與RABV感染相關表觀遺傳修飾酶的篩選

趙銘昕，趙維榮，徐婧，郭藝迪，張茂林

（1.吉林大學人獸共患病研究所／人獸共患病研究教育部重點實驗室，吉林 長春 130062；2.吉林大學動物醫(yī)學學院，吉林長春 130062）

狂犬病是由狂犬病病毒（rabies virus，RABV）感染引起的一種嗜神經性的人獸共患傳染病，致死率100%［1］。在RABV感染中，不同毒株引發(fā)的臨床表現(xiàn)差異很大，引起了研究者的廣泛關注［2］。表觀遺傳學調節(jié)機制主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾和非編碼RNA作用等。DNA甲基化是目前研究最深入的表觀遺傳修飾方式，涉及的 DNA甲基轉移酶主要有 DNMT1、DNMT3a、DNMT3b和DNMT3L。組蛋白表觀遺傳修飾包括甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化等，修飾過程動態(tài)可逆，主要有組蛋白甲基轉移酶、組蛋白乙酰轉移酶、組蛋白激酶和組蛋白泛素化酶等參與，催化修飾基團結合到組蛋白的氨基殘基。相應地，組蛋白去甲基化酶、組蛋白脫乙?；?、組蛋白磷酸酶和組蛋白去泛素化酶可去除結合在組蛋白端氨基殘基上的分子基團。非編碼RNA最終使基因沉默從而調控基因表達［3-5］。

通常病毒感染會影響宿主細胞部分正常生理功能，本質上就是宿主基因表達的修飾，因此病毒自身或引起表觀遺傳學的變化已成為近年來的研究熱點［6］。已有研究發(fā)現(xiàn)，表觀遺傳修飾酶參與調控多種病毒感染，例如，位于病毒長末端重復序列（LTR）上的組蛋白的去乙?；图谆饔?，使?jié)摲腍IV前病毒被沉默［7］；乙肝病毒的轉錄和復制過程依賴于病毒HBx蛋白與 LSD1和Set1A的協(xié)同作用［8］；流感病毒NP蛋白在真核細胞中通過乙酰化修飾，調控病毒顆粒的成熟和釋放［9］。已有研究發(fā)現(xiàn)，RABV街毒與固定毒株在體內感染的細胞類型不同，而且前者引起病毒基因的轉錄水平也遠遠低于后者，并將此歸結為前者逃避機體免疫的機制［2］。對RABV病毒基因組表觀遺傳學特征進行研究，有利于揭示不同病毒株在同類感染介質中轉錄和復制水平的變化，有關RABV的同類研究也在進行中［10］。鑒于目前RABV感染的表觀遺傳機制尚不清楚，本試驗通過對小鼠神經母細胞瘤（N2a）感染實驗室標準攻擊毒株CVS-11，并在感染后不同時間點檢測多種類型表觀遺傳修飾酶基因表達水平變化情況，篩選參與調控RABV感染的表觀遺傳修飾酶，以期為不同RABV毒株的可行性研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 細胞和毒株

BHK細胞和N2a細胞，均由本實驗室保存；實驗室標準攻擊毒株CVS-11，由長春獸醫(yī)研究所OIE狂犬病參考實驗室涂長春研究員惠贈。

1.2 主要試劑

細胞培養(yǎng)基DMEM，購自Corning公司；胎牛血清FBS，購自Biological Industries公司；Trizol試劑，購自TaKaRa公司；反轉錄試劑，購自Bioteke；熒光定量試劑FastStart Universal SYBR Green Master，購自 Roche。

1.3 病毒的培養(yǎng)

將BHK細胞接種在T25細胞培養(yǎng)瓶中，待細胞密度達到70%時，將CVS-11以MOI＝1接種于細胞瓶中，37℃下感作1 h后，加含1%FBS的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)96 h。-80℃反復凍融細胞及培養(yǎng)基3次，收取混合液，將混合液4℃、1 000 r／min離心10 min，收取上清培養(yǎng)基，分裝保存于-80℃。

1.4 病毒的感染及增殖曲線

在六孔細胞培養(yǎng)板中接種適宜密度的N2a細胞，37℃過夜培養(yǎng)后棄掉上清液，將CVS-11按照病毒量MOI＝1接種于細胞，以接種與病毒等體積的磷酸鹽緩沖液（PBS）為對照。37℃感作1 h，并在感染后 0、3、12、24、48 h提取細胞總RNA，對RABV N基因和相關表觀遺傳修飾酶基因進行定量檢測。

1.5 實時熒光定量PCR

采用FastStart Universal SYBR Green Master染料進行分析。試驗所用RABV N基因，DNA甲基化轉移酶 DNMT1、DNMT3a、DNMT3b，組蛋白去乙酰化酶 HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC5、HDAC6，組蛋白甲基轉移酶 EZH2、MLL1、SETDB1、SUV39H1和組蛋白去甲基化酶 KDM6B、PHF8、LSD1以及內參GAPDH基因擴增引物見表1。

反應體系（25μL）：上、下游引物各1μL，模板 cDNA 5μL，SYBR Green 12.5μL，ddH2O 5.5 μL，將配好的體系加入96孔板中。反應程序：95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，40個循環(huán)。得到Ct值進行統(tǒng)計分析。

1.6 數據統(tǒng)計與分析

數據分析使用GraphPad Prism 5軟件，統(tǒng)計方法為t檢驗。P＜0.05有差異（*），P＜0.01有顯著差異（**），P＜0.001有極顯著差異（***）。

表1 擴增表觀遺傳修飾酶基因、RABV N基因與內參GAPDH的引物序列

2 結果與分析

2.1 N2a細胞上的RABV增殖曲線

為了明確RABV在N2a細胞上的增殖曲線，將不同時間點收集并提取的細胞總RNA反轉錄進行熒光定量檢測。結果表明，RABV感染量隨時間的推移而增加，并在感染48 h達到最大值（圖1）。

圖1 N2a細胞上的RABV N基因增殖曲線

2.2 與RABV感染相關的DNA甲基化轉移酶篩選

對參與甲基化的主要DNA甲基化轉移酶進行檢測發(fā)現(xiàn)，N2a感染 RABV后，DNMT1、DNMT3a基因表達水平雖然有變化，但與對照組（ctrl）相比無統(tǒng)計學差異（圖2 A、B）。DNMT3b基因表達水平在病毒感染12 h后極顯著下調（圖2 C）。以上結果表明，RABV感染抑制DNA甲基化轉移酶DNMT3b基因的表達。

圖2 與RABV感染相關的DNA甲基化轉移酶基因的表達量

2.3 RABV感染相關的組蛋白去乙?；负Y選

對參與RABV感染相關的組蛋白去乙?；高M行檢測發(fā)現(xiàn)，HDAC2、HDAC5基因表達水平與對照組相比無統(tǒng)計學差異（圖3 B、D）；HDAC1基因表達水平24 h開始極顯著下降，下降約50%（圖3 A）；HDAC3基因表達水平下調不明顯（圖3 C）；HDAC6基因表達水平在感染RABV后各時間點與對照組相比均極顯著下降，在感染24 h后表達水平下降50%以上（圖3 E）。以上結果表明，RABV感染抑制組蛋白去乙酰化酶 HDAC1、HDAC3、HDAC6基因的表達，且對HDAC6基因表達水平抑制最為顯著。

圖3 與RABV感染相關的組蛋白去乙?；富虻谋磉_量

2.4 與RABV感染相關的組蛋白甲基轉移酶、去甲基化酶篩選

N2a感染 RABV后，組蛋白去甲基化酶KDM6B、LSD1基因表達水平與對照組相比無統(tǒng)計學差異（圖4 A、C）；PHF8在3、12、24、48 h的表達水平約下調至對照組的60%以下，差異極顯著（圖4 B）。

組蛋白甲基轉移酶MLL1基因表達水平在感染12 h后呈上升趨勢，但與對照組相比無統(tǒng)計學差異（圖4 E）；EZH2基因表達水平在感染后出現(xiàn)降低趨勢，48 h后約降低至對照組的60%（圖4 D）；SETDB1基因表達水平在病毒感染12 h后顯著下調，并在感染24 h后下降極顯著，只占對照組的14%左右（圖4 F）；SUV39H1基因表達水平在病毒感染3 h后極顯著降低，48 h后約降低至對照組的30%（圖4 G）。

以上結果表明，RABV感染顯著下調組蛋白去甲基化酶PHF8和組蛋白甲基轉移酶SUV39H1基因的表達，而組蛋白甲基轉移酶SETDB1基因表達在RABV感染晚期被顯著抑制。

圖4 與RABV感染相關的組蛋白甲基轉移酶、去甲基化酶基因的表達量

3 討論與結論

本研究通過對小鼠神經母細胞瘤（N2a）接種CVS-11，探討表觀遺傳修飾系統(tǒng)在該毒株感染神經細胞中的作用，從中篩選出與RABV感染相關且變化顯著的表觀遺傳修飾酶，以期從表觀遺傳修飾水平解析RABV引起臨床表現(xiàn)的致病機制。

已有研究表明，HIV直接感染調節(jié)性T細胞（regulatory T cells，Tregs），誘導 DNMT3b的表達增加，造成轉錄因子Foxp3高度甲基化，破壞宿主Tregs的免疫調節(jié)功能［11］。本研究發(fā)現(xiàn)，甲基化轉移酶DNMT3b在RABV感染12 h后表達水平降低，說明RABV可能通過調節(jié)DNMT3b表達水平影響靶基因DNA甲基化以利于RABV感染細胞，具體機制仍有待研究。甲型流感病毒NP蛋白的超乙?；鸵阴；笔Ь绊懠仔土鞲胁《镜膹椭疲?］。過表達HDAC6可導致乙?；⒐艿鞍诇p少及病毒 -細胞融合減少［12］。本研究中，HDAC6表達水平在RABV感染0 h與對照組相比呈現(xiàn)極顯著降低的趨勢，HDAC6可能通過乙?；⒐艿鞍渍{節(jié)微管穩(wěn)定性進而影響病毒侵入、胞內運輸、復制、出芽等感染過程。組蛋白甲基化修飾是動態(tài)可逆的，組蛋白甲基轉移酶和組蛋白去甲基化酶在病毒感染過程中可以協(xié)同發(fā)揮調節(jié)作用，例如HPV的E6蛋白可以和組蛋白甲基轉移酶相互作用并通過降低酶活性使抑癌基因P53轉錄水平降低，E7蛋白能夠催化組蛋白去甲基酶聚集到TLR9啟動子區(qū)域最終降低TLR9的功能［13，14］。本研究發(fā)現(xiàn)，RABV感染影響了組蛋白去甲基化酶PHF8和組蛋白甲基轉移酶EZH2、SETDB1、SUV39H1基因表達水平，說明在RABV感染過程中，組蛋白甲基化酶和組蛋白去甲基化酶可能協(xié)同調控下游靶基因的表達。

在病毒感染過程中，可能存在多種機制利用表觀遺傳系統(tǒng)調節(jié)生命周期中的生物活性。本研究僅針對RABV感染中的表觀遺傳修飾酶進行初步篩選，所調控的下游靶基因及具體調控機制還有待進一步研究。