缺氧預(yù)處理對老年大鼠運動性骨骼肌損傷的作用及機制

鄧文騫　王　璐

(成都體育學(xué)院運動醫(yī)學(xué)系，四川　成都　610041)

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缺氧預(yù)處理對老年大鼠運動性骨骼肌損傷的作用及機制

鄧文騫王璐

(成都體育學(xué)院運動醫(yī)學(xué)系，四川成都610041)

摘要〔〕目的了解缺氧預(yù)處理對老年大鼠運動性骨骼肌損傷發(fā)生發(fā)展的影響。方法將老年雌性SD大鼠隨機分為對照組(CON)組、大強度離心跑臺運動組(EE)組、缺氧預(yù)處理+離心跑臺運動組(HCP)組，4月齡大鼠作為成年對照組(ADU)組。HCP組大鼠進行1 w的缺氧預(yù)處理。將EE組及HCP組大鼠進行一次性大強度離心跑臺運動后處死，測定血清白細(xì)胞介素(IL)-6含量、肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)含量，石蠟切片觀察肌纖維細(xì)微結(jié)構(gòu)；取肌肉勻漿測超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量。結(jié)果EE組及HCP組大鼠運動后均出現(xiàn)骨骼肌損傷現(xiàn)象，EE組損傷較HCP組嚴(yán)重。與EE組相比，HCP組血清IL-6、CK及LDH水平明顯降低，比目魚肌MDA水平明顯降低，SOD活性明顯升高。結(jié)論缺氧預(yù)處理可提高老年大鼠骨骼肌的抗氧化能力，降低骨骼肌損傷后炎性反應(yīng)，對運動性骨骼肌損傷有預(yù)防作用。

關(guān)鍵詞〔〕運動性骨骼肌損傷;比目魚肌;缺氧預(yù)處理;離心運動

第一作者：鄧文騫(1982-)，男，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事運動疲勞及運動損傷的防治研究。

運動性肌肉損傷(EIMD)是指機體從事不習(xí)慣高強度和或長時間運動后發(fā)生的骨骼肌纖維微細(xì)損傷〔1〕。導(dǎo)致EIMD的原因之一可能是劇烈運動導(dǎo)致機體的氧化應(yīng)激反應(yīng)增加，通過增加機體抗氧化能力能夠減少EIMD的發(fā)生〔2〕。而老年人隨著年齡的增加，機體抗氧化能力逐漸下降，發(fā)生EIMD的風(fēng)險也在逐漸增加，如何有效預(yù)防EIMD的發(fā)生，減少運動鍛煉帶來的負(fù)面影響，成為老年運動醫(yī)學(xué)的研究熱點。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，預(yù)先短暫的缺血或輕度缺氧可激發(fā)機體內(nèi)源性保護機制，對隨后的嚴(yán)重缺血、缺氧具有預(yù)防和保護作用，其機制可能是缺血/缺氧預(yù)處理調(diào)動了機體內(nèi)源性抗損傷機制，使機體對缺血、缺氧損傷發(fā)生主動性適應(yīng)反應(yīng)〔3,4〕。本研究旨在了解缺氧預(yù)處理能否對老年大鼠運動性骨骼肌損傷的發(fā)生有預(yù)防作用，并對其可能的機制進行初步探討。

1材料與方法

1.1實驗動物與模型60只(22±1)月齡雌性SPF 級SD大鼠，體重(523±38)g，6只4月齡雌性SPF 級SD大鼠，體重(318±24)g，購自四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)中心實驗動物中心，生產(chǎn)許可證編號：SCXK(川)2009-09；使用許可證編號：SYXK(川)2009-045，動物批號：20100801、20120203。4月齡為成年對照組(ADU組)，不進行任何處理。將(22±1)月齡大鼠按體重配對原則隨機分為對照組(CON組)、大強度離心跑臺運動組(EE組)、缺氧預(yù)處理+離心跑臺運動組(HCP組)3組，每組20只。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后開始將HCP組進行缺氧預(yù)處理。根據(jù)氮氣稀釋空氣的原理，借用體外循環(huán)麻醉中使用的空氣/氧氣混合儀，改裝成空氣/氮氣混合儀，經(jīng)Datex氣體分析監(jiān)護儀標(biāo)定濃度，制成可快速地隨意調(diào)節(jié)氧氣濃度和氣體流量的供氣系統(tǒng)。調(diào)節(jié)空氣/氮氣混合器使氧濃度為10%。連續(xù)對HCP組大鼠進行7 d的缺氧預(yù)處理。具體的處理是每天用10%氧濃度處理大鼠30 min后以空氣復(fù)氧5 min，連續(xù)處理5次。末次預(yù)處理后EE組和HCP組進行一次性大強度下坡跑臺運動，速度19～21 m/min，坡度為-16，運動時間為90 min。運動中如大鼠不能堅持運動，取出休息2 min后繼續(xù)，運動時間足90 min。

1.2骨骼肌的取材與處理分別于運動后24、48 h 2個時間點隨機選取各組大鼠10只股靜脈放血處死，離心管收集靜脈血，將血樣離心(4℃,3 000 r/min,10 min)分離血清，測定血清白細(xì)胞介素(IL)-6、肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)含量；并迅速取右后肢比目魚肌，于比目魚肌中段切取部分肌肉組織，行多聚甲醛固定，用于制作石蠟切片，HE染色后觀察肌纖維結(jié)構(gòu)變化；取部分肌肉組織,快速稱重，按重量/體積(g/ml)=1∶10加入冰凍生理鹽水，制備勻漿，4℃低溫離心機4 000 r/min離心10 min，取上清液用于超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量的檢測。IL-6、CK、LDH、SOD、MDA的酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測試劑盒均購于南京建成生物工程研究所，采用Thermo Evolution 600紫外-可見分光光度計在450 nm波長比色。組織勻漿總蛋白濃度采用武漢博士德公司BCA蛋白定量試劑盒測定。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS17.0軟件行方差分析。

2結(jié)果

2.1大鼠骨骼肌HE染色觀察結(jié)果對EE組和HCP組大鼠骨骼肌HE染色后進行光鏡觀察。EE組標(biāo)本在運動后24 h出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤，出現(xiàn)肌膜模糊，局部肌絲變性，部分出現(xiàn)肌溶解。運動后48 h可見炎癥細(xì)胞浸潤嚴(yán)重，肌纖維明暗不清晰。HCP組運動后24 h、48 h均存在少量炎癥細(xì)胞浸潤，部分核聚集，橫紋模糊。HE染色結(jié)果顯示HCP組骨骼肌損傷情況較EE組減輕。

2.2各組大鼠血清IL-6、CK、LDH比較表1可見，在運動后兩個時間點，HCP組IL-6水平均高于CON組而低于EE組(P<0.05)。與CON組相比，EE組和HCP組大鼠運動后各時間點CK、LDH水平升高，其中在運動后48 h差異尤為顯著(P<0.01)。HCP組在運動后各時相血清CK、LDH濃度較EE組相比均有降低(P<0.05)。

2.3各組大鼠骨骼肌勻漿SOD、MDA水平比較在運動后24 h及48 h，HCP組MDA水平較CON組升高而較EE組降低(P<0.05)，EE組MDA水平在運動后各時相均高于CON組(P<0.05)。EE組肌肉組織SOD活性在運動后兩個時間點均顯著低于CON組和HCP組(P<0.05)，CON組和HCP組之間的SOD活性無顯著差異(P>0.05)。見表2。

表1　各組大鼠血清IL-6、CK、LDH比較

與同時點CON組比較：1)P<0.01；與同時點EE組比較：2)P<0.05

表2　各組大鼠骨骼肌勻漿SOD、MDA水平比較

與同時點CON組比較：1)P<0.05；與同時點EE組比較：2)P<0.05；與同時點HCP組比較：3)P<0.05

3討論

自由基代謝紊亂導(dǎo)致氧化應(yīng)激失調(diào)是EIMD機制研究的一個熱點。人體內(nèi)的自由基以氧自由基為主，內(nèi)源性抗氧化酶如SOD可清除氧自由基，從而保護細(xì)胞免受損傷。當(dāng)機體受到異常刺激導(dǎo)致抗氧化體系能力減弱時，大量未及時清除的氧自由基可攻擊生物膜中的不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng),導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化物如MDA的產(chǎn)生。因此，SOD活性降低和MDA水平升高，可表明氧自由基的大量生成以及生物膜遭到破壞。研究發(fā)現(xiàn)正常情況下老年人骨骼肌SOD活性和MDA水平會隨著年齡的增加而發(fā)生變化，導(dǎo)致機體抗氧化能力下降〔5〕，單純運動和衰老都能使活性氧增多，引起氧化應(yīng)激〔6〕，那么老年人運動勢必會導(dǎo)致更為強烈的氧化應(yīng)激。本研究結(jié)果說明老年大鼠骨骼肌損傷時機體抗氧化能力會進一步下降，而這可能是老年人容易發(fā)生運動性骨骼肌損傷且恢復(fù)較慢的原因之一。

前期的缺血/缺氧預(yù)處理可激發(fā)機體內(nèi)源性抗氧化能力從而對隨后到來的嚴(yán)重缺血、缺氧產(chǎn)生預(yù)防和保護作用。Saxena等〔7〕對大鼠采用氯化鈷進行低氧處理研究發(fā)現(xiàn)缺氧預(yù)處理的骨骼肌運動能力和抗氧化損傷能力明顯提升，同時也發(fā)現(xiàn)這種形式的低氧預(yù)處理能增強骨骼肌線粒體生成和有氧呼吸能力。本研究表明缺氧預(yù)處理能有效預(yù)防這種運動所致的骨骼肌損傷，前期的低氧刺激激發(fā)了機體防御系統(tǒng)，大大提高了其抗氧化能力，從而對抗離心運動導(dǎo)致的自由基增加所帶來的損傷。MDA作為脂質(zhì)過氧化的代表產(chǎn)物，是衡量機體自由基反應(yīng)強度的敏感指標(biāo)〔8〕。本研究說明低氧預(yù)刺激能夠有效控制大強度離心運動造成的自由基增加，對生物膜存在保護作用從而減少肌纖維的損傷。

然而，本研究發(fā)現(xiàn)缺氧預(yù)處理并未完全阻止骨骼肌損傷的發(fā)生，提示氧化應(yīng)激可能僅是EIMD產(chǎn)生的原因之一。有研究報道通過服用外源性抗氧化劑，能對運動性肌肉損傷產(chǎn)生一定的保護作用〔9～12〕，通過長期的有氧鍛煉也能提高衰老大鼠骨骼肌的抗氧化能力〔13〕。因此,預(yù)處理與其他預(yù)防措施如按摩、藥物、物理治療等有無聯(lián)合作用值得深入探討，而低氧預(yù)處理是否在老年人體上對運動性骨骼肌損傷的發(fā)生具有同樣的保護作用也有待于進一步研究。

綜上所述,本研究顯示，缺氧預(yù)處理可提高老年大鼠骨骼肌的抗氧化能力，對大強度下坡跑臺運動所致的老年大鼠運動性骨骼肌損傷有預(yù)防作用。

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〔2014-05-08修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)

基金項目：國家體育總局重點研究領(lǐng)域項目(2014B014)；國家體育總局運動醫(yī)學(xué)重點實驗室資助項目(2013CTYY02)；四川省教育廳資助科研項目(12ZB014)；四川省高?？蒲袆?chuàng)新團隊專項基金資助項目(KYTD201011)

中圖分類號〔〕R319；R873〔

文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2016)01-0005-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.01.002