桉葉抗氧化物分離純化及其抗氧化活性的研究

陳運(yùn)嬌，李 偉，陳洪璋，王俊亮，曹 庸＊

(1. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510642；2.廣東省天然活性物工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510642)

桉葉抗氧化物分離純化及其抗氧化活性的研究

陳運(yùn)嬌1,2，李 偉1,2，陳洪璋1,2，王俊亮1,2，曹 庸1,2＊

(1. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510642；2.廣東省天然活性物工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510642)

本文以DPPH自由基清除能力為指標(biāo)，采用Diaion HP-20大孔吸附樹脂、Toyopearl HW-40凝聚樹脂柱層析、HPLC液相及核磁共振等技術(shù)對桉葉中抗氧化活性成分進(jìn)行分離純化及鑒定，得到1,2,3,6-四沒食子酰葡萄糖和5-甲氧基糠醛，其中后者為首次在桉葉中分離得到。與抗氧化劑Trolox相比，兩者具有更強(qiáng)的DPPH自由基清除能力，尤其是1,2,3,6-四沒食子酰葡萄糖。

桉葉；DPPH自由基清除能力；1,2,3,6-四沒食子酰葡萄糖

生物體內(nèi)的活性氧(ROS)含量過高會引起氧化脅迫，而氧化脅迫被認(rèn)為與致癌作用、衰老和其他退化性疾病相關(guān)[1]?？寡趸瘎┛梢郧宄齊OS，阻止一系列的慢性疾病的發(fā)生[2]，因此抗氧化劑的研究越來越熱門。然而，人工合成抗氧化劑如BHA和BHT的使用常因產(chǎn)生一些副作用而受到質(zhì)疑[3]。因此，安全性更高的天然抗氧化劑的開發(fā)和利用成為研究熱點(diǎn)，從植物中提取抗氧化活性物質(zhì)受到越來越多的關(guān)注[4]。

桉樹(Eucalyptus)是世界三大速生樹種之一[5]，投產(chǎn)后每年產(chǎn)生大量桉葉廢棄物，研究發(fā)現(xiàn)桉葉具有抗氧化活性、抗腫瘤、抗菌、抗氧化和抑制HIV逆轉(zhuǎn)錄酶等多種活性功能[6]。在日本，桉葉提取物已被注冊為天然的食品添加劑[7]。作者團(tuán)隊(duì)已從巨尾桉(E.grandis×E.urophylla)廣林9號桉葉中提取到了9種具有抗氧化活性的化合物[8-9]，但仍還有許多組分待分離鑒定。因此，本文以廣林9號桉樹葉為研究對象，運(yùn)用抗氧化活性追蹤方法，對其抗氧化活性成分繼續(xù)進(jìn)行分離純化及鑒定，以期分離獲得有效的抗氧化劑，為桉葉的綜合利用提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試劑

提取、分離和純化溶劑為：乙醇、石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇和丙酮?？寡趸钚詫?shí)驗(yàn)溶劑為：DPPH(Sigma-Aldrich)。制備高效液相色譜和抗氧化活性實(shí)驗(yàn)的溶劑均為分析純。用于分析高效液相色譜法的溶劑為高效液相色譜級。

1.2 桉葉抗氧化物的提取、分離及純化

廣林九號桉葉采于廣東省茂名市林業(yè)局，自然陰干后粉碎備用。將桉葉水洗干凈，置于室內(nèi)自然陰干。把干葉磨成粉末，過40-60目篩的桉葉粉末1 kg，加入20倍體積的70%乙醇溶劑，超聲波提取兩次，每次30min，減壓抽濾，合并濾液，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溶劑后，用蒸餾水定容到1 L。

連續(xù)依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、水飽和正丁醇和水等不同極性溶劑進(jìn)行萃取，各種溶劑重復(fù)萃取5次。萃取物用減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后冷凍干燥，冷藏備用。從本團(tuán)隊(duì)前期研究[10]可得知，乙酸乙酯萃取物顯示出最強(qiáng)的清除能力，因此乙酸乙酯萃取物被用于進(jìn)一步的分離。稱取20 g乙酸乙酯萃取物溶解于用800mL蒸餾水中后上樣，以不同濃度的水-乙醇混合液梯度洗脫，流速為1 B·h-1，每個(gè)梯度洗脫5 BV，分步收集，合并同一梯度洗脫液，真空濃縮，冷凍干燥，檢測每個(gè)洗脫組分抗氧化活性。

1.3 高效液相色譜

1.3.1 分析液相分析方法

島津HPLC儀(LC-10AT二元高壓梯度儀，SPD-10A紫外檢測儀)；色譜柱為Diamonsil C18色譜柱(250mm×4.6mm，5 μm)；檢測波長270 nm，色譜洗脫條件0% ~ 90%甲醇(含有0.2%乙酸)梯度洗脫1 h，流速為1mL·min-1；進(jìn)樣量：20 μL。

1.3.2 分析樣品準(zhǔn)備

各分析樣品溶解于甲醇中，上樣前過濾(0.45 μm)。稱取定量分析樣品，加甲醇溶解，過0.45 μm微孔濾膜后。用微量進(jìn)樣器精密吸取20 μl進(jìn)行分析測定。

1.3.3 制備液相條件

島津HPLC儀(LC-8A HPLC二元高壓梯度儀，SPD-10A紫外檢測儀)；色譜柱為島津Shim-pack ODS型C18柱(250mm×20mm, 5 μm)；檢測波長270 nm，色譜洗脫條件根據(jù)分析液相分析的最佳分離條件，流速為12-15 1mL·min-1。

1.4 DPPH自由基清除能力的測定

參照Kumaran等[11]方法并做一定的修改。樣品溶解于水或甲醇，稀釋成將一系列濃度的溶液。將0.2mL溶液加入DPPH溶液(3.8mL，1×10-4mol·L-1)中搖勻，在室溫下密閉靜置30min，用純?nèi)軇┳鲄⒈?，?17 nm波長下測定吸光度A值。根據(jù)下列公式計(jì)算每種提取液對DPPH自由基的清除率：

式中：A1為0.2mL提取液加入DPPH溶液的吸光度；A2為0.2mL提取液加入DPPH溶劑(甲醇)后的吸光度；A0為0.2mL DPPH溶劑(甲醇)+3.8mL DPPH溶液的吸光度。根據(jù)回歸方程求出清除率達(dá)50%時(shí)的化合物濃度即半清除率濃度IC50。

1.5 核磁共振分析

核磁共振用美國Varian INOVA儀器進(jìn)行。

1.6 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。所有結(jié)果表示為均值±誤差(n=3)。數(shù)據(jù)用單向方差分析(P<0.05) (SPSS 13) 。

2 結(jié)果與分析

2.1 Diaion HP-20大孔吸附樹脂分離組分清除DPPH·能力

從作者團(tuán)隊(duì)的前期研究[10]可得知，石油醚、氯仿、乙酸乙酯、水飽和正丁醇和水5種溶劑的桉葉萃取物中，乙酸乙酯萃取物顯示出最強(qiáng)的DPPH自由基清除能力(半清除率濃度為97 μg·mL-1)，因此乙酸乙酯萃取物被用于進(jìn)一步的分離。稱取20g乙酸乙酯萃取物用水最大濃度溶解上樣，分別以水及10%、15%、20%、24%、30%、50%、70% 的乙醇對桉葉乙酸乙酯組分進(jìn)行洗脫分離，每個(gè)濃度洗脫5個(gè)柱體積，并將洗脫液收集在一起，得到的組分依次命名為：P0、P10、P15、P20、P24、P30、P50和P70。接著采用分析液相方法對每個(gè)洗脫組分成分進(jìn)行分析并檢測其清除DPPH自由基能力，結(jié)果如圖1和圖3。由圖3可知，Diaion HP-20大孔吸附樹脂對桉葉抗氧化物有較好的分離效果。P0組分成分較簡單，可對其進(jìn)行制備分離后進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，P10－P30組分物質(zhì)出峰時(shí)間主要在35min以前；P50和P70組分物質(zhì)出峰時(shí)間主要在35 ~ 45min。各洗脫組分對DPPH自由基的清除能力強(qiáng)弱順序?yàn)椋篜0＞P24＞P15＞P10＞P30＞P20＞P70＞P50，因此前6個(gè)組分顯示出較強(qiáng)的DPPH自由基清除能力?；钚越M分P0、P15 和P24分別純化得到了沒食子酸、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷和l，2，3，4，6-五沒食子?；咸烟荹8]。因此本文對活性組分P10和P20繼續(xù)進(jìn)行分離純化其他組分。

2.2 組分P10和P20的分離純化

用Toyopearl HW-40凝膠樹脂繼續(xù)分離成分較復(fù)雜組分P10，并選用以甲醇、蒸餾水和丙酮按不同配比的混合溶劑(比值分別為1:9:0、3:7:0、5:5:0、 7:3:0、8:1:1、6:2:2)進(jìn)行洗脫，收集各亞組分并命名為PH10、PH30、PH50、PH70、PH811、PH622。接著采用分析液相方法對每個(gè)洗脫組分成分進(jìn)行分析，并檢測其清除DPPH自由基能力，結(jié)果如圖2和圖4。Toyopearl HW-40凝膠樹脂對P10組分有一定的分離效果，且分離后，所得各組分峰較少，所得組分成分相對比較簡單。6個(gè)亞組分的DPPH自由基清除率大小順序?yàn)椋篜H50＞PH811＞PH70＞PH622＞P10＞VC＞PH10。亞組分的PH50比分離前組分P10、維生素C及其他組分表現(xiàn)更高的清除能力。根據(jù)抗氧化活性強(qiáng)弱，亞組分PH50和組分P20用制備液相進(jìn)一步分離純化分別得到化合物A和化合物B。

圖1 乙酸乙酯萃取物不同洗脫組分的抗氧化能力以半清除率濃度IC50(μM)表示。

圖2 活性組分P10洗脫亞組分的DPPH自由基清除率(0.1mg·mL-1)

圖3 乙酸乙酯萃取物經(jīng)Diaion HP-20大孔吸附樹脂分離后的不同洗脫組分的液相圖譜

圖4 P10組分經(jīng)Toyopearl HW-40凝膠樹脂分離后的不同洗脫組分的液相圖譜(270 nm)

2.3 化合物A 和B的結(jié)構(gòu)鑒定

化合物A為紅褐色油狀物質(zhì)。1H-NMR (600 MHz，CD3OD): δ 9.49 (1H, s, CHO), 7.49 (1H, d, J=3.6HZ, H-3), 6.65 (1H, d, J=3.6HZ, H-4), 4.64(3H, s, OCH3);13C-NMR (150 MHz，CD3OD):δ 180.8 (s, CHO), 163.0 (s, C-5), 153.2 (s, C-2), 111.6 (d, C-3), 101.2 (d, C-4), 57.3 (s, OCH3)。與文獻(xiàn)[12]比較，化合物A被鑒定為5-甲氧基糠醛(圖5)，該化合物為首次從桉葉中分離得到。

圖5 5-甲氧基糠醛的液相圖譜和化學(xué)結(jié)構(gòu)

化合物B為無定形黃色粉末。1H-NMR (600 MHz，CD3OD): δ 7.13, 7.04, 7.03, 6.94( each 2H, s, galloyl×4), 6.09 (1H, d, J=8.4HZ, glu-H-1), 5.45(1H, dd, J=8.4HZ, 9.6HZ, glu-H-2), 5.57(1H, dd, J=9.6HZ, 9.6HZ, glu-H-3), 3.97 (1H, dd, J=9.6HZ, 9.0HZ, glu-H-4), 4.01-4.04 (1H,m, glu-H-5), 4.61 (1H, dd, J=1.7HZ, 12.0HZ, glu-H-6’), 4.51 (1H, dd, J=4.2HZ, 12.0HZ, glu-H-6)。13C-NMR (150 MHz, CD3OD): δ 121.3, 121.0, 120.4, 119.8 [galloyl×4, C-1’], 110.7 (2×), 110.5 (2×), 110.4(2×), 110.2(2×) [ galloyl×4, c-2’, 6’], 146.6(2×), 146.5(2×), 146.4(2×), 146.3(2×) [galloyl×4, C-3’, 5’], 140.7, 140.2, 140.0, 139.9 [ galloyl×4, C-4’], 168.2, 167.8, 167.2, 166.4 [galloyl×4, -COO-], 93.9 (glu-C-1), 72.4 (glu-C-2), 76.5 (glu-C-3), 69.7 (glu-C-4), 76.6 (glu-C-5), 64.0 (glu-C-6)。通過對照核磁共振數(shù)據(jù)，該數(shù)據(jù)與1,2,3,6-四沒食子酰葡萄糖數(shù)據(jù)基本一致(圖6)[13]。

圖6 1,2,3,6-四沒食子酰葡萄糖液相圖譜和化學(xué)結(jié)構(gòu)

2.4 5-甲氧基糠醛和1,2,3,6-四沒食子酰葡萄糖清除DPPH 自由基能力比較

5-甲氧基糠醛和1,2,3,6-四沒食子酰葡萄糖在一定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，濃度越高，其清除率越高，抗氧化活性越強(qiáng)。兩種化合物對DPPH自由基的半清除率濃度IC50見表1。半清除率濃度IC50越高，其抗氧化活性越低，因此5-甲氧基糠醛和1,2,3,6-四沒食子酰葡萄糖兩者的清除能力(IC50分別是451.9 μM)均高于對照組維生素E水溶性類似物Trolox(IC50=451.9 μM)的清除能力。與作者團(tuán)隊(duì)在桉葉中純化到的化合物相比，1,2,3,6-四沒食子酰葡萄糖比1,2,3,4,6-O-五沒食子酰葡萄糖和特里馬素Ⅱ的抗氧化活性弱，但比水楊梅丁素、特里馬素Ⅰ和英國櫟鞣花素的抗氧化活性強(qiáng)[7]，因此1,2,3,6-四沒食子酰葡萄糖是有較好發(fā)展前景的天然抗氧化劑。

表1 5-甲氧基糠醛和1,2,3,6-四沒食子酰葡萄糖對DPPH自由基的IC50值

3 小結(jié)與討論

(1) 劉延澤等[14]采用Dianion HP-20和Toyopearl HW-40等新型樹脂反復(fù)柱層析從石榴皮中分離到安石榴林、安石榴苷、2,3-(S)-六羥基聯(lián)苯二甲酰基-D-葡萄糖、石榴皮亭B和逆沒食子酸五個(gè)化合物。呂潔麗等[15]報(bào)道Dianion HP-20和Toyopearl HW-40等新型樹脂對鞣質(zhì)及多元酚分離效果甚佳。從本研究可知，桉葉乙酸乙酯萃取物經(jīng)Diaion HP-20大孔吸附樹脂分離后，抗氧化活性有很大差異，從分析液相圖譜可以看出，經(jīng)大孔樹脂分離后有很好的分離效果。而經(jīng)大孔樹脂分離后的組分經(jīng)Toyopearl HW-40樹脂分離后的組分抗氧化活性和組分成分也有很大差異，因此Dianion HP-20和Toyopearl HW-40等新型樹脂對桉葉抗氧化活性物質(zhì)具有很好的分離效果。對通過分離到的物質(zhì)結(jié)構(gòu)鑒定為鞣質(zhì)及多元酚類，這也與這些樹脂適合鞣質(zhì)及多元酚的分離相符。

(2) 根據(jù)活性跟蹤方法對桉葉抗氧化組分繼續(xù)分離純化，最終鑒定出2種抗氧化活性物質(zhì)，即5-甲氧基糠醛和1,2,3,6-四沒食子酰葡萄糖。其中5-甲氧基糠醛為首次從桉葉中分離得到。桉葉提取物含有豐富的抗氧化活性物質(zhì)，Amakura等[16]研究了藍(lán)桉(E.globulus)葉提取物中主要抗氧化活性物質(zhì)，通過HPLC色譜比較了桉葉提取物與日本兩種桉葉食品添加劑中的化學(xué)成分，確定乙酸乙酯萃取相與抗氧化食品添加劑成分相似，最后分離出18中活性單體，結(jié)構(gòu)確定為多酚類，但并未分離到日本桉葉提取物添加劑的主要抗氧化成分β型二元黃酮類。Amakura等[17]從桉葉中提到分離到8種具有抗氧化活性的化合物。本團(tuán)隊(duì)從桉葉提取到的9種化合物均表現(xiàn)出抗氧化活性，特別是1,2,3,4,6-O-五沒食子酰葡萄糖[8]。因此，桉葉富含大量總酚物質(zhì)，可作為開發(fā)抗氧化物質(zhì)的豐富和寶貴的資源。

(3) 目前，天然抗氧化劑已廣泛應(yīng)用于以下4個(gè)方面：①用作食品添加劑，主要的功能是防止或減慢食品發(fā)生氧化作用，提高食品的穩(wěn)定性，延長貨架期；②用于保健食品，主要功能是消除自由基或阻抑自由基的活動，從而起到防老抗衰、抑制腫瘤的發(fā)生、防止心腦血管疾病、增強(qiáng)免疫功能的作用；③用于化妝品，有防止皮膚衰老，美容養(yǎng)顏的作用；④用于新藥品，治療心腦血管病、抗癌等。過去由于天然抗氧化劑生產(chǎn)成本高，受價(jià)格低廉的合成抗氧化劑沖擊，一直未商品化。隨著時(shí)代的發(fā)展，人們意識到化學(xué)合成物對食品的污染，因而對天然產(chǎn)物的渴望越來越強(qiáng)烈。近十多年來，人們對茶多酚、迷迭香醚等提取工藝進(jìn)行了深入的研究，相繼開發(fā)出比合成抗氧化劑活性更強(qiáng)的天然產(chǎn)品。但目前能夠?qū)崿F(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的天然抗氧化劑有天然VE、迷迭香提取物、茶多酚、甘草抗氧化物、磷脂等。在“崇尚綠色、回歸自然”的21世紀(jì)，隨著人們安全意識的增強(qiáng)，天然抗氧化劑的使用會日趨普遍。天然抗氧化劑具有很大的發(fā)展空間。本文從桉葉提取物中分離純化鑒定出5-甲氧基糠醛和1,2,3,6-四沒食子酰葡萄糖，其中1,2,3,6-四沒食子酰葡萄糖比Trolox、水楊梅丁素、特里馬素Ⅰ和英國櫟鞣花素等抗氧化物的清除能力強(qiáng)，是有較好發(fā)展前景的天然抗氧化劑。因此，本文為桉葉資源的綜合開發(fā)提供指導(dǎo)，為桉葉抗氧化物的工業(yè)化生產(chǎn)提取了理論基礎(chǔ)。

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The Isolation and Purification of Compounds fromEucalyptusLeaves and Their Antioxidant Activity

CHEN Yun-jiao1,2, LI Wei1,2, CHEN Hong-zhang1,2,WANG Jun-liang1,2, CAO Yong1,2
(1.College of Food Science,South China Agricultural University,Guangzhou510642,Guangdong,China; 2.Guangdong Province Engineering Research Center for Bioactive Natural Products,Guangzhou510642,Guangdong,China)

An activity-guided isolation process was conducted to identify the composition of extracts from leaves ofEucalyptusgrandis×E.urophyllaclone GL9. The compounds 5-methoxyfurfural and 1,2,3,6-tetra-O-galloyl-β-D-glucose (TGG) were isolated and identified by Diaion HP-20, Toyopearl HW-40 column chromatography, repeated preparative HPLC and NMR, and 5-methoxyfurfural was isolated fromEucalyptusleaves for the first time. Both compounds showed higher DPPH free radical scavenging ability than trolox, especially for TGG. The study has a very important theoretical role for guiding exploitation ofEucalyptusleaves as sources of valuable antioxidant compounds.

Eucalyptusleaves;DPPH free radical scavenging ability;1,2,3,6-tetra-O-galloyl-β-D-glucose

TS201

A

廣東省自然科學(xué)基金博士啟動項(xiàng)目(2015A030310118)；廣東省自然科學(xué)基金自由申請項(xiàng)目(2016A030313394)；廣東省教育廳科研項(xiàng)目(平臺)(2013gjhz0003)

陳運(yùn)嬌(1984— )，女，講師，主要從事天然活性物分離純化與抗氧化、抗衰老活性及其機(jī)制研究.E-mail: yunjiaochen@scau.edu.cn

＊通訊作者：曹庸(1966— )，男，博士，教授，主要從事天然活性物質(zhì)提取、分離、鑒定及活性評價(jià)研究.E-mail: caoyong2181@scau.edu.cn