絲膠對(duì)糖尿病大鼠腎臟血小板衍生生長(zhǎng)因子表達(dá)的調(diào)控作用

趙春穎　劉東慧　宋成軍　陳志宏

(承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所，河北　承德　067000)

?

絲膠對(duì)糖尿病大鼠腎臟血小板衍生生長(zhǎng)因子表達(dá)的調(diào)控作用

趙春穎劉東慧1宋成軍1陳志宏1

(承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所，河北承德067000)

摘要〔〕目的觀察絲膠對(duì)2型糖尿病大鼠腎臟血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)表達(dá)的調(diào)控作用。 方法健康成年雄性SD大鼠48只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、糖尿病模型組、絲膠治療組和陽(yáng)性對(duì)照組(n=12)。鏈脲佐菌素腹腔注射建立2型糖尿病大鼠模型，絲膠治療組大鼠按照2.4 g·kg-1·d-1的劑量灌胃給予絲膠、陽(yáng)性對(duì)照組大鼠按照55.33 mg·kg-1·d-1的劑量灌胃給予二甲雙胍。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)各組大鼠血清Ⅰ型膠原的含量；Western 印跡和RT-PCR法檢測(cè)各組大鼠腎臟PDGF蛋白和mRNA的表達(dá)。 結(jié)果絲膠治療組較糖尿病模型組血清Ⅰ型膠原的含量、腎臟PDGF蛋白和mRNA的表達(dá)明顯降低(P<0.01，P<0.05)。結(jié)論絲膠可通過(guò)下調(diào)糖尿病大鼠腎臟PDGF的表達(dá)，恢復(fù)腎臟細(xì)胞外基質(zhì)代謝的平衡，從而發(fā)揮對(duì)糖尿病腎臟損傷的保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞〔〕2型糖尿??；腎臟；絲膠；細(xì)胞外基質(zhì)；血小板衍生生長(zhǎng)因子

1承德醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)研究室

第一作者：趙春穎(1972-)，女，副研究員，碩士，主要從事中藥研究。

血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)是一種重要的促細(xì)胞生長(zhǎng)因子〔1〕，并參與腎臟細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的代謝〔2〕。有研究發(fā)現(xiàn)，PDGF與糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，可參與早期糖尿病腎臟損傷的發(fā)生和腎臟硬化〔3〕。絲膠是蠶繭中約占30%的水溶性蛋白質(zhì)，我國(guó)民間早就有糖尿病病人將蠶繭泡水飲用用于輔助降血糖。為豐富絲膠治療糖尿病及其并發(fā)癥的實(shí)驗(yàn)研究，本研究觀察絲膠是否可通過(guò)調(diào)控腎臟PDGF的表達(dá)，調(diào)節(jié)腎臟ECM代謝，進(jìn)而保護(hù)糖尿病時(shí)的腎臟損傷。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理48只清潔級(jí)健康雄性SD大鼠，體重200～250 g，購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：712024。隨機(jī)選取其中的12只作為正常對(duì)照組，常規(guī)飼養(yǎng)，腹腔注射同等劑量鏈脲佐菌素(STZ)溶劑(枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液，pH4.4)3次(1次/d)；其余的36只大鼠按25 mg/kg的劑量連續(xù)3 d腹腔注射2%，成模標(biāo)準(zhǔn)是注射STZ 1 w后空腹血糖(FPG)≥16.7 mmol/L〔4〕。成功建立2型糖尿病模型的大鼠隨機(jī)分為糖尿病模型組、絲膠治療組和陽(yáng)性對(duì)照組，每組12只，絲膠治療組大鼠按照2.4 g·kg-1·d-1的劑量灌胃給予絲膠35 d，陽(yáng)性對(duì)照組大鼠灌胃給予二甲雙胍(55.33 mg·kg-1·d-1)35 d，正常對(duì)照組、模型組大鼠灌胃給予等容積生理鹽水35 d。

1.2藥物和試劑絲膠(自制)：蠶繭(承德醫(yī)學(xué)院蠶業(yè)研究所提供)浸泡后水煎2次，合并濾液并濃縮。STZ，美國(guó)Sigma公司，用枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液(pH4.4)配制；血糖檢測(cè)試劑盒，保定長(zhǎng)城臨床試劑有限公司；Ⅰ型膠原酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒，上海瑞奇科技有限公司；兔抗PDGF-B多克隆抗體，北京博奧森生物技術(shù)有限公司；辣根酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(二抗)，美國(guó)KPL公司；BCA蛋白定量試劑盒、藍(lán)色預(yù)染蛋白質(zhì)Marker、蛋白裂解液、1 200 bp DNA Ladder，北京泰格美科技有限公司；β-actin單克隆抗體，美國(guó)Santa公司；Trizol，美國(guó)Invitrogen公司；PDGF、β-actin引物，上海生工公司；PCR試劑盒，大連寶生物工程有限公司。

1.3檢測(cè)血液指標(biāo)4%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，經(jīng)內(nèi)眥取血，3 000 r/min離心20 min后收集血清，-20℃冰箱保存。葡萄糖氧化酶法檢測(cè)血糖，ELISA法檢測(cè)Ⅰ型膠原的含量。

1.4大鼠腎臟PDGF表達(dá)的檢測(cè)大鼠取血后斷頭處死，取腎臟入液氮保存。

1.4.1Western 印跡法檢測(cè)PDGF蛋白的表達(dá)取液氮保存腎臟提取蛋白，BCA蛋白定量試劑盒定量蛋白濃度。每個(gè)上樣孔加80 μg總蛋白行12% SDS-PAGE凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜；5%脫脂奶粉37℃封閉1h，加一抗(β-actin 1∶1 000、PDGF 1∶200)于4℃過(guò)夜；洗膜后加入辣根酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶5 000)室溫?fù)u床孵育1 h，洗膜后加入Super ECL Plus超敏發(fā)光液，曝光后掃描。以β-actin為內(nèi)參照，采用Quantity One-v 4.6.2軟件對(duì)Western條帶進(jìn)行定量分析，以目的蛋白與β-actin條帶的灰度比值，作為各目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.4.2RT-PCR法檢測(cè)PDGF mRNA的表達(dá)取液氮保存腎臟，按Trizol試劑說(shuō)明提取腎臟總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，產(chǎn)物進(jìn)行PCR。PCR引物序列、擴(kuò)增條件及產(chǎn)物長(zhǎng)度見表1。PCR反應(yīng)體系50 μl，反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2 min，94℃變性30 s，50～65℃退火30 s，72℃延伸1 min，第2步起循環(huán)。取5 μl擴(kuò)增產(chǎn)物及5 μl DNA Ladder行2%瓊脂糖凝膠電泳(90 V，40 min)，ZF型紫外透射反射分析儀攝像，應(yīng)用Quantity One-v 4.6.2軟件進(jìn)行分析，以目的條帶和β-actin條帶吸光度的比值，作為PDGF mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和q檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1各組大鼠的血糖和血清Ⅰ型膠原的含量與正常對(duì)照組大鼠比較，糖尿病模型組大鼠的FPG、Ⅰ型膠原的含量明顯升高(P<0.01)；與糖尿病模型組大鼠比較，絲膠治療組、陽(yáng)性對(duì)照組大鼠的FPG和Ⅰ型膠原的含量明顯降低(P<0.01，P<0.05)。見表2。

表1　PCR引物序列及擴(kuò)增條件

表2　各組大鼠FPG、Ⅰ型膠原含量和腎臟PDGF的表達(dá)

與糖尿病模型組比較：1)P<0.01,2)P<0.05

2.2各組大鼠腎臟PDGF的表達(dá)糖尿病模型組大鼠腎臟PDGF蛋白及mRNA的表達(dá)較正常對(duì)照組大鼠高(P<0.01)；絲膠、二甲雙胍均可明顯降低糖尿病模型大鼠腎臟PDGF的表達(dá)，絲膠治療組、陽(yáng)性對(duì)照組大鼠腎臟PDGF蛋白及mRNA的表達(dá)明顯較糖尿病模型組大鼠低(P<0.01)。見圖1，圖2和表2。

1.正常對(duì)照組，2.糖尿病模型組，3.絲膠治療組，4.陽(yáng)性對(duì)照組；下圖同圖1　各組大鼠腎臟PDGF蛋白的表達(dá)

圖2　各組大鼠腎臟PDGF mRNA的表達(dá)

3討論

糖尿病腎病的主要病理特征是系膜區(qū)ECM的進(jìn)行性積聚，進(jìn)而引發(fā)腎小球硬化、腎間質(zhì)纖維化，最終導(dǎo)致慢性腎衰竭甚至死亡。機(jī)體內(nèi)多種細(xì)胞因子和酶參與調(diào)節(jié)ECM合成與分解的動(dòng)態(tài)平衡，包括PDGF。糖尿病時(shí)，由于高血糖誘導(dǎo)激活PKC途徑、脂代謝紊亂以及晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)的刺激，使腎臟PDGF的表達(dá)水平升高〔5,6〕。PDGF表達(dá)水平升高，可通過(guò)直接促進(jìn)多種ECM成分的積聚，參與早期糖尿病腎臟損傷的形成和腎小球硬化〔7,8〕；另外，PDGF還可通過(guò)誘導(dǎo)TGF-β的表達(dá)加重腎臟病變，并且這一作用與高血糖有協(xié)同效應(yīng)，由此引發(fā)腎小球系膜細(xì)胞增生和ECM積聚〔9,10〕。Kang等〔11〕研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)抑制PDGF基因啟動(dòng)子區(qū)Sp1的表達(dá)，可減輕系膜細(xì)胞增生和系膜基質(zhì)的產(chǎn)生。

絲膠可通過(guò)下調(diào)PDGF的表達(dá)，一方面，減弱PDGF直接促進(jìn)ECM成分產(chǎn)生的作用，另一方面，可拮抗PDGF誘導(dǎo)的TGF-β的致腎臟纖維化的作用，通過(guò)減少ECM合成恢復(fù)ECM的平衡，延緩腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展，發(fā)揮對(duì)糖尿病腎臟損傷的保護(hù)作用。

我國(guó)糖尿病患者以藥物治療為主，但各種藥物均有不同程度的不容忽視的副作用，且無(wú)法有效改善胰島素抵抗及保護(hù)胰島細(xì)胞〔12,13〕。因此，需要探尋一種降糖療效可靠且較少毒副作用的治療糖尿病的中成藥。絲膠是蠶絲中由18種氨基酸組成的高分子水溶性蛋白質(zhì)，是天然的蛋白質(zhì)，可避免化學(xué)合成藥物帶來(lái)的毒副作用，且本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，絲膠可保護(hù)糖尿病時(shí)生殖功能障礙和脊髓損傷〔14,15〕。

參考文獻(xiàn)4

1Yanamoto H,Kataoka H,Nakajo Y,etal.The role of the host defense system in the development of cerebral vasospasm:analogies between atherosclerosis and subarachnoid hemorrhage 〔J〕.Eur Neurol,2012;68(6):329-43.

2Xia Y,Zhang Y,Shi W,etal.Overexpression of megsin induces mesangial cell proliferation and excretion of type Ⅳ collagen in vitro 〔J〕.Cell Immunol,2011;271(2):413-7.

3陳爍蘋，鄭景晨，倪連松，等.血管緊張素-(1-7)對(duì)糖尿病大鼠腎臟PDGF、TGF-β的影響〔J〕.中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志，2008;24(4)：475-8.

4Liu Y,Qi H,Wang Y,etal.Allicin protects against myocardial apoptosis and fibrosis in streptozotocin-induced diabetic rats 〔J〕.Phytomedicine,2012;19(8-9):693-8.

5Yokota T,Ma RC,Park JY,etal.Role of protein kinase C on the expres- sion of platelet-derived growth factor and endothelin-1 in the retina of diabetic rats and cultured retinal capillary pericytes〔J〕.Diabetes,2003;52(3):838-45.

6Deuther-Conrad W,Franke S,Henle T,etal.In vitro-prepared advanced lycation end-products and the modulating potential of their low- molecular weight degradation products in IRPTC-A rat proximal- tubular derived kidney epithelial cell line 〔J〕.Cell Mol Biol,2001;47 Online Pub:OL187-96.

7Su YX,Deng HC,Zhang MX,etal.Adiponectin inhibits PDGF-induced mesangial cell proliferation:regulation of mammalian target of rapamycin-mediated survival pathway by adenosine 5-monophosphate-activated protein kinase 〔J〕.Horm Metab Res,2012;44(1):21-7.

8Bessa SS,Hussein TA,Morad MA,etal.Urinary platelet-derived growth factor-BB as an early marker of nephropathy in patients with type 2 diabetes:an Egyptian study 〔J〕.Ren Fail,2012;34(6):670-5.

9潘大彬，何永勝，劉文潔，等.血小板衍生生長(zhǎng)因子-BB通過(guò)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β信號(hào)系統(tǒng)調(diào)節(jié)大鼠平滑肌細(xì)胞內(nèi)p21WAF1表達(dá)〔J〕.中華心血管病雜志，2010；38(2)：160-5.

10Takakura K,Tahara A,Sanagi M,etal.Antifibrotic effects of pirfenidone in rat proximal tubular epithelial cells 〔J〕.Ren Fail,2012;34(10):1309-16.

11Kang JH,Chae YM,Park KK,etal.Suppression of mesangial cell proli- feration and extracellular matrix production in streptozotocin-induced diabetic rats by Sp1 decoy oligodeoxynucleotide in vitro and in vivo〔J〕.J Cell Biochem,2008;103(2):663-74.

12Kang JH,Chae YM,Park KK,etal.Suppression of mesangial cell proli- feration and extracellular matrix production in streptozotocin-induced diabetic rats by Sp1 decoy oligodeoxynucleotide in vitro and in vivo〔J〕.J Cell Biochem,2008;103(2):663-74.

13Mc Alister FA,Eurich DT,Majumdar SR,etal.The risk of heart failure in patients with type 2 diabetes treated with oral agent monotherapy 〔J〕.Eur J Heart Fail,2008;10(7):703-8.

14蘇哲君，孟凡利，付文亮，等.2型糖尿病大鼠睪丸PCNA表達(dá)的變化及絲膠的保護(hù)作用〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2012;32(1)：88-90.

15李強(qiáng)，李山山，張艷，等.絲膠對(duì)糖尿病大鼠脊髓及脊神經(jīng)節(jié)細(xì)胞神經(jīng)肽Y表達(dá)的作用〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2013;33(1)：110-1.

〔2014-03-18修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢(mèng)園)

歡 迎 投 稿歡 迎 訂 閱

Regulating effects of sericin on platelet-derived growth factor expression in kidney of type 2 diabetes mellitus rats

ZHAO Chun-Ying,LIU Dong-Hui,SONG Cheng-Jun,etal.

Institute of Chinese Materia Medica,Chengde Medical College,Chengde 067000,Hebei,China

【Abstract】ObjectiveTo observe the regulating effects of sericin on platelet-derived growth factor (PDGF) expression in kidney of type 2 diabetes mellitus rats. Methods48 adult healthy male SD rats were randomly divided into 4 groups with 12 rats in each group: normal control,diabetes mellitus model,sericin treatment and positive control groups.Type 2 diabetes mellitus rat model was made by injecting streptozotocin into the peritoneal cavity continuously,and then the rats were respectively lavaged with sericin (2.4 g/kg) in sericin treatment group and metformin (55.33 mg/kg) in positive control group.Serum type Ⅰ collagen content was detected by ELISA.Western blot and RT-PCR were used to detect the expression of PDGF in kidney. ResultsCompared with rats in diabetes mellitus model group,serum type Ⅰ collagen content of rats in sericin treatment group was decreased obviously.Expression of PDGF of rats' kidney was decreased significantly in sericin treatment group (P<0.01,P<0.05). ConclusionsSericin can recover the balance of extracellular matrix metabolism by down regulating the expression of PDGF in kidney of diabetes mellitus rats,so to protect kidney injury during diabetes mellitus.

【Key words】Type 2 diabetes mellitus; Kidney; Sericin; Extracellular matrix; Platelet-derived growth factor

通訊作者：陳志宏(1971-)，女，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事糖尿病及其并發(fā)癥防治研究。

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué) (81441133)；河北省自然科學(xué) (H2012406018)

中圖分類號(hào)〔〕R587.1〔

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

文章編號(hào)〕1005-9202(2016)01-0007-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.01.003