大腸癌中heregulin、表皮生長因子受體-2及基質金屬蛋白酶-7表達及相關性

王冬芽　周　青

(井岡山大學附屬醫(yī)院普外科，江西　吉安　343000)

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大腸癌中heregulin、表皮生長因子受體-2及基質金屬蛋白酶-7表達及相關性

王冬芽周青1

(井岡山大學附屬醫(yī)院普外科，江西吉安343000)

摘要〔〕目的探討heregulin、表皮生長因子受體(ErbB)-2及基質金屬蛋白酶(MMP)-7在大腸癌中蛋白和基因的表達及其相關性。方法收集47例大腸癌根治術后新鮮標本為研究對象，用Western印跡法檢測heregulin、ErbB-2及MMP-7在腸癌組織、癌旁組織及遠癌組織的蛋白表達,用RT-PCR法檢測ErbB-2及MMP-7在三組的mRNA表達；比較分析三者與大腸癌臨床病理特征的關系。 結果heregulin和ErbB-2在腸癌組織的蛋白表達較癌旁組織顯著增多(P<0.01)，而癌旁組織比遠癌組織的表達也有所增加(P<0.05)。MMP-7在腸癌組織的表達較癌旁組織增多，差異顯著(P<0.01)，遠癌組織未見表達；腸癌組織中heregulin、ErbB-2及MMP-7的蛋白表達兩兩之間存在正相關關系。ErbB-2在腸癌組織的mRNA表達顯著高于遠癌組織(P<0.05)；MMP-7的mRNA表達在腸癌組織顯著高于癌旁組織(P<0.01)，遠癌組織未見表達。heregulin、ErbB-2及MMP-7的蛋白表達與大腸癌的分級、Dukes分期和淋巴結轉移存在相關性。 結論heregulin、ErbB-2及MMP-7在大腸癌中過度表達；heregulin磷酸化激活ErbB-2后可能通過復雜的下游信號通路介導MMP-7表達上調，三者共同在大腸癌的浸潤侵襲中發(fā)揮重要作用；heregulin及ErbB-2 有望成為判斷大腸癌惡性進展的重要指標。

關鍵詞〔〕大腸癌；heregulin；表皮生長因子受體2；基質金屬蛋白酶-7

1井岡山大學醫(yī)學院病理教研室

在我國，隨著人口老齡化、飲食結構及生活習慣的改變，大腸癌的發(fā)病率逐年上升〔1〕。眾多研究表明，表皮生長因子及其受體家族在大腸癌進展中發(fā)揮著極其重要的作用。表皮生長因子受體2(ErbB-2)是表皮生長因子受體(EGFR)家族的中心成員，在多種惡性腫瘤進展中起到關鍵作用〔2～7〕。heregulin是新近發(fā)現的表皮生長因子(EGF)家族成員〔8〕，它能專一激活乳腺癌中ErbB-2酪氨酸殘基的磷酸化，啟動系列細胞應答，促進癌細胞的增殖和浸潤〔9～12〕。然而heregulin與ErbB-2在大腸癌中表達的相關性及其意義目前研究甚少?；|金屬蛋白酶(MMP)-7具有強大的基質降解功能，是腫瘤惡性侵襲行為的關鍵因素之一〔13，14〕。本研究heregulin、ErbB-2及MMP-7在大腸癌中的蛋白和基因表達，探討三者表達的相關性，同時分析三者大腸癌組織學類型、分化程度及Dukes分期等病理學參數之間的關系，以探討大腸癌浸潤和轉移的發(fā)生機制。

1材料與方法

1.1一般資料選取我院大腸癌根治術后的新鮮大腸癌組織標本，分為：①大腸癌組47例，男25例，女22例，年齡30～79歲，中位年齡53歲。同時收集患者的臨床資料，包括組織學分型、分化程度、Dukes分期、有無淋巴結轉移等。②癌旁組織組20例，取上述癌腫患者毗鄰腫瘤旁的腸黏膜組織。③遠癌組織組12例，取上述癌腫患者腫瘤旁10 cm以外的腸黏膜組織。后二組經病理證實均無腫瘤浸潤。

1.2Western印跡法檢測蛋白質表達取樣品與5×上樣緩沖液混合煮沸5 min 后上樣進行SDS- PAGE電泳；電泳后以穩(wěn)定18V電壓,半干法電轉移至PVDF 膜,用含5%脫脂奶粉TBS/T 緩沖液封閉1 h，加入一抗,4℃過夜,洗膜,加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗孵育1 h,暗室中ECL發(fā)光液覆蓋膜5 min,X 光膠片曝光,顯影,定影，PVDF膜上特異性條帶經Olympus BX41凝膠成像儀掃描進行相對定量。

1.3逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)法檢測基因表達按EZ Spin Column RNA Purification Kit說明提取總RNA。核酸蛋白分析儀鑒定RNA樣品的濃度和純度，正常RNA的吸光度(A)260 nm/280 nm比值均在1.9-2.0。以提取的RNA為模板逆轉錄合成cDNA。反應結束后取出cDNA按1∶1稀釋，4℃保存。用于real time PCR的兩對引物序列由上海生工生物工程公司合成。其中ErbB-2的引物序列為：上游引物：CCTCTGACGTCCATCATCTC，下游引物：ATCTTCTGCTGCCGTCGCTT；MMP-7的引物序列為：上游引物：TCTTTGGCCTACCTATAACTGG，下游引物：CTAGACTGCTACCATCCGTC。經由40個循環(huán)的變性、退火和延伸，生成的PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)掃描分析，結果用靶基因/β-actin比值表示。

1.4統(tǒng)計學分析采用SPSS11.5統(tǒng)計分析軟件行方差分析和Pearson相關分析。

2結果

2.1heregulin、ErbB-2及MMP-7在各組的蛋白表達heregulin和ErbB-2在腸癌組織組的表達比癌旁組織組顯著增強，癌旁組織組又比遠癌組織組明顯增多(圖1、表1、表2)。MMP-7在腸癌組織組表達較癌旁組織組顯著增加，遠癌組織未見表達(圖1、表3)。

2.2ErbB-2及MMP-7在各組的mRNA表達 ErbB-2在腸癌組織組的mRNA表達顯著高于遠癌組織組，此外癌旁組織組比遠癌組織組的表達有所增多，但差異無統(tǒng)計學意義(圖2,表4)；MMP-7的mRNA表達在腸癌組織顯著高于癌旁組織(圖3,表4)，遠癌組織未見表達。

圖1　heregulin、ErbB-2及MMP-7蛋白在各組的表達

2.3大腸癌組織中ErbB-2及MMP-7各自的mRNA表達與蛋白表達的相關性ErbB-2 mRNA表達及蛋白表達呈顯著正相關關系(r=0.78，P<0.01)，前者表達較高的標本，后者表達也高。MMP-7在大腸癌組織中的mRNA表達及蛋白表達也呈顯著正相關關系(r=0.83，P<0.01)。

2.4大腸癌組織中heregulin、ErbB-2及MMP-7蛋白表達的相關性大腸癌組織中heregulin、ErbB-2及MMP-7蛋白表達兩兩之間呈正相關(P均<0.05)(表5)。

2.5heregulin、ErbB-2及MMP-7的蛋白表達與大腸癌臨床病理特征的關系在47例免疫印跡檢測的大腸癌組織中，heregulin、ErbB-2及MMP-7的蛋白表達與腫瘤組織學分級、Dukes分期及有無淋巴結轉移具有顯著相關性(P均<0.05)，而與患者年齡、性別及腫瘤的組織學類型無明顯相關(表6)。

表1　heregulin分別在腸癌組織組、癌旁組織組及遠癌組織組的蛋白表達±s)

與遠癌組織組比較：1)P<0.01，2)P<0.05；與癌旁組織組比較：3)P<0.05，下表同

表2　ErbB-2分別在腸癌組織組、癌旁組織組及遠癌組織組的蛋白表達±s)

表3　MMP-7分別在腸癌組織組、癌旁組織組的蛋白表達±s)

與癌旁組織組比較：1)P<0.01

圖3　ErbB-2、MMP-7 mRNA在各組的表達

組別nErbBmRNAMMP-7mRNA大腸癌組4753.09±11.131)83.29±10.202)癌旁組織組2038.21±6.2037.78±5.91遠癌組織組1230.29±10.20-

與遠癌組織組比較：1)P<0.05；與癌旁組織組比較：2)P<0.01；-:未表達

表5　大腸癌組織中heregulin、ErbB-2及

1)P<0.01，2)P<0.05

表6　heregulin、ErbB-2及MMP-7的蛋白表達條帶強度與大腸癌臨床病理特征的關系

與低分化組比較：1)P<0.05；與C+D期比較：2)P<0.05；與有淋巴結轉移組比較：3)P<0.05

3討論

大腸癌是一種常見的惡性腫瘤，近年來發(fā)病率有升高趨勢。癌基因ErbB-2，是表皮生長因子受體家族(EGFR家族)的中心成員，可在多種惡性腫瘤進展中起到關鍵作用，為近年來腫瘤診治研究熱點〔15，16〕。當前較多資料表明，ErbB-2參與大腸癌的發(fā)病機制，但具體觀點不盡相同。Li等〔17〕用熒光免疫雜交法及免疫組化法檢測結直腸癌中ErbB-2表達，結果發(fā)現無論在腫瘤早期基因擴增獨立的轉錄激活作用中，還是在腫瘤進展后期基因擴增依賴的過表達中，ErbB-2對CRC腫瘤發(fā)生都起著至關重要的作用。 李文婷等〔18，19〕報道ErbB-2蛋白在大腸癌組織過表達，并且其表達與大腸癌臨床分期、淋巴結轉移有關，可作為判定大腸癌生物學行為和預后的重要參考指標。然而曾瑄等〔20〕觀點差異較大，研究采用熒光原位雜交法(FISH)和免疫組化法檢測了我國42例結直腸癌患者ErbB-2的蛋白表達和基因狀態(tài)，其研究顯示ErbB-2蛋白表達和基因拷貝數增加的效率均較低，推測不同的抗體和方法學以及標本的儲存時間(影響染色強度)都可能是造成研究結果迥異的原因，因此提出有待于評分系統(tǒng)的統(tǒng)一和更大研究數據的積累。本實驗結果提示，ErbB-2無論是基因水平還是蛋白水平的表達都與大腸癌的進展及惡性程度密切相關。這與Li等〔17,18〕的研究結果比較一致。

heregulin是Holmes等于1992年在生長人乳腺癌細胞MDA-MB-231的培養(yǎng)基中分離得到，分子量為45 kD，它是表皮生長因子家族(EGF家族)的分支，具有表皮生長因子(EGF)樣結構〔8〕。雖然資料報道heregulin在很多癌組織中表達，但有關大腸癌中heregulin表達及其作用的報道甚少。本研究提示heregulin與大腸癌的發(fā)生發(fā)展和惡性程度密切相關。

在對人乳腺癌的體內外大量研究中發(fā)現，heregulin在人乳腺癌上皮細胞中具有促有絲分裂作用，heregulin與受體ErbB-3/4結合后，ErbB-2同ErbB-3/4之間形成異二聚體，隨之發(fā)生ErbB-2的磷酸化作用，自身磷酸化的ErbB-2緊接著磷酸化ErbB-3/4，進而磷酸化激活下游信號蛋白，通過復雜的信號網絡誘導ErbB-2過表達細胞的增殖、黏附和運動〔21，22〕。而有關大腸癌中heregulin與ErbB-2的相關性鮮見報道。本研究推測大腸癌中，heregulin可能磷酸化激活ErbB-2/3/4后，再進一步增強其下游的信號轉導，通過復雜的分子機制誘導腫瘤細胞增殖和侵襲。

大量研究表明，腫瘤細胞侵襲浸潤的關鍵因素之一是腫瘤細胞周圍細胞外基質(ECM)的降解〔23〕。ECM的降解又主要是依賴基質金屬蛋白酶(MMPs)來完成。MMPs是一組Zn2+依賴性蛋白酶，目前已發(fā)現至少25種MMP。MMP-7是MMPs家族分子量最小的成員，屬于基質分解素一類，具有強大的基質降解活性和廣泛的底物特異性〔24，25〕。眾多研究表明，MMP-7在結腸癌等腫瘤的侵襲浸潤中起重要作用，是腫瘤惡性進展的標志，可作為判斷惡性程度的指標〔26～30〕。

依據實驗數據，推測在大腸癌組織中，很可能過表達的heregulin磷酸化激活過表達的ErbB-2，再激活一系列下游信號通路，應答效應之一是在核內促進MMP-7基因過表達，進而促使MMP-7蛋白過表達，MMP-7再發(fā)揮強大的降解腫瘤細胞周圍ECM的作用，增強腫瘤細胞對周圍組織的浸潤侵襲，最終影響大腸癌的惡性進展及其預后。據此分析，heregulin及ErbB-2 可能成為大腸癌惡性程度及進展的新分子標記物。至于heregulin磷酸化ErbB-2后，其下游調節(jié)MMP-7表達的具體信號轉導途徑，以及可能存在的與之交織的其他信號網絡等問題尚待進一步研究。

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〔2014-06-30修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)

通訊作者：周青(1981-)，女，碩士，講師，主要從事腫瘤病理學研究。第一作者：王冬芽(1981-)，男，副主任醫(yī)師，主要從事腫瘤基礎與臨床研究。

中圖分類號〔〕R735.34〔

文獻標識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2016)01-0046-05；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.01.021