黃河三角洲蘆葦根際氨氧化微生物的空間分布

宋延靜，馬蘭，李萌，付嬈，聶文靖，李俊林，王向譽(yù)，郭洪恩

（山東省蠶業(yè)研究所，山東煙臺(tái) 264002）

黃河三角洲由于瀕臨渤海土壤鹽漬化嚴(yán)重，存在土壤結(jié)構(gòu)性差、肥力低等問(wèn)題，但開(kāi)發(fā)利用潛力巨大。鹽生植物是唯一能夠在此環(huán)境下正常生長(zhǎng)的植物，蘆葦是常見(jiàn)的鹽生植物之一。在對(duì)黃河三角洲開(kāi)發(fā)利用過(guò)程中，氮素的施入不可避免。氨氧化過(guò)程是硝化作用的第一個(gè)反應(yīng)步驟，也是限速步驟，是全球氮循環(huán)的中心環(huán)節(jié)。氨氧化過(guò)程由氨氧化古菌（AOA）和氨氧化細(xì)菌（AOB）兩類微生物共同完成［1］，二者應(yīng)對(duì)各種環(huán)境變化的響應(yīng)不同，因此也被認(rèn)作環(huán)境變化的潛在指示。結(jié)合全球變化背景，揭示微生物驅(qū)動(dòng)的氮循環(huán)過(guò)程尤其是植物根際微生物，對(duì)評(píng)價(jià)與預(yù)測(cè)河口濕地生態(tài)系統(tǒng)服務(wù)功能變化、管理決策等至關(guān)重要。

根際是土壤、植物、微生物三者相互作用、相互制約的界面和物質(zhì)轉(zhuǎn)化的活躍區(qū)域［2］。滕澤棟等［3］對(duì)野鴨湖濕地蘆葦根際微生物多樣性進(jìn)行調(diào)查發(fā)現(xiàn)了磷素轉(zhuǎn)化相關(guān)的微生物，但國(guó)內(nèi)外有關(guān)蘆葦根際微生物的研究主要集中于16S基礎(chǔ)之上的研究［4，5］，而對(duì)根際功能微生物研究較少，尤其是氮循環(huán)相關(guān)功能微生物［6］。隨著微生物生物地理學(xué)的發(fā)展，距離-衰減關(guān)系被發(fā)現(xiàn)也廣泛適用于微生物群落，空間距離越遠(yuǎn)的兩個(gè)樣點(diǎn)，其生物群落組成相似度也越低［7-9］。目前有關(guān)黃河三角洲地區(qū)不同空間尺度下的植物根際微生物研究也不多見(jiàn)。

本研究首次結(jié)合熒光定量PCR技術(shù)與高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)黃河三角洲不同區(qū)域（濱州、東營(yíng)、昌邑、壽光）蘆葦根際氨氧化微生物（包括AOA和AOB）的豐度、多樣性和群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較，研究結(jié)果將對(duì)濕地生態(tài)環(huán)境的合理開(kāi)發(fā)利用及保護(hù)提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域概況

黃河三角洲是黃河入?？谔幮纬傻臎_積平原，屬于溫帶季風(fēng)型大陸性氣候，全年平均氣溫12.3℃，降水量 542.3～842.0 mm，其中約75.5%的降水集中于 6—9月，年蒸發(fā)量 1 885.0 mm。該地區(qū)土壤以濱海鹽土為主，土壤含鹽量高［10］。土壤鹽分主要為海水氯化物和硫酸鹽類。大部分面積的土壤屬于鹽漬化土壤的范疇，且鹽漬化程度高，此外，土壤養(yǎng)分匱乏，有機(jī)質(zhì)含量很低，土壤黏重板結(jié)［11，12］。

1.2 樣品采集

選擇黃河三角洲的昌邑、壽光、濱州、東營(yíng)4個(gè)采樣點(diǎn)進(jìn)行蘆葦資源的調(diào)查及根際和根周土的收集（抖根法）。采集后的土壤樣品存于冰盒（4℃）并立即轉(zhuǎn)移到實(shí)驗(yàn)室，用于提取DNA的樣品立即放置到-80℃冷凍，用于測(cè)定環(huán)境因子的樣品于-20℃冷凍保存。

1.3 土壤理化性質(zhì)測(cè)定

土壤樣品利用0.01 mol／L氯化鈣溶液浸提后進(jìn)行pH值和含鹽量測(cè)定。土樣經(jīng)冷凍干燥后，取 2.5 g，加入 2 mol／L的 KCl 25 mL，振蕩 1 h，過(guò)濾備用，采用連續(xù)流動(dòng)分析儀（AutoAnalyzerⅢ）測(cè)定銨態(tài)氮、硝態(tài)氮、亞硝態(tài)氮含量。利用元素分析儀（vario MICRO CUBE）進(jìn)行土壤總氮含量的測(cè)定。利用原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定土壤中Na＋、K＋含量。

1.4 土壤DNA的提取和高通量測(cè)序

按照Fast DNA?SPIN Kit for Soil試劑盒說(shuō)明步驟提取DNA，用分光光度計(jì)（NanoDrop 2000c）測(cè)定DNA的濃度及純度。利用AOB-amoA特異性引物 amoA1F／amoA2R［13］和 AOA-amoA特異性引物 arch-amoA-for／arch-amoA-rev［14］分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后利用Illumina PE250測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序（上海凌恩生物有限公司）。

1.5 熒光定量 PCR

AOA和AOB的絕對(duì)豐度采用TB Green熒光定量PCR法獲得，在BioRad CFX96平臺(tái)上進(jìn)行。稀釋相應(yīng)質(zhì)粒至10-1到10-8，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。每個(gè)樣品設(shè)3次重復(fù)，并設(shè)不加模板的反應(yīng)管為陰性對(duì)照。

1.6 高通量數(shù)據(jù)分析

高通量數(shù)據(jù)分析基于Linux平臺(tái)的QIIME 1.9.0流程，參考數(shù)據(jù)庫(kù)為 FGR（version 7.3）。具體流程如下：過(guò)濾read尾部質(zhì)量值20以下的堿基和質(zhì)控后50 bp以下的read；篩除錯(cuò)配比率大于0.2的拼接序列；用USEARCH軟件和GOLD數(shù)據(jù)庫(kù)，采用denovo和reference結(jié)合的方式去除嵌合體，并選取97%的序列相似度作為閾值（cut off）劃分OTU；采用 RDP classifier貝葉斯算法對(duì)97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析。

1.7 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 20統(tǒng)計(jì)軟件中的單因素方差分析（ANOVA）檢驗(yàn)不同采樣點(diǎn)蘆葦根際土中amoA基因和arch-amoA基因拷貝數(shù)的差異顯著性；利用mothur計(jì)算不同地域蘆葦根際氨氧化微生物類群的α多樣性指數(shù)；利用R語(yǔ)言的vegan包進(jìn)行基于Weighted UniFrac距離矩陣的聚類樹(shù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤環(huán)境因子分析

由表1可見(jiàn)，4個(gè)采樣點(diǎn)的土壤 pH值為7.18～7.58，濱州和東營(yíng)兩點(diǎn)的 pH值顯著高于壽光和昌邑。東營(yíng)和濱州兩點(diǎn)土壤質(zhì)地為黏土，含鹽量較高，均在5‰以上，尤其東營(yíng)采樣點(diǎn)達(dá)到11.22‰；昌邑和壽光采樣點(diǎn)的土壤為砂質(zhì)土，含鹽量低，不足 1‰。黃河三角洲土壤總氮在0.018%～0.050%之間，東營(yíng)和濱州采樣點(diǎn)的總氮、總碳含量以及含水量均顯著高于壽光、昌邑。蘆葦覆蓋下的土壤氮以硝態(tài)氮為主，含量在2.44～8.13 mg／kg之間；東營(yíng)采樣點(diǎn)的銨態(tài)氮含量也較高。壽光、東營(yíng)、濱州土樣的Na＋含量高于K＋，尤其東營(yíng)、濱州兩點(diǎn)的Na＋含量明顯高于壽光、昌邑。

表1 土壤環(huán)境因子

2.2 基于amoA基因熒光定量PCR的AOA和AOB豐度比較

定量PCR結(jié)果（圖1）顯示，來(lái)源于黃河三角洲4點(diǎn)的蘆葦根部土壤中氨氧化微生物均以AOA占主導(dǎo)，AOA的拷貝數(shù)比AOB要高出1～2個(gè)數(shù)量級(jí)。

對(duì)于AOA，蘆葦根際土中arch-amoA基因拷貝數(shù)以東營(yíng)最高，平均值為1.61×108copies／g；其次為濱州，平均值為 1.06×108copies／g；昌邑較低，為7.56×107copies／g；壽光最低，僅為5.77×106copies／g。蘆葦根周土中的arch-amoA豐度要顯著低于根際土，仍以東營(yíng)的arch-amoA拷貝數(shù)最高，為1.14×107copies／g，昌邑、壽光、濱州 3點(diǎn)的蘆葦根周土中arch-amoA拷貝數(shù)差異不顯著，以昌邑的最低。

對(duì)于AOB，除昌邑外，壽光、東營(yíng)、濱州三點(diǎn)的蘆葦根周土中amoA拷貝數(shù)都高于根際土，東營(yíng)的蘆葦根周土中amoA拷貝數(shù)最高，為6.70×107copies／g；濱州的蘆葦根際土中amoA拷貝數(shù)最低，僅 9.11×104copies／g。

圖1 黃河三角洲不同地區(qū)間蘆葦根際AOA和AOB amoA基因豐度的比較

2.3 黃河三角洲不同地區(qū)蘆葦根際 AOA和AOB的α多樣性

對(duì)于AOA，通過(guò)質(zhì)控共獲得170 812條高質(zhì)量的arch-amoA基因序列，劃分為342個(gè)OTU，每個(gè)采樣點(diǎn)蘆葦根際AOA的OTU數(shù)量平均在100～150之間。從表2的Chao1數(shù)據(jù)可知，各樣本的AOA豐富度排序?yàn)闁|營(yíng)（DY）＞濱州（BZ）＞昌邑（CY）＞壽光（SG）；從Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)來(lái)看，各站點(diǎn)AOA多樣性從高到低依次是壽光（SG）＞濱州（BZ）＞東營(yíng)（DY）＞昌邑（CY）。

對(duì)于AOB，通過(guò)質(zhì)控共獲得172 001條高質(zhì)量的amoA基因序列，劃分為443個(gè)OTU，每個(gè)采樣點(diǎn)蘆葦根際AOB的OTU數(shù)量平均在23～171之間。從表2的Chao1數(shù)據(jù)得知，AOB的豐富度昌邑最高；從Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)來(lái)看，AOB的多樣性總體表現(xiàn)為昌邑（CY）＞濱州（BZ）＞壽光（SG）＞東營(yíng)（DY）。

表2 不同采樣點(diǎn)蘆葦根際氨氧化微生物（AOA和AOB）α多樣性指數(shù)

2.4 黃河三角洲蘆葦根際AOA和AOB群落組成分析

從圖2可以看出，從屬的水平來(lái)看，奇古菌門(mén)（Thaumarchaeota）的亞硝化球菌（Nitrososphaera）是昌邑和壽光兩地蘆葦根際土中參與氨氧化過(guò)程的主要AOA類群（＞99%）；對(duì)于濱州和東營(yíng)，蘆葦根際中的AOA類群主要為Nitrosopumilus，其次為Nitrosoarchaeum古菌類群。

昌邑和壽光兩地蘆葦根際土中參與氨氧化過(guò)程的主要 AOB類群為亞硝化弧菌屬（Nitrosovibrio）和亞硝化螺菌屬（Nitrosospira）；東營(yíng)蘆葦根際中的AOB類群較為單一，幾乎全為亞硝化螺菌屬（Nitrosospira）；濱州蘆葦根際中除亞硝化螺菌屬（Nitrosospira，86.0%）外，亞硝化單胞菌（Nitrosomonas）也占了12.7%，該菌在其它三地蘆葦根際含量較低。

圖2 黃河三角洲不同地區(qū)蘆葦根際固氮菌群落結(jié)構(gòu)（屬級(jí)別）

2.5 黃河三角洲蘆葦根際AOA和AOB的Beta多樣性分析

基于Weighted UniFrac距離矩陣計(jì)算黃河三角洲不同地區(qū)蘆葦根際AOA和AOB的Beta多樣性，結(jié)果（圖3）表明，不論是AOA還是AOB，東營(yíng)和濱州蘆葦根際氨氧化群落組成以及結(jié)構(gòu)差異較小，壽光和昌邑蘆葦根際氨氧化群落結(jié)構(gòu)較小。

圖3 基于UniFrac距離矩陣的蘆葦根際AOA和AOB聚類樹(shù)分析

3 討論與結(jié)論

黃河三角洲屬于典型的河口濕地生態(tài)系統(tǒng)，生態(tài)環(huán)境脆弱，生物多樣性低。蘆葦是黃河三角洲地區(qū)鹽生植被的主要建群物種，占土壤面積的5.38%［15］，主要生長(zhǎng)在河口濕洼地和濱海沼澤地等地勢(shì)低洼的地區(qū)，群落生境一般有積水，土壤含鹽量變化較大［16，17］。

3.1 黃河三角洲蘆葦根際AOA和AOB的豐度特征

本研究發(fā)現(xiàn)黃河三角洲濕地昌邑、壽光、東營(yíng)、濱州四地的蘆葦根用土氨氧化微生物均以AOA為主，這與國(guó)內(nèi)外大多數(shù)河口環(huán)境的研究結(jié)果相一致［18，19］。有限的氮底物則可能是氨氧化微生物生長(zhǎng)的限制因素，AOA在肥力低的環(huán)境中貢獻(xiàn)較大，主要是因?yàn)锳OA對(duì)底物氨的親和力遠(yuǎn)高于AOB［20］，因此在低肥力土壤中更具競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)。當(dāng)然，也有例外，在Douro河口和Cochin河口，AOB的豐度顯著高于 AOA［21，22］，同樣我們?cè)诓夭蓸狱c(diǎn)得到的蘆葦根周土氨氧化微生物群落中也是AOB豐度較高，分析造成這種特殊現(xiàn)象的原因可能與鹽度有關(guān)。鹽度是解釋AOA群落結(jié)構(gòu)模式的主要因素，中等鹽濃度更適宜AOA的生長(zhǎng)。一般鹽漬化土壤偏堿性，養(yǎng)分含量低，不利于土壤微生物的生長(zhǎng)和繁殖［23-25］。本研究還發(fā)現(xiàn)，黃河三角洲4個(gè)采樣點(diǎn)中的AOA和AOB屬東營(yíng)蘆葦根際最豐富，分析可能與東營(yíng)較高的總碳、氮含量有關(guān)，因?yàn)橛醒芯勘砻骺偟怯绊懲寥乐蠥OA和 AOB群落結(jié)構(gòu)的潛在環(huán)境因素［26］。

3.2 蘆葦根際AOA和AOB在黃河三角洲不同地區(qū)的空間分布特征

本研究發(fā)現(xiàn)黃河三角洲4個(gè)不同地區(qū)蘆葦根際的AOA幾乎全部來(lái)源于奇古菌門(mén)（Thaumarchaeota），只是不同地區(qū)的所屬種類不同，濱州、東營(yíng)兩地的AOA要比壽光、昌邑的多樣性要高。其中昌邑和壽光兩地蘆葦根際AOA優(yōu)勢(shì)類群為亞硝化球菌（Nitrososphaera），濱州和東營(yíng)的蘆葦根際AOA優(yōu)勢(shì)類群為 Nitrosopumilus、Nitrosoarchaeum、Candidatus Nitrosotenuis。前人研究已證明Nitrosopumilus是海洋 AOA的主要優(yōu)勢(shì)種群，Nitrososphaera是土壤AOA的主要優(yōu)勢(shì)種群［27-29］，我們分析是東營(yíng)和濱州高鹽度的生長(zhǎng)環(huán)境選擇了蘆葦根際Nitrosopumilus這一微生物類群。

東營(yíng)和濱州兩地蘆葦根際AOB的優(yōu)勢(shì)類群是亞硝化螺菌屬（Nitrosospira）。Nitrosospira屬于β變形菌門(mén)的一類化能自養(yǎng)氨氧化微生物，更容易出現(xiàn)在低銨的環(huán)境中，即貧瘠的土壤環(huán)境可能適宜 Nitrosospira的生長(zhǎng)［31，32］。Kowalchuk等也發(fā)現(xiàn)Nitrosospira是弱堿性土壤中發(fā)揮氨氧化作用的最主要微生物。亞硝化弧菌屬（Nitrosovibrio）和亞硝化螺菌屬（Nitrosospira）是昌邑和壽光蘆葦根際AOB的優(yōu)勢(shì)類群，Nitrosovibrio也是一種嚴(yán)格好氧的化能自養(yǎng)氨氧化微生物。戴九蘭和苗永君在對(duì)黃河三角洲不同鹽堿農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)氮循環(huán)功能菌群研究中也發(fā)現(xiàn)，在小麥-玉米輪作和大豆種植體系土壤中，AOB中Nitrosospira和Nitrosovibrio主導(dǎo)著氨氧化過(guò)程［33］。

本研究還發(fā)現(xiàn)距離較近的壽光、昌邑兩地的蘆葦根際AOA和AOB群落結(jié)構(gòu)類似，濱州和東營(yíng)兩地的AOA和AOB群落結(jié)構(gòu)類似。這在一定程度上驗(yàn)證了微生物的距離-衰減關(guān)系［7］，具體和哪種環(huán)境因子相關(guān)還需要進(jìn)行更深入的分析探討。