維藥鐵線蕨總黃酮抗炎平喘作用研究

阿迪拉木·阿依甫江， 麥合蘇木·艾克木， 古孜力努爾·依馬木， 阿不都熱依木·玉蘇甫

(1新疆醫(yī)科大學維吾爾醫(yī)學院， 烏魯木齊　830011；2新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)民族醫(yī)藥管理局， 烏魯木齊　830001)

維藥鐵線蕨總黃酮抗炎平喘作用研究

阿迪拉木·阿依甫江1， 麥合蘇木·艾克木1， 古孜力努爾·依馬木1， 阿不都熱依木·玉蘇甫2

(1新疆醫(yī)科大學維吾爾醫(yī)學院， 烏魯木齊830011；2新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)民族醫(yī)藥管理局， 烏魯木齊830001)

摘要:目的研究維藥鐵線蕨總黃酮(Total Flavones from Adiantum capillus-veneris L.，TFAV)的抗炎平喘作用。方法將實驗動物昆明種小鼠隨機分為TFAV低、中、高劑量組(0.1、0.2、0.4 g/kg體質(zhì)量)和生理鹽水組、陽性對照組(急支糖漿)，采用小鼠耳廓二甲苯致炎法、小鼠氨水引咳法、小鼠氣管酚紅排泌法觀察TFAV的抗炎、止咳、化痰作用。將實驗動物豚鼠隨機分為TFAV低、中、高劑量組(0.061、0.122、0.244 g/kg體質(zhì)量)和生理鹽水組、陽性對照組(氨茶堿，0.025 g/kg體質(zhì)量)，采用整體動物藥物引喘法觀察TFAV的平喘作用。以昆明種小鼠為實驗動物，按最大給藥量法(藥物最大濃度為0.5 g/mL，最大劑量為0.04 mL/g)灌胃給藥，連續(xù)觀察15 d，評價鐵線蕨總黃酮單次口服給藥的安全性。并根據(jù)單次口服給藥的安全性結(jié)果，將60只昆明種小鼠隨機分為實驗Ⅰ、Ⅱ組和空白對照組，灌胃給藥，連續(xù)觀察7 d，測定出最大給藥量。結(jié)果與空白對照組比較，TFAV能顯著抑制小鼠耳廓腫脹(P<0.05)；TFAV能延長小鼠咳嗽潛伏期(P<0.05)，并減少咳嗽次數(shù)(P<0.05)；TFAV可促進小鼠氣管酚紅分泌量(P<0.05)；可延長豚鼠哮喘潛伏期(P<0.05)。急性毒性實驗中未出現(xiàn)中毒反應及死亡。小鼠口服TFAV最大給藥量為40 g/kg體質(zhì)量，相當于60 kg體質(zhì)量成人臨床生藥日用量的160倍。結(jié)論TFAV具有良好的抗炎、鎮(zhèn)咳、祛痰及平喘作用；TFAV口服急性毒性小，安全性高。

關(guān)鍵詞：鐵線蕨總黃酮； 抗炎； 止咳； 祛痰； 平喘； 急性毒性

鐵線蕨(Adiantum capillus-veneris L.)為鐵線蕨科鐵線蕨的全草，其分布廣泛，在中國主要分布于長江以南各省區(qū)，北達陜西、甘肅和河北等地。在新疆主要產(chǎn)于北部(阿勒泰地區(qū))山區(qū)[1]。鐵線蕨是維吾爾醫(yī)常用藥材，是維吾爾醫(yī)復方制劑異常黑膽質(zhì)成熟劑的組成藥之一，其具有消炎解毒、止咳化痰、平喘利肺、消腫止痛等功效，臨床上常用于哮喘、胸肺黏稠性頑疾、肺炎、頭痛胸痛、氣喘氣短、久咳痰多、發(fā)燒等癥[2]。有研究報道，鐵線蕨提取物具有抗炎、止咳、祛痰、平喘等作用[3]。但對其活性成分及治療哮喘等呼吸系統(tǒng)疾病的作用機理等方面的研究尚未見報道。本研究通過相關(guān)的藥理實驗探討TFAV的抗炎、止咳、祛痰、平喘及急性毒性作用，闡明鐵線蕨治療哮喘等呼吸系統(tǒng)疾病的物質(zhì)基礎(chǔ)，評價其安全性，旨在為鐵線蕨資源的開發(fā)和利用提供科學依據(jù)。

1材料與方法

1.1儀器與試劑電熱恒溫水浴鍋(北京市光明醫(yī)療儀器有限公司，DZKW-S-4)，電子天平(上海舜宇恒平科學儀器有限公司，XS1003S)，UV-240型分光光度計(上海棱光技術(shù)有限公司,GD5410023)，數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司，KQ3200DE)。二甲苯(天津市福晨化學試劑廠，批號：20131124)，急支糖漿(太極集團重慶涪陵制藥廠有限公司，批號：141011248)，濃氨水(天津市福晨化學試劑廠，批號：20140327)，氯化乙酰膽堿(國藥集團化學試劑有限公司，批號：131126)，磷酸組胺(上海源葉生物科技有限公司，批號：20131009)，氨茶堿(山西云鵬制藥有限公司，批號：B141101)，苯酚紅、碳酸氫鈉(分析純)。

1.2實驗動物昆明種小鼠(體質(zhì)量為18～22 g)、豚鼠(體質(zhì)量為160～200 g)均為清潔級，由新疆醫(yī)科大學實驗動物中心提供[生產(chǎn)許可證：SYXK(新)2011-0001]。

1.3實驗藥材鐵線蕨全草藥由新疆維吾爾醫(yī)院門診藥房提供，經(jīng)新疆維吾爾醫(yī)院制劑中心質(zhì)檢部主任藥師艾尼外爾·塔力甫鑒定為鐵線蕨科鐵線蕨(Adiantum capillus-veneris L.)的全草(批號：20141002)。總黃酮粉末由本課題組前期對鐵線蕨全草采用50%乙醇回流提取，經(jīng)大孔樹脂和聚酰胺純化而得，總黃酮質(zhì)量分數(shù)>50%。

1.4實驗方法

1.4.1小鼠耳廓二甲苯致炎實驗[4]昆明種小鼠50只，隨機分成5組：空白對照組(0.9%氯化鈉溶液)、陽性對照組(急支糖漿，5.0 g/kg體質(zhì)量)及 鐵線蕨總黃酮(TFAV)低、中、高劑量組(0.1、0.2、0.4 g/kg體質(zhì)量)，每組10只，雌雄各半。連續(xù)灌胃給藥7 d，灌胃體積均為0.02 mL/g。末次給藥后30 min，于小鼠右耳兩側(cè)均勻涂布二甲苯0.03 mL致炎，左耳不涂作為對照。致炎1 h后頸椎脫臼處死小鼠，以直徑為8.00 mm的打孔器取雙耳對稱耳片，精密稱取，以左、右耳片重量差為腫脹程度，計算腫脹抑制率：

抑制率=(平均腫脹度空白對照組-平均腫脹度給藥組)/平均腫脹度空白對照組×100%

1.4.2小鼠氨水引咳實驗[5]昆明種小鼠50只，雄雌各半，隨機分為5組：空白對照組(0.9%氯化鈉溶液)、陽性對照組(急支糖漿，5.0 g/kg體質(zhì)量)及TFAV低、中、高劑量組(劑量同“1.4.1”項下)，每組10只。連續(xù)灌胃給藥7 d。于末次給藥后1 h，將小鼠放入體積為2.5 L的密閉的玻璃鐘罩內(nèi)，用氨水(濃度為25%)噴霧，每次5 s，以小鼠出現(xiàn)咳嗽的時間(從噴霧開始到小鼠出現(xiàn)咳嗽的時間)、咳嗽次數(shù)(5 min內(nèi)的咳嗽次數(shù))為觀察指標。

1.4.3小鼠氣管酚紅排泌實驗[6]昆明種小鼠50只，隨機分為5組：空白對照組(0.9%氯化鈉溶液)、陽性對照組(急支糖漿，5.0 g/kg體質(zhì)量)及TFAV低、中、高劑量組高(劑量同“1.4.1”項下)，雄雌各半，每組10只。連續(xù)灌胃給藥7 d，于末次給藥后30 min，腹腔注射5 g/L酚紅生理鹽水溶液0.01 mL/g，30 min后處死動物，仰位固定，解剖分離出氣管，分別放入預先盛有2.0 mL 5% NaHCO3溶液的試管中，超聲波清洗15 min，使氣管段中的苯酚紅完全釋放，離心，取上清液，用分光光度計于560 nm處比色，測定OD值，折算成酚紅含量。

1.4.4整體動物藥物引喘法[7]取健康豚鼠60只，雄雌兼用，體質(zhì)量150～200 g，先將豚鼠分別置于2.5 L的玻璃鐘罩內(nèi)，以恒壓噴入2%氯化乙酰膽堿和0.1%組胺等溶劑混合液15 s引喘，噴霧停止后立即觀察豚鼠出現(xiàn)喘息性抽搐的潛伏期(即從噴霧開始到哮喘發(fā)作，直至抽搐跌倒的時間)，選擇潛伏期小于120 s的豚鼠用于正式實驗，并以此作為給藥前潛伏期。挑選合格動物，隨機分為5組：空白對照組(0.9%氯化鈉溶液)、陽性對照組(氨茶堿，125 mg/kg體質(zhì)量)及TFAV低、中、高劑量組(0.061、0.122、0.244 g/kg體質(zhì)量)。連續(xù)灌胃給藥7 d，于末次給藥后1 h分別置于2.5 L的玻璃鐘罩內(nèi)，用上述的引喘方法引喘，記錄豚鼠的引喘潛伏期，超過360 s以360 s計算。

1.5急性毒性實驗

1.5.1預實驗[8]取昆明種小鼠20只，雌雄各半，隨機分為實驗組與對照組，每組10只。適應性飼養(yǎng)3 d。給藥前禁食不禁水14 h，稱重。實驗組按最大給藥濃度(0.5 g/mL)和最大劑量(0.04 mL/g)一次灌胃TFAV。對照組灌胃等量的生理鹽水。給藥后再禁食2 h并立即觀察動物反應，包括飲食、活動、體毛、排泄、精神狀態(tài)等情況。連續(xù)定時觀察15 d，詳細記錄期間小鼠死亡數(shù)和一般情況。觀察給藥前后第0、1、3、5、7、9、11、13天及處死之前小鼠體質(zhì)量變化情況。第14天將全部動物處死、解剖，檢查主要臟器有無異常病變情況。

1.5.2最大給藥量的測定[9]昆明種小鼠60只，隨機分成3組：實驗Ⅰ、Ⅱ組與空白對照組，每組20只，雌雄各半。給藥前禁食不禁水14 h，稱重。實驗組以最大給藥濃度(0.5 g/mL)和最大給藥劑量(0.04 mL/g)灌胃，其中實驗I組每日1次，實驗Ⅱ組每日2次灌胃，間隔為8 h，灌胃1 d?？瞻讓φ战M灌胃等量的生理鹽水。連續(xù)定時觀察7 d。詳細觀察并記錄小鼠的飲食、活動、體毛、排泄、精神狀態(tài)以及給藥前后0、3、5 d和處死之前小鼠體質(zhì)量變化情況。第7天將小鼠全部處死、解剖，檢查主要臟器有無異常病變情況，計算最大給藥量。

1.6統(tǒng)計學方法采用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(-x±s)表示。兩組間比較采用t檢驗，多組比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1小鼠耳廓二甲苯致炎實驗結(jié)果與空白對照組比較，陽性對照組及TFAV高劑量組小鼠耳廓腫脹度差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；TFAV低、中、高劑量組的腫脹抑制率隨劑量的增加而升高，見表1。

表1　TFAV對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響(-x±s, n=10)

注：與空白對照組比較，*P<0.05。

2.2小鼠氨水引咳實驗結(jié)果與空白對照組比較，陽性對照組及TFAV中、高劑量組小鼠咳嗽反應的潛伏期及咳嗽次數(shù)差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05~0.01)，見表2。

表2　鐵線蕨總黃酮對小鼠咳嗽反應的影響(-x±s, n=10)

注：與空白對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.3小鼠氣管酚紅排泌實驗結(jié)果酚紅的標準曲線為Y=193.66X-0.001 52，r=0.999 4。與空白對照組比較，陽性對照組和TFAV中、高劑量組小鼠氣管酚紅排泄量差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3。

表3　鐵線蕨總黃酮對氣管酚紅排泄量的影響(-x±s, n=10)

注：與空白對照組比較*P<0.05。

2.4整體動物藥物引喘法結(jié)果與空白對照組比較，陽性對照組及TFAV中、高劑量組豚鼠的引喘潛伏期差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，與給藥前比較，陽性對照組及TFAV低、中、高劑量組豚鼠的引喘潛伏期差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表4。

表4豚鼠噴霧致喘實驗(-x±s, n=10)

組別劑量/(g/kg體質(zhì)量)引喘潛伏期/s給藥前給藥后空白對照組-73.4±10.973.2±10.6陽性對照組0.12577.7±17.5102.0±20.4*#TFAV低劑量組0.178.2±18.980.3±23.7#TFAV中劑量組0.270.6±15.187.1±14.4*#TFAV高劑量組0.474.0±12.195.6±13.5*#

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與給藥前比較，#P<0.05。

2.5急性毒性預實驗通過預實驗發(fā)現(xiàn)，最大給藥量法灌胃給藥觀察14 d，實驗組小鼠外觀、飲食狀況、呼吸及四肢活動正常，未見異常分泌物，無一只死亡。各組小鼠平均體質(zhì)量顯著增長(P<0.01)。與對照組相比，實驗組小鼠毛發(fā)更為光亮。解剖小鼠，與對照組相比，實驗組小鼠主要臟器未出現(xiàn)肉眼可見的明顯病變,見表5。

2.6急性毒性實驗最大給藥量的測定預實驗過程中未見小鼠出現(xiàn)明顯的中毒癥狀，測不出LD50，因此進行最大給藥量的測定。實驗Ⅱ組第2次灌胃后小鼠出現(xiàn)不動、臥等體征，但無抽搐、驚厥等異?，F(xiàn)象，灌胃后1～3 h后逐步恢復正常。給藥后第2天實驗Ⅱ組小鼠明顯興奮、不靜。與對照組比較，實驗I、Ⅱ組小鼠在飲食、外觀、精神狀態(tài)方面無明顯差異。7 d后解剖，發(fā)現(xiàn)主要臟器未出現(xiàn)肉眼可見的明顯病變。各組小鼠體質(zhì)量明顯增加(P<0.05)，但各組體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。小鼠口服TFAV 最大給藥量為每天40 g/kg體質(zhì)量，見表6、7。

表5　TFAV對小鼠體質(zhì)量的影響(-x±s, n=10)

表6　TFAV耐受量實驗小鼠體質(zhì)量變化(-x±s, n=20)

表7　TFAV急性毒性實驗小鼠反應情況

3討論

鐵線蕨是維吾爾醫(yī)常用藥材，全草入藥，主要含黃酮類、揮發(fā)油、三萜類、糖類、甾體類等化學成分，具有消炎解毒、止咳化痰、平喘利肺、消腫止痛等功效。鐵線蕨對哮喘等呼吸系統(tǒng)疾病的治療效果顯著。呼吸系統(tǒng)疾病的臨床表現(xiàn)有氣道高反應、黏液高分泌以及可逆性的氣流受限，氣道的慢性非特異性炎癥是其基本的病理變化[10]。本研究顯示，在急性炎癥模型中，TFAV高劑量能顯著地抑制小鼠耳廓腫脹(P<0.05)，抑制率隨著劑量的增加而升高，說明TFAV對炎癥反應所致的呼吸系統(tǒng)疾病有一定治療作用。本實驗應用化學刺激法，用濃氨水霧化吸入，刺激小鼠副交感神經(jīng)系統(tǒng)引發(fā)咳嗽，結(jié)果表明TFAV中、高劑量對氨水引發(fā)的咳嗽具有顯著的拮抗作用(P<0.05)，能延長濃氨水誘導的小鼠咳嗽潛伏期，減咳嗽次數(shù)，表明其具有明顯的止咳作用。痰液是引起咳嗽的重要因素之一，呼吸道上所積累的痰狀物質(zhì)會刺激黏膜引起咳嗽。因此通過稀釋痰液，改善呼吸道分泌物的增加，可以揮發(fā)祛痰作用[5]。本實驗采用小鼠氣管酚紅分泌法觀察TFAV的祛痰作用，結(jié)果表明TFAV中、高劑量明顯增加小鼠氣管的酚紅排泌量(P<0.05)，提示TFAV增加氣管分泌液，使呼吸道分泌物利于咳出，從而達到化痰作用。在組胺-乙酰膽堿致豚鼠哮喘實驗中，TFAV中、高劑量均能明顯延長豚鼠哮喘的潛伏期(P<0.05)，提示TFAV通過拮抗組胺、氯化乙酰膽堿對氣管平滑肌的痙攣作用，抑制氣道反應性，從而發(fā)揮平喘作用。

藥物安全性評價是判斷新藥安全性的關(guān)鍵。急性毒性實驗可以為藥物對機體的毒效應提供初步資料[11]。本研究通過急性毒性實驗發(fā)現(xiàn)，15 d內(nèi)各組小鼠飲食和活動狀況良好，未出現(xiàn)中毒反應及死亡。單次灌胃的最大劑量達到20 g/kg體質(zhì)量，超過了安全劑量(10 g/kg體質(zhì)量)[7]，由此證明TFAV急性毒性實驗是安全的。實驗組小鼠毛發(fā)更為光亮，TFAV可能有促毛發(fā)生長的作用。通過最大給藥量實驗發(fā)現(xiàn)給藥后第2天實驗Ⅱ組小鼠明顯興奮、

不靜，由此可見TFAV可能有興奮作用。小鼠最大給藥量為40 g/kg體質(zhì)量，相當于60 kg體質(zhì)量成人臨床生藥日用量的160倍。

綜上所述，本研究結(jié)果提示，TFAV具有良好的抗炎、止咳、化痰、平喘作用，說明黃酮類成分是鐵線蕨治療哮喘等呼吸系統(tǒng)疾病的活性部位之一，本研究結(jié)果為鐵線蕨的臨床應用提供了一定依據(jù)，但其作用機理有待進一步研究。雖然TFAV急性毒性實驗結(jié)果顯示其安全性較高，但其觀察時間較短，還需要進一步進行長期毒性實驗，以保證臨床用藥的安全性。

參考文獻:

[1]新疆維吾爾自治區(qū)衛(wèi)生廳.維吾爾藥材標準[S].烏魯木齊:新疆科技衛(wèi)生出版社,1993:297.

[2]中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會.中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準[S].烏魯木齊:新疆科技衛(wèi)生出版社,1999：78.

[3]Ibraheim ZZ, Ahmed AS, Gouda YG. Phytochemical and biological studies of Adiantum capillus-veneris L. [J]. Saudi Pharmaceutical J, 2011, 19(2):65-74.

[4]麥合蘇木·艾克木,努爾江·肉孜,于洋.維藥神香草乙酸乙酯部位的抗炎、止咳、化痰、祛痰及平喘作用研究[J]. 中國民族醫(yī)藥雜志,2014,20(4):39-42.

[5]陳曉芳,張倩,吳文倩,等.枇杷花醇提物止咳化痰作用實驗研究[J].中成藥,2013,35(1):167-169.

[6]王丹,向陽,常軍民.天山花楸平喘膠囊鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘、抗炎及免疫作用研究[J].中國實驗方劑學雜志,2013,19(23):262-265.

[7]張宏濤,張淑鋒,陳雪蓮,等.瘤果黑種草子總黃酮抗炎及平喘作用[J]. 中國實驗方劑學雜志,2014,20(1):166-169.

[8]楊鴻,吳彥,劉釗,等.抗氧化中藥有效組分復方的急性毒性及致突變性研究[J].中國實驗方劑學雜志,2014,20(12):185-189.

[9]姜華,張麗,黃聰琳,等. 藏藥鐮形棘豆總黃酮苷元急性毒性實驗研究[J].西部中醫(yī)藥,2013,26(8):50-52.

[10]史鎖芳,楊興蟋,李萍.平喘顆粒藥效學及抗炎機理研究[J].中國中醫(yī)急癥,2014,23(6):1056-1059.

[11]周立國.藥物毒理學[M].北京：中國醫(yī)藥出版社,2003:146-162.

(本文編輯施洋)

·基礎(chǔ)醫(yī)學研究·

·民族腫瘤學·

Anti-inflammatory and anti-asthmatic effects of total flavones from

Adiantum capillus-veneris L. on animal models

Ayupjan Adila1, Ekim Mahsum1, Iman Guzalnur1, Yusup Abduriyim2

(1InistituteofTraditionalUyghurMedicine,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China；

2AdministrationBureauofTraditionalChineseMedicineandEthnicGroupMedicineof

XinjiangUyghurAutonomousRegion,Urumqi830001,China)

Abstract：ObjectiveTo evaluate the anti-inflammatory and anti-asthmatic effects of total flavones from Adiantum capillus-veneris L. (TFAV). MethodsThe Kunming mice were randomly devided into TFAV low-dose group (0.1g/kg), mid-dose group (0.2g/kg),high-dose group (0.4 g/kg), control group and Jizhi syrup group and mice models, ie, ear edema induced by xylene, cough induced by ammonia, tracheal phenol red excretion were set up to observe the anti-inflammatory, antitussive and expectorant effects of TFAV. guinea pigs were randomly devided into TFAV low-dose group(0.061 g/kg), mid-dose group(0.122 g/kg), high-dose group(0.24g/kg), control group and aminophylline group(0.025g/kg) and asthma model was induced by chemicals to observe the antiasthma effects of TFAV. Kunming mice received intragastic (ig) administration by maximum dosage method (Maximum drug concentration for 0.5 g/mL,Maximum dose for 0.04 mL/g). The reaction of mice was observed in the 15 days. Base on the results, sixty mice were randomly divided into the control groupⅠ,Ⅱ, and control group and observed 7 days. ResultsCompared with the control group,TFAV could decrease ear swelling and the frequency of cough (P<0.05), prolong the latent period (P<0.05), promote tracheal phenol red excretion (P<0.05) and prolonged make the guinea pig asthma latency. No acute toxicity was observed in the control group. The maximum dosage of TFAV by ig in mice was 40 g/kg body mass, which was about 160 times of adult chemical daily dose (15 g). ConclusionTFAV has the significant anti-inflammatory, antitussive, expectorant and antiasthma effects; TFAV is safe to a certain extent.

Keywords:total flavones of Adiantum capillus-veneris L.; anti-inflammatory; antitussive; expectorant; antiasthma; toxic effects

通信作者：謝惠芳，女，副教授，博士，研究方向：環(huán)境與健康，E-mail：xhfworld@sina.com。 馬遇慶，女，博士，教授，主任醫(yī)師，碩士生導師，研究方向：食管癌基礎(chǔ)研究，E-mail: mayuqing-patho@hotmail.com。

作者簡介：董娟娟(1988-)，女，碩士，研究方向：環(huán)境與健康研究。 李夢妍(1982-)，女，在讀碩士，住院醫(yī)師，研究方向：食管癌基礎(chǔ)研究。

基金項目：國家自然科學基金 (81460480),新疆維吾爾自治區(qū)高?？蒲杏媱濏椖?XJEDU2012I26) 國家自然科學基金(81260308)，新疆重大疾病醫(yī)學重點實驗室開放課題項目(SKLIB-XJMDR-2014-12)

[收稿日期：2015-7-29]

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2016.01.004

中圖分類號：R969

文獻標識碼：A

文章編號：1009-5551(2016)01-0017-05