klotho在慢性腎臟病分期及其并發(fā)繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進癥中的作用

林書典，詹 鋒，武 偉，潘楚瑛，張 延，劉 穎，詹宇威

·論著·

klotho在慢性腎臟病分期及其并發(fā)繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進癥中的作用

林書典，詹 鋒，武 偉，潘楚瑛，張 延，劉 穎，詹宇威

【摘要】目的初步探討klotho在慢性腎臟病(CKD)分期及其并發(fā)繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進癥(SHPT)中的作用。方法選取2012—2014年在海南省人民醫(yī)院腎病風濕科門診或住院的符合納入與排除標準的CKD患者85例為研究對象。根據CKD分期標準，將患者分為CKD1～2組(26例)、CKD3～4組(34例)和CKD5組(25例)。CKD 3～5期的患者根據甲狀旁腺素(PTH)水平分為非SHPT組(n-SHPT組，PTH≤120 ng/L，26例)和SHPT組(PTH>120 ng/L，33例)。收集患者的基本資料(性別、年齡、體質量、血壓)，檢測其常規(guī)血清學指標〔血紅蛋白(Hb)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)、清蛋白(ALB)、尿素氮(BUN)及血肌酐(Scr)、鈣、磷、堿性磷酸酶(ALP)、腎小球濾過率(GFR)、PTH〕和可溶型klotho(s-kl)、25-羥基維生素D(25-OH-D)、成纖維細胞生長因子23(FGF-23)水平。結果CKD3～4組、CKD5組平均動脈壓(MAP)、Hb、BUN、Scr、鈣、磷、ALP、PTH與CKD1～2組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；CKD5組ALT與CKD1～2組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；CKD5組Hb、ALT、AST、BUN、Scr、鈣、磷、ALP、PTH與CKD3～4組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。CKD3～4組、CKD5組s-kl、25-OH-D、FGF-23水平與CKD1～2組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；CKD5組s-kl、25-OH-D、FGF-23水平與CKD3～4組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。n-SHPT組、SHPT組ALB、BUN、Scr、鈣、磷、ALP、GFR、s-kl、25-OH-D水平比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。s-kl與鈣、GFR、25-OH-D呈正相關，與磷、ALP、PTH呈負相關(P<0.05)；s-kl與FGF-23無直線相關關系(P>0.05)。PTH水平影響因素的直線回歸分析結果顯示，鈣進入回歸方程，回歸方程為y=334.20-92.02x(P<0.05)。結論klotho水平隨著CKD進展逐漸下降，其在CKD及其合并SHPT患者中降低可能是促進CKD進展和鈣代謝失調，進而導致SHPT發(fā)生并加重的原因之一。

繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進癥(secondary hyperparathyroidism，SHPT)是慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)常見并發(fā)癥，也是影響終末期腎病(end-stage renal disease，ESRD)患者預后的重要因素。目前已經證實，甲狀旁腺是klotho基因表達的重要器官之一[1]。研究發(fā)現，CKD患者體內鈣磷失衡、維生素D缺乏、骨質疏松以及繼之而來的SHPT均與klotho表達水平降低和成纖維細胞生長因子23(fibroblast growth factors-23，FGF-23)表達水平升高密切相關，但迄今為止，klotho表達水平在CKD并發(fā)SHPT患者體內的變化仍存在爭議，其作用機制有待闡明[2]。為此，本研究通過觀察并比較CKD患者血清中可溶型klotho(soluble klotho，s-kl)、FGF-23、甲狀旁腺素(parathyroid hormone，PTH)水平，初步明確klotho在CKD分期及其并發(fā)SHPT中的作用機制，以期進一步闡明klotho在CKD并發(fā)SHPT疾病進程中的臨床意義及理論基礎。

1對象與方法

1.1納入與排除標準納入標準：(1)符合腎臟病預后質量指南-慢性腎臟病(K/DOQI-CKD)診斷標準[3]；(2)年齡≥18歲；(3)入選前2周內未使用血管緊張素轉換酶抑制劑(ACEI)或血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑(ARB)和影響鈣磷代謝及PTH分泌的藥物；(4)心肺功能穩(wěn)定及肝功能正常者。排除標準：(1)有透析(腹膜透析或血液透析)史、腫瘤、原發(fā)性或繼發(fā)性骨骼疾病病史、原發(fā)性甲狀旁腺功能亢進癥或甲狀旁腺手術史；(2)1個月內患有感染性疾病史；(3)半年內服用潑尼松或其他激素超過30 d；(4)1年內使用過雙磷酸鹽或降鈣素者[4]。

1.2研究對象及分組選取2012—2014年在海南省人民醫(yī)院腎病風濕科門診或住院的符合納入與排除標準的CKD患者85例為研究對象。其中男48例，女37例；年齡18～71歲，平均年齡(37.1±13.3)歲。分組：(1)根據CKD分期標準〔按照腎小球濾過率(glomerular filtration rate，GFR)水平劃分〕[3]分為CKD1～2組(26例)、CKD3～4組(34例)和CKD5組(25例)。(2)CKD 3～5期的患者根據PTH水平[4]分為非SHPT組(n-SHPT組，PTH≤120 ng/L，26例)和SHPT組(PTH>120 ng/L，33例)。本研究獲得海南省人民醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，研究對象均知情同意。

1.3研究方法

1.3.1基本資料收集收集患者的基本資料，包括性別、年齡、體質量、血壓。

1.3.2常規(guī)血清學指標檢測清晨空腹采集靜脈血(2×10 ml)，提取血清置-80 ℃冰箱中保存?zhèn)錂z。采用全自動血液細胞學分析儀檢測血紅蛋白(Hb)水平，全自動生化分析儀檢測肝腎功能〔包括丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)、清蛋白(ALB)、尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)〕、電解質(包括鈣、磷)、堿性磷酸酶(ALP)水平，核素腎動態(tài)顯像(99Tcm-DTPA)檢測GFR水平，電化學發(fā)光法(羅氏公司診斷試劑盒)測定PTH水平。

1.3.3s-kl、25-羥基維生素D(25-hydroxyvitamin D，25-OH-D)、FGF-23水平檢測采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)法檢測血清中s-kl、25-OH-D、FGF-23水平，按照產品試劑盒說明書操作。

2結果

2.1CKD1～2組、CKD3～4組和CKD5組患者基本資料及常規(guī)血清學指標比較CKD1～2組、CKD3～4組、CKD5組性別、年齡、體質量、ALB水平比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。CKD1～2組、CKD3～4組、CKD5組MAP、Hb、ALT、AST、BUN、Scr、鈣、磷、ALP、PTH水平比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。CKD3～4組、CKD5組MAP、Hb、BUN、Scr、鈣、磷、ALP、PTH水平與CKD1～2組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；CKD5組ALT水平與CKD1～2組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；CKD5組Hb、ALT、AST、BUN、Scr、鈣、磷、ALP、PTH水平與CKD3～4組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表1)。

2.2CKD1～2組、CKD3～4組和CKD5組患者s-kl、25-OH-D、FGF-23水平比較CKD1～2組、CKD3～4組、CKD5組s-kl、25-OH-D、FGF-23水平比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。CKD3～4組、CKD5組s-kl、25-OH-D、FGF-23水平與CKD1～2組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；CKD5組s-kl、25-OH-D、FGF-23水平與CKD3～4組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表2)。

2.3n-SHPT組和SHPT組患者各項指標比較n-SHPT組與SHPT組性別、年齡、體質量、MAP、Hb、ALT、AST、FGF-23水平比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。n-SHPT組與SHPT組ALB、BUN、Scr、鈣、磷、ALP、GFR、s-kl、25-OH-D水平比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表3)。

2.4相關性分析s-kl與鈣、GFR、25-OH-D呈正相關，與磷、ALP、PTH呈負相關(P<0.05)；s-kl與FGF-23無直線相關關系(P>0.05，見表4)。

Table 2Comparison of s-kl,25-OH-D and FGF-23 levels among CKD1-2,CKD3-4 and CKD5groups

組別例數s-kl(ng/L)25-OH-D(nmol/L)FGF-23(ng/L)CKD1～2組26710±145 86±16 99±17 CKD3～4組34513±132a63±16a117±28aCKD5組25394±90ab52±12ab143±49abF值41.60836.36414.291P值<0.001<0.001<0.001

注：與CKD1～2組比較，aP<0.05；與CKD3～4組比較，bP<0.05；s-kl=可溶型klotho，25-OH-D=25-羥基維生素D，FGF-23=成纖維細胞生長因子23

表4　s-kl與各指標的相關性分析

表1　CKD1～2組、CKD3～4組和CKD5組患者基本資料及常規(guī)血清學指標比較

注：a為χ2值；與CKD1～2組比較，bP<0.05；與CKD3～4組比較，cP<0.05；1 mm Hg=0.133 kPa;CKD=慢性腎臟病，MAP=平均動脈壓，Hb=血紅蛋白，ALT=丙氨酸氨基轉移酶，AST=天冬氨酸氨基轉移酶，ALB=清蛋白，BUN=尿素氮，Scr=血肌酐，ALP=堿性磷酸酶，PTH=甲狀旁腺素

表3　n-SHPT組和SHPT組患者各項指標比較

注：a為χ2值；SHPT=繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進癥

2.5PTH水平影響因素的直線回歸分析以PTH為因變量(連續(xù)性變量)，以BUN、Scr、鈣、磷、ALP、GFR、s-kl、25-OH-D、FGF-23為自變量(連續(xù)性變量)，進行直線回歸分析，結果顯示，鈣進入回歸方程，回歸方程為y=334.20-92.02x(P<0.05)。

3討論

klotho是一種影響CKD發(fā)生發(fā)展的重要跨膜蛋白，除了在大腦脈絡膜和腎臟中高表達外，甲狀旁腺也是其表達的重要器官之一。klotho表達水平升高可以減少尿蛋白排出，延緩腎功能下降，調節(jié)鈣磷失衡，是目前研究延緩CKD進展的熱點之一[5]。klotho以2種形式存在，即膜結合型klotho(membrane klotho，m-kl)和s-kl，s-kl以酶切裂解的方式從細胞膜表面與m-kl分離，直接釋放至血循環(huán)中[6]。研究發(fā)現，m-kl可與FGF受體(FGF receptors，FGFRs)結合形成klotho-FGFRs復合物，然后與FGF-23結合，而s-kl可極大增強FGF-23與klotho-FGFRs復合物的親和力；通過檢測血液中s-kl水平，可間接反映細胞膜上klotho表達水平[6]。

調節(jié)鈣磷平衡和維生素D代謝是klotho的重要功能之一，研究發(fā)現，klotho聯合FGF-23在腎臟近端小管上皮細胞與FGFRs結合形成FGF-23/klotho-FGFRs復合物，抑制磷的重吸收，遠端小管上皮細胞通過穩(wěn)定瞬時受體電位V5-鈣(TRPV5-Ca2+)通道調節(jié)鈣的重吸收，并抑制腎臟1-α-25羥化酶(1-alpha-25 hydroxylase)活性，下調骨化三醇水平[7]。在正常生理狀態(tài)下，klotho與PTH對鈣磷轉運具有協同作用，但對骨化三醇的合成作用卻截然相反。然而，ESRD時FGF-23/klotho-FGFRs復合物和PTH對無機磷的重吸收調控作用失效，持續(xù)增高的PTH引起骨骼過度釋放無機磷至血循環(huán)中，導致高磷血癥加重[8]。本研究結果顯示，CKD3～4組和CKD5組鈣、s-kl、25-OH-D水平低于CKD1～2組，CKD5組鈣、s-kl、25-OH-D水平低于CKD3～4組，CKD3～4組和CKD5組磷、PTH、FGF-23水平高于CKD1～2組，CKD5組磷、PTH、FGF-23水平高于CKD3～4組，提示隨著GFR的降低，腎功能的進展惡化，s-kl水平逐漸降低，CKD患者腎臟klotho表達水平減少，klotho-FGFRs復合物水平下降，不能充分結合FGF-23使其失去生物學效應；磷排泄減少并潴留，鈣重吸收發(fā)生障礙，高磷、低25-OH-D又進一步加重低鈣，低鈣和高FGF-23持續(xù)刺激甲狀旁腺分泌PTH，最終導致SHPT，而高水平的PTH刺激骨骼釋放無機磷入血，再加重高磷血癥，由此形成惡性循環(huán)。本研究結果顯示，SHPT組鈣、s-kl、25-OH-D水平低于n-SHPT組，ALP水平高于n-SHPT組，從另一方面也提示了這一可能機制。

本研究結果顯示，s-kl與鈣、GFR、25-OH-D呈正相關，與磷、ALP、PTH呈負相關，提示klotho可能在SHPT和腎性骨病中發(fā)揮重要作用[9]，其確切機制有待更深入的研究。另一方面，BUN、Scr、磷、ALP、GFR、s-kl、25-OH-D、FGF-23與PTH均無線性回歸關系。目前已證實，甲狀旁腺是FGF-23作用的靶器官之一，可同時表達klotho和FGFRs，雖然klotho和 FGFRs均不能單獨與FGF-23結合[10]，但s-kl可極大增強FGF-23與klotho-FGFRs復合物的親和力，其作為輔助因子參與FGF-23抑制PTH的分泌作用，使之維持在正常水平[6]。研究發(fā)現，CKD時骨組織分泌FGF-23增多，但甲狀旁腺細胞中klotho、FGFRs表達水平下降，導致FGF-23不能有效對甲狀旁腺分泌PTH進行有效調節(jié)，PTH持續(xù)分泌增多，SHPT逐漸加重。同時，CKD并發(fā)SHPT時甲狀旁腺組織增生，自主分泌PTH[11-13]。提示CKD時PTH可能不受FGF-23/klotho-FGFRs復合物調節(jié)，另外甲狀旁腺組織增生自主分泌PTH可能也是導致SHPT的重要原因，甚至是否僅依賴于FGF-23/klotho-FGFRs復合物途徑調節(jié)，仍有待更深入的研究。

本研究僅初步觀察CKD患者及CKD并發(fā)SHPT患者中s-kl、FGF-23水平的變化，限于樣本量較少，入選病種的多樣化，加之臨床患者病情及治療方案的異同等因素，研究結果不能確切闡明klotho和FGF-23在SHPT中的發(fā)病機制，僅可提示FGF-23/klotho-FGFRs復合物調節(jié)通路可能對CKD及其并發(fā)SHPT的發(fā)生發(fā)展產生影響。

綜上所述，klotho表達水平隨著CKD進展逐漸下降，其在CKD及其合并SHPT患者中降低可能是促進CKD進展和鈣代謝失調，進而導致SHPT發(fā)生并加重的原因之一，為進一步的深入研究提供了思路。

作者貢獻：林書典進行實驗設計與實施、資料匯總整理、撰寫論文、成文并對文章負責；詹鋒對實驗設計與實施進行指導，對實驗結果進行質控校對，指導論文寫作及審校；武偉、潘楚瑛、張延進行病例資料收集、整理；劉穎、詹宇威負責實驗操作。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：崔麗紅)

【關鍵詞】腎病；甲狀旁腺功能亢進癥,繼發(fā)性；klotho；成纖維細胞生長因子23

林書典，詹鋒，武偉，等.klotho在慢性腎臟病分期及其并發(fā)繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進癥中的作用[J].中國全科醫(yī)學，2016，19(3)：272-276.[www.chinagp.net]

Lin SD,Zhan F,Wu W,et al.Effect of klotho on chronic kidney disease staging and secondary hyperparathyroidism[J].Chinese General Practice，2016，19(3)：272-276.

Effect of klotho on Chronic Kidney Disease Staging and Secondary HyperparathyroidismLINShu-dian,ZHANFeng,WUWei,etal.DepartmentofNephrology&Rheumatology,HainanGeneralHospital,Haikou570311,China

【Abstract】ObjectiveTo make a preliminary investigation on the effect of klotho on chronic kidney disease (CKD) staging and secondary hyperparathyroidism (SHPT).MethodsFrom 2012 to 2014,85 CKD inpatients and outpatients who accorded with the inclusion and exclusion criteria from the Department of Nephrology & Rheumatology of Hainan General Hospital were enrolled in the study.According to CKD staging criteria,divided the patients into three groups:CKD1-2 group (n=26),CKD3-4 group (n=34) and CKD5 group (n=25).The patients at CKD 3-5 stages were divided into n-SHPT group (PTH≤120 ng/L;n=26) and SHPT group (PTH>120 ng/L;n=33).The basic data (gender,age,body weight and blood pressure) of the patients were collected,and the serum levels of hemoglobin (Hb),alanine aminotransferase (ALT),glutamate aminotransferase (AST),albumin (ALB),urea nitrogen (BUN),serum creatinine (Scr),calcium,phosphorus,alkaline phosphatase (ALP),glomerular filtration rate (GFR),parathyroid hormone (PTH),soluble klotho (s-kl),25- hydroxy vitamin D (25-OH-D),and fibroblast growth factor 23 (FGF-23) were detected.ResultsCKD3-4 group and CKD5 were significantly different from CKD1-2 group in MAP,Hb,BUN,Scr,calcium,phosphorus,ALP and PTH (P<0.05);CKD5 group was significantly different from CKD1-2 in ALT(P<0.05);CKD5 group was significantly different from CKD3-4 in Hb,ALT,AST,BUN,Scr,calcium,phosphorus,ALP and PTH (P<0.05).CKD3-4 group and CKD5 group were significantly different from CKD1-2 group in the levels of s-kl,25-OH-D and FGF-23(P<0.05);CKD5 group and CKD3-4 group were significantly different in the levels of s-kl,25-OH-D and FGF-23(P<0.05).n-SHPT group and SHPT group were significantly different in the levels of ALB,BUN,Scr,calcium,phosphorus,ALP,GFR,s-kl and 25-OH-D (P<0.05).s-kl was positively correlated with calcium,GFR and 25-OH-D,and was negatively correlated with phosphorus,ALP and PTH(P<0.05);s-kl and FGF-23 had no linear correlation between each other (P>0.05).Linear regression analysis of the influencing factors for PTH level showed that calcium entered the regression equation,and the regression equation was y=334.20-92.02x(P<0.05).Conclusionklotho level decreases with CKD progressing,and its decrease in CKD patients complicated with SHPT may be one of the reasons for CKD development and metabolic disorder of calcium,which further induces SHPT.

【Key words】Nephrosis;Hyperparathyroidism,secondary;klotho;Fibroblast growth factor 23

(收稿日期：2015-06-26；修回日期：2015-09-29)

【中圖分類號】R 582.1

【文獻標識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.03.006

通信作者：林書典，570311 海南省?？谑?，海南省人民醫(yī)院腎病風濕科；E-mail：linsd0110@163.com

基金項目：國家自然科學基金資助項目(81360118)；海南省自然科學基金資助項目(309087)
作者單位：570311 海南省?？谑校Ｄ鲜∪嗣襻t(yī)院腎病風濕科