖凝膠塊上，培養(yǎng)液中添加血清替代物（Knockout serum replacement，KSR），結(jié)果KSR使GFP基因的表達(dá)程度明顯增強(qiáng)，GFP基因持續(xù)表達(dá)的時(shí)間顯著延長(zhǎng)。通過(guò)對(duì)減數(shù)分裂標(biāo)志蛋白SYCP1和SYCP3的檢測(cè)證實(shí)所培養(yǎng)的組織中發(fā)生了減數(shù)分裂，利用HE染色、PAS染色以及免疫熒光染色分別在立體顯微鏡和熒光顯微鏡下對(duì)所培養(yǎng)的睪丸組織進(jìn)行組織學(xué)檢測(cè)，結(jié)果在7個(gè)受檢的組織樣本中有6個(gè)樣本中發(fā)現(xiàn)了大量精子細(xì)胞，另外11個(gè)受檢樣本中有5個(gè)樣本觀察到了生有鞭毛的精子。最后通過(guò)圓形精子細(xì)胞注射技術(shù)（round spermatid injection，ROSI）［5］和胞漿內(nèi)精子注射技術(shù)（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）［6］分別對(duì)培養(yǎng)產(chǎn)生出的精子細(xì)胞與精子進(jìn)行了生育能力的檢測(cè)，結(jié)果ROSI組產(chǎn)生出7個(gè)健康的子代鼠，ICSI組產(chǎn)生出5個(gè)健康的子代鼠。Sato團(tuán)隊(duì)選用PCXN-GFP鼠［7］、Acr-GFP鼠、Gsg2-GFP鼠和Sl/Sld鼠這4種鼠的睪丸組織用于體外培養(yǎng)精原干細(xì)胞，ICR鼠和W/W v鼠被用作宿主，這兩種鼠的睪丸組織作為宿主睪丸接受體外培養(yǎng)出的精原干細(xì)胞進(jìn)行注射移植。選用鼠胚胎成纖維細(xì)胞作為飼養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)精原干細(xì)胞，隨后將體外培養(yǎng)出的精原干細(xì)胞經(jīng)由睪丸網(wǎng)注射入宿主鼠睪丸曲細(xì)精管內(nèi)，隨后將宿主鼠睪丸取出，切分為組織碎片后放置到浸泡于培養(yǎng)液中的瓊脂糖凝膠塊上進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了精子細(xì)胞和精子。最后將培養(yǎng)出的精子細(xì)胞和精子通過(guò)微受精技術(shù)注射到卵母細(xì)胞內(nèi)，結(jié)果同樣成功產(chǎn)生出健康的后代鼠。

2013年Sato等［8］選用出生后7.5～10.5 d的Acr-GFP幼鼠和Gsg2-GFP幼鼠睪丸組織用于體外培養(yǎng)精原干細(xì)胞，W/W v鼠被用作宿主，選用JK1細(xì)胞作為飼養(yǎng)層細(xì)胞。再次運(yùn)用2011年研究中的培養(yǎng)方法，結(jié)果也成功產(chǎn)生出健康的后代鼠。

2014年Yokonishi等［9］選用雄性Gsg2-GFP鼠和Acr-GFP鼠分別同雌性ICR鼠交配產(chǎn)生子代，將出生后0.5～5 d的子代幼鼠睪丸取出，分別通過(guò)緩慢冷凍法或玻璃化冷凍法進(jìn)行冷凍后放入液氮中保存7～8 d，隨后取出解凍，解凍后將睪丸組織放置到浸泡于培養(yǎng)液中的瓊脂糖凝膠塊上進(jìn)行培養(yǎng)。結(jié)果在30例睪丸組織樣本中有17例發(fā)現(xiàn)了精子，其中7例樣本各含有超過(guò)100條精子，6例樣本各含有超過(guò)10條精子。最后利用微授精技術(shù)使培養(yǎng)出的精子細(xì)胞與精子產(chǎn)生出了8個(gè)健康后代鼠，這些后代鼠之間雌雄交配后證實(shí)這8個(gè)后代鼠都具有生育能力，并且產(chǎn)生了子代鼠。

在Sato團(tuán)隊(duì)之前的研究中開(kāi)發(fā)了一種能使不成熟的幼鼠睪丸組織完成從精原干細(xì)胞到精子形成這一完整精子發(fā)生過(guò)程的體外培養(yǎng)方法［3，4，10］，但對(duì)于這種體外培養(yǎng)方法是否也適用于成年鼠的成熟睪丸組織有待證實(shí)，于是在2015年Sato等［11］選取成年Acr-GFP鼠、Gsg2-GFP鼠、缺乏維生素A模型鼠和Sl/Sld鼠，將四種成年鼠睪丸切分為組織碎片后放置在瓊脂糖凝膠塊上，浸泡于添加KSR或AlbuMAX的α-MEM培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)。對(duì)于Sl/Sld鼠需要在培養(yǎng)液中額外添加鼠干細(xì)胞因子Kit配體和集落刺激因子-1。結(jié)果在四種成年鼠成熟睪丸組織的培養(yǎng)樣本中都發(fā)現(xiàn)了精子細(xì)胞，但產(chǎn)生出精子細(xì)胞的數(shù)目較少。從而說(shuō)明器官培養(yǎng)法能夠誘導(dǎo)成年鼠的成熟睪丸組織完成從精原干細(xì)胞到精子形成這一完整的精子發(fā)生過(guò)程，但效率低于對(duì)新生鼠不成熟睪丸組織的誘導(dǎo)效率。

2　利用細(xì)胞懸液進(jìn)行體外精子發(fā)生

將組織酶解后形成的細(xì)胞懸液進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)前現(xiàn)代化的培養(yǎng)條件可提供良好的支持，但僅僅是細(xì)胞懸液無(wú)法提供精子發(fā)生所需的微環(huán)境，理想的培養(yǎng)體系中應(yīng)具有類(lèi)似生精微環(huán)境的培養(yǎng)條件。至今未能在體外條件下實(shí)現(xiàn)由人類(lèi)的精原細(xì)胞形成成熟的精子，只有針對(duì)精子發(fā)生過(guò)程中的某一階段得以實(shí)現(xiàn)的報(bào)道。Cremades利用人的成纖維細(xì)胞作為飼養(yǎng)層將人的圓形精子細(xì)胞與成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)，結(jié)果使圓形精子細(xì)胞分化為延長(zhǎng)型精子細(xì)胞。Sousa將人的精原細(xì)胞與睪丸支持細(xì)胞在添加了卵泡刺激素和睪酮的培養(yǎng)基中共培養(yǎng)，使精原細(xì)胞進(jìn)入了減數(shù)分裂。Tanaka將人的精母細(xì)胞與成纖維細(xì)胞在添加了卵泡刺激素和睪酮的培養(yǎng)基中共培養(yǎng)，使精母細(xì)胞分化成為精子細(xì)胞。

而對(duì)于鼠類(lèi)的研究中Vigier研究表明當(dāng)精母細(xì)胞與睪丸支持細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)卵泡刺激素和睪酮會(huì)使培養(yǎng)產(chǎn)生的圓形精子細(xì)胞數(shù)量增加。Iwanami研究發(fā)現(xiàn)將幼鼠的A型精原細(xì)胞與睪丸支持細(xì)胞共培養(yǎng)后可產(chǎn)生圓形精子細(xì)胞，但所產(chǎn)生的圓形精子細(xì)胞基因型異常，通過(guò)微授精注射后沒(méi)有產(chǎn)生出后代。

3　利用三維培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行體外精子發(fā)生

隨著對(duì)器官培養(yǎng)和細(xì)胞培養(yǎng)研究的深入，科研人員發(fā)現(xiàn)睪丸細(xì)胞在培養(yǎng)環(huán)境中的空間條件對(duì)精子發(fā)生過(guò)程也可產(chǎn)生影響，由此產(chǎn)生了三維培養(yǎng)系統(tǒng)。與培養(yǎng)皿中的二維平面培養(yǎng)環(huán)境相比，三維培養(yǎng)環(huán)境更接近于睪丸內(nèi)部的立體環(huán)境。Lee JH將出生后18 d的鼠生殖細(xì)胞與支持細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞置于膠原蛋白凝膠營(yíng)造的三維培養(yǎng)環(huán)境中共培養(yǎng)，結(jié)果生殖細(xì)胞分化至減數(shù)分裂后期并且細(xì)胞的存活率良好。Stukenborg利用三維軟瓊脂培養(yǎng)環(huán)境通過(guò)添加人絨毛膜促性腺激素和卵泡刺激素使鼠的精原細(xì)胞完成了減數(shù)分裂并分化形成形態(tài)成熟的精子。Abu通過(guò)在三維軟瓊脂培養(yǎng)環(huán)境中增添胎牛血清也得到與Stukenborg相同的結(jié)果。

對(duì)于人類(lèi)的雄性生殖細(xì)胞利用三維培養(yǎng)環(huán)境進(jìn)行體外培養(yǎng)少見(jiàn)報(bào)道。Lee D.R的研究中將非梗阻性無(wú)精癥患者的生殖細(xì)胞置于藻酸鈣營(yíng)造的三維培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了表達(dá)有減數(shù)分裂后期特異性基因的單倍體生殖細(xì)胞，但該細(xì)胞未發(fā)育為成熟的精子。Lee JH將非梗阻性無(wú)精癥病人的精母細(xì)胞與體細(xì)胞放置在由膠原蛋白凝膠營(yíng)造的三維培養(yǎng)環(huán)境中共培養(yǎng)，結(jié)果產(chǎn)生出了單倍體精子細(xì)胞。

4　在微流體設(shè)備中進(jìn)行體外精子發(fā)生

由于在體內(nèi)睪丸組織周?chē)鷵碛胸S富的毛細(xì)血管，毛細(xì)血管持續(xù)高效地為睪丸組織輸送氧氣與營(yíng)養(yǎng)，同時(shí)帶走睪丸組織的代謝廢物，從而維持著睪丸內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。而本文之前所述的三種培養(yǎng)方法都缺少與毛細(xì)血管類(lèi)似的微循環(huán)系統(tǒng)，從而無(wú)法提供像體內(nèi)一樣的培養(yǎng)環(huán)境。為克服這一缺陷，研究者們將循環(huán)體系引進(jìn)他們的培養(yǎng)系統(tǒng)中，尤其是Rose團(tuán)隊(duì)研發(fā)了名為環(huán)繞灌注系統(tǒng)的培養(yǎng)體系，在此培養(yǎng)系統(tǒng)中循環(huán)流動(dòng)的培養(yǎng)液快速地從覆蓋著透析膜的培養(yǎng)組織表面流過(guò)，在此培養(yǎng)系統(tǒng)中多種器官在幾個(gè)月的培養(yǎng)過(guò)程中始終都保持著組織學(xué)特征。但是對(duì)于在此培養(yǎng)系統(tǒng)中所培養(yǎng)的器官組織的功能沒(méi)有進(jìn)行檢驗(yàn)與評(píng)估。

2016年Komeya等［12］設(shè)計(jì)了一種微流體設(shè)備，利用多孔膜將睪丸組織與持續(xù)流動(dòng)的培養(yǎng)液分隔開(kāi)，以此模擬體內(nèi)微血管中的血流與微血管周?chē)M織之間的關(guān)系。在這個(gè)微流體設(shè)備中將出生后0.5～5.5 d的Acr-GFP幼鼠的睪丸組織中的精子發(fā)生過(guò)程維持了6個(gè)月，此過(guò)程中產(chǎn)生出的精子細(xì)胞和精子通過(guò)ROSI和ICSI產(chǎn)生出了健康的后代鼠。同時(shí)在利用此微流體設(shè)備對(duì)睪丸組織進(jìn)行培養(yǎng)的過(guò)程中睪丸組織持續(xù)產(chǎn)生出睪酮，并對(duì)黃體生成素的刺激作出響應(yīng)，產(chǎn)生睪酮的能力為每克睪丸組織每日產(chǎn)生睪酮2.4～24.0 μg，這一結(jié)果接近于處于體內(nèi)環(huán)境中的睪丸。

這些結(jié)果表明這種微流體設(shè)備成功的營(yíng)造出類(lèi)似于體內(nèi)的環(huán)境，使睪丸組織保持了生理功能和內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，因此這種微流體設(shè)備為未來(lái)多種組織和器官培養(yǎng)條件的改善提供了有價(jià)值的基礎(chǔ)，并且可能使器官培養(yǎng)方法發(fā)生巨大變革。

5　結(jié)語(yǔ)

對(duì)于體外精子發(fā)生的研究至今仍處在有限的實(shí)驗(yàn)階段，對(duì)于體外精子發(fā)生尚存有眾多未被解決的問(wèn)題：對(duì)于精子發(fā)生的詳細(xì)機(jī)制還沒(méi)有明確；在當(dāng)前的體外誘導(dǎo)條件下精子的產(chǎn)生效率還很低；體外培養(yǎng)所獲得的精子生物學(xué)活性不高。這些問(wèn)題都為未來(lái)體外精子發(fā)生的研究指明了方向。希望隨著對(duì)體外精子發(fā)生研究的不斷深入，研究成果能早日應(yīng)用于臨床，從而為輔助生殖提供新的選擇。

［1］Li R，Vannitamby A，Zhang J G，et al.Oct4-GFP expression during transformation of gonocytes into spermatogonial stem cells in the perinatal mouse testis［J］.J Pediatr Surg，2015，50（12）：2084-2089.

［2］Smiley S，Nickerson P E，Comanita L，et al.Establishment of a cone photoreceptor transplantation platform based on a novel cone-GFP reporter mouse line［J］.Sci Rep，2016 （6）：22867.

［3］Sato T，Katagiri K，Gohbara A，et al.In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes［J］. Nature，2011，471（7339）：504-507.

［4］Sato T，Katagiri K，Yokonishi T，et al.In vitro production of fertile sperm from murine spermatogonial stem cell lines［J］.Nat Commun，2011（2）：472.

［5］Moreira P，Perez-Cerezales S，Laguna R，et al.Transgenic mouse offspring generated by ROSI［J］.J Reprod Dev，2016，62（1）：37-42.

［6］Moreira P N，Montoliu L.Intracytoplasmic sperm injection （ICSI）-mediated transgenesis in mice［J］.Methods Mol Biol，2014（1194）：141-156.

［7］Muthusamy N，Vijayakumar A，Cheng G J，et al.A knock-in Foxj1（CreERT2：：GFP）mouse for recombination in epithelial cells with motile cilia［J］.Genesis，2014，52（4）：350-358.

［8］Sato T，Katagiri K，Kubota Y，et al.In vitro sperm production from mouse spermatogonial stem cell lines using an organ culture method［J］.Nat Protoc，2013，8（11）：2098-2104.

［9］Yokonishi T，Sato T，Komeya M，et al.Offspring production with sperm grown in vitro from cryopreserved testis tissues［J］.Nat Commun，2014（5）：4320.

［10］Yokonishi T，Sato T，Katagiri K，et al.In vitro spermatogenesis using an organ culture technique［J］.Methods Mol Biol，2013（927）：479-488.

［11］Sato T，Katagiri K，Kojima K，et al.In Vitro Spermatogenesis in Explanted Adult Mouse Testis Tissues［J］.PLoS One，2015，10（6）：e130171.

［12］Komeya M，Kimura H，Nakamura H，et al.Long-term ex vivo maintenance of testis tissues producing fertile sperm in a microfluidic device［J］.Sci Rep，2016，6：21472.

Advances in the Study of the Conditions for Spermatogenesis in Vitro

SUN Wen-liang1，YUN Zhi-zhong2，MA Yu-zhen3
1.Inner Mongolia Medical University，Hohhot，Inner Mongolia，010110 China；2.Department of Urology，Inner Mongolia People’s Hospital，Hohhot，Inner Mongolia，010017 China；3.Center of Reproduction，Inner Mongolia People’s Hospital，Hohhot，Inner Mongolia，010017 China

R69

A

2096-1782（2016）07-0156-04

10.19368/j.cnki.2096-1782.2016.07.156

孫雯亮（1990.2-），男，黑龍江伊春人，碩士在讀，研究方向：泌尿系統(tǒng)疾病及男科疾病。

云志中（1963.9-），男，蒙古族，內(nèi)蒙古呼和浩特人，本科，主任醫(yī)師，研究方向：泌尿系統(tǒng)疾病及男科疾病，E-mail：yzzyb168@126.com。