外周血單個(gè)核細(xì)胞hMLH1啟動(dòng)子甲基化與類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展的關(guān)系

甄艷鳳，劉興宇，周云濤，叢斌，付麗紅，李淑瑾，馬春玲，倪志宇，姚玉霞

外周血單個(gè)核細(xì)胞hMLH1啟動(dòng)子甲基化與類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展的關(guān)系

甄艷鳳，劉興宇，周云濤，叢斌，付麗紅，李淑瑾，馬春玲，倪志宇，姚玉霞

目的探討錯(cuò)配修復(fù)基因－h(huán)MLH1啟動(dòng)子甲基化及基因失活在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）發(fā)生發(fā)展中的作用。方法選取2006年4月—2007年4月河北醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院及第三醫(yī)院新診斷的RA患者33例為病例組，另選擇同期河北省血液中心提供的健康人群38例為對(duì)照組。取受試者外周血，以密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞。分別以RT-PCR法、蛋白印跡法檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞hMLH1 mRNA、蛋白相對(duì)表達(dá)量。經(jīng)亞硫酸氫鈉修飾后，分別設(shè)計(jì)hMLH1啟動(dòng)子甲基化和非甲基化的DNA引物，檢測(cè)病例組和對(duì)照組患者h(yuǎn)MLH1啟動(dòng)子甲基化結(jié)果。結(jié)果病例組hMLH1 mRNA相對(duì)表達(dá)量為0.56（0.24，0.69），低于對(duì)照組的0.80（0.68，0.93），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z＝－3.98，P＜0.05）。病例組hMLH1蛋白相對(duì)表達(dá)量為0.70（0.62，0.76），低于對(duì)照組的0.80（0.68，0.94），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z＝－2.23，P＜0.05）。病例組hMLH1啟動(dòng)子甲基化陽(yáng)性率為90.9%（30／33），高于對(duì)照組的13.2%（5／38），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝42.72，P＜0.05）。hMLH1啟動(dòng)子甲基化程度與mRNA、蛋白相對(duì)表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)（rs＝－0.866、－0.541，P＜0.01）。類(lèi)風(fēng)濕因子陽(yáng)性患者h(yuǎn)MLH1 mRNA、蛋白相對(duì)表達(dá)量低于陰性患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；兩者h(yuǎn)MLH1啟動(dòng)子甲基化陽(yáng)性率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論hMLH1啟動(dòng)子甲基化可能是hMLH1基因失活的重要機(jī)制，hMLH1異常高甲基化可能參與了RA的發(fā)生發(fā)展。

類(lèi)風(fēng)濕，關(guān)節(jié)炎；DNA錯(cuò)配修復(fù)；hMLH1；DNA甲基化

甄艷鳳，劉興宇，周云濤，等.外周血單個(gè)核細(xì)胞hMLH1啟動(dòng)子甲基化與類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展的關(guān)系［J］.中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2016，19（7）：808－812.［www.chinagp.net］

Zhen YF，Liu XY，Zhou YT，et al.hMLH1 promoter methylation from peripheral blood mononuclear cells of patients with newly diagnosed rheumatoid arthritis［J］.Chinese General Practice，2016，19（7）：808－812.

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）為全身性自身免疫性疾病，患病率為0.3%～0.4%［1］，其具體發(fā)病機(jī)制尚不明確。DNA錯(cuò)配修復(fù)（MMR）系統(tǒng)是重要的突變避免系統(tǒng)，通過(guò)校正正常DNA代謝中產(chǎn)生的堿基錯(cuò)配及調(diào)節(jié)DNA損傷所誘導(dǎo)的凋亡來(lái)維持基因組的穩(wěn)定性。MMR為細(xì)胞準(zhǔn)確復(fù)制和增殖的必要手段，若MMR系統(tǒng)異常，細(xì)胞突變頻率可增加100倍以上［2］。hMLH1基因是維持MMR基因完整性和穩(wěn)定性的重要基因，其易發(fā)生啟動(dòng)子甲基化。hMLH1基因啟動(dòng)子超甲基化普遍存在，并伴有hMLH1蛋白的低表達(dá)［3－4］。研究發(fā)現(xiàn)，由于MMR基因的缺失，導(dǎo)致結(jié)直腸癌、胃癌細(xì)胞中的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）［5－6］。RA患者也存在MSI，且其關(guān)節(jié)內(nèi)MMR酶合成增加［7－8］。然而，RA患者h(yuǎn)MLH1基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)如何，與RA發(fā)病是否有相關(guān)性，國(guó)內(nèi)外尚罕見(jiàn)報(bào)道，為此，本研究對(duì)其進(jìn)行了探討。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2006年4月—2007年4月河北省第二醫(yī)院及第三醫(yī)院新診斷的RA患者33例為病例組，其中男8例，女25例；平均年齡（46±12）歲，均符合1987年美國(guó)風(fēng)濕病協(xié)會(huì)RA診斷標(biāo)準(zhǔn)［9］，并排除已接受藥物治療、非新診斷RA及合并其他疾病者。另選擇同期河北省血液中心提供的健康人群38例為對(duì)照組，其中男10例，女28例；平均年齡（45±10）歲。兩組性別、年齡比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＝0.04、 t年齡＝0.54，P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑 hMLH1鼠抗人單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)ZYMED公司，亞硫酸氫鈉和對(duì)苯二酚購(gòu)自美國(guó)New Jersey公司，Sss－1酶購(gòu)自美國(guó)NEB公司，UltraPureTM基因組DNA快速提取試劑盒、RT-PCR、MSP反應(yīng)體系及TaqDNA聚合酶、引物購(gòu)自北京賽百盛基因技術(shù)有限公司，淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自上海恒信化學(xué)試劑有限公司，Tris飽和酚購(gòu)自武漢博士德生物工程公司，蛋白酶K、RNA酶抑制劑、HEPES購(gòu)自美國(guó)Promega公司。

1.2.2 密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞［10］取受試者外周血，4 h內(nèi)從下層吸出全血2 ml，與2 ml 0.9%氯化鈉溶液充分吹打混勻，余全血－70℃?zhèn)溆茫粚⒊浞执荡蚧靹虻幕旌弦河玫喂苤鸬纹戒佊? m l淋巴細(xì)胞分離液（比重＝1.077 g／cm3）上，二者界面不能打散。4℃條件下密度梯度離心，離心加速度為265×g，2 000 r／min離心20 min；吸出白色膜狀的單個(gè)核細(xì)胞層于EP管中，即得單個(gè)核細(xì)胞。

1.2.3 RT-PCR法檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞hMLH1 mRNA表達(dá) Trizol一步法提取外周血單個(gè)核細(xì)胞RNA，cDNA合成反應(yīng)體系20μl，其中5×RT buffer 4.0μl，dNTP 0.8 mmol／L，AMV（1 U／μl）2.0μl，模板RNA 10μl，隨機(jī)引物（100 pmol／μl）0.5μl。循環(huán)參數(shù)：30℃預(yù)變性10 min，42℃反轉(zhuǎn)錄1 h，95℃滅活反轉(zhuǎn)錄酶5 min，－20℃?zhèn)溆?。hMLH1引物序列參考文獻(xiàn)［11］，上游：5′-GTGCTGGCAATCAAGGGACCC-3′，下游：5′-CACGGTTGAGGCAATGGGTAG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物215 bp。根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則，應(yīng)用Primer 5引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)內(nèi)參β-actin引物序列，上游：5′-CATCCTGCGTCTGGACCT-3′，下游：5′-TCAGGAGCAATGATCTTG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物480 bp。RT-PCR反應(yīng)體系20μl，其中10×PCR buffer 2.0μl，dNTP 0.2 mmol／L，二氯化鎂（MgCl2）2.0 mmol／L，TaqE（1 U／μl）1.0μl，模板DNA 3.3μl，上下游引物（100 pmol／μl）各0.3μl。RT-PCR循環(huán)參數(shù)：95℃預(yù)變性5 min，94℃變性45 s，55℃（hMLH1）／57℃（β-actin）退火1 min，72℃延伸45 s，共35個(gè)循環(huán)，72℃繼續(xù)延伸5 min。取10μl PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠（含溴化乙錠）100 V恒壓電泳50 min后，紫外燈下觀察結(jié)果，拍照，掃描至計(jì)算機(jī)中。用Gel-pro凝膠分析軟件對(duì)電泳譜帶進(jìn)行半定量分析，以hMLH1與β-actin凝膠譜帶的面積×熒光強(qiáng)度值的比值表示hMLH1 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 蛋白印跡法檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞hMLH1蛋白表達(dá) 提取外周血單個(gè)核細(xì)胞核蛋白，hMLH1抗體稀釋度為1∶150。陰性對(duì)照以PBS代替一抗，以β-actin為參照。將顯色條帶掃描至計(jì)算機(jī)中，用UVP凝膠圖像分析管理系統(tǒng)對(duì)結(jié)果進(jìn)行半定量分析，以hMLH1與β-actin凝膠譜帶的面積×熒光強(qiáng)度值的比值表示hMLH1蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5 hMLH1啟動(dòng)子甲基化檢測(cè)［12］

1.2.5.1 亞硫酸氫鈉修飾 取2～5μg DNA去離子水定容至50μl，加入終濃度為0.2 mol／L的氫氧化鈉（NaOH）5.5μl，37℃水浴30 min；加30μl的10 mmol／L對(duì)苯二酚，3 mol／L的重亞硫酸鈉（pH＝5.0）520μl，混勻后，其上覆蓋200μl液狀石蠟，50℃水浴18 h。按說(shuō)明書(shū)使用基因組DNA快速提取試劑盒純化去鹽，50μl TE buffer洗脫DNA，加入終濃度為0.3 mol／L的NaOH 5.5μl，室溫5 min終止反應(yīng)。加1／10體積的乙酸鈉和2倍體積的無(wú)水乙醇，－70℃保存1 h；離心加速度為1 879×g，14 000 r／min離心10 min；加入1／3體積70%乙醇溶液洗滌1次，再次離心獲得沉淀。所得DNA溶于20μl高壓去離子水中，－20℃保存或直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.2.5.2 hMLH1啟動(dòng)子甲基化分析 分別設(shè)計(jì)hMLH1啟動(dòng)子甲基化和非甲基化的DNA引物［13］，其中甲基化特異性引物序列上游：5′-TATATCGTTCGTAGTATTCGTGT-3′，下游：5′-TCCGACCCGAATAAACCCAA-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物153 bp；非甲基化特異性引物序列上游：5′-TTTTGATGTAGATGTTTTATTAGGGTTGT-3，下游：5′-ACCACCTCATCATAACTACCCACA-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物124 bp。反應(yīng)體系25μl，其中10×PCR buffer 5.0μl，dNTP 0.2 mmol／L，MgCl22.0 mmol／L，TaqE（1 U／μl）2.0μl，亞硫酸氫鈉修飾的模板DNA 5μl，甲基化或非甲基化特異性上下游引物（100 pmol／μl）各0.5μl。循環(huán)參數(shù)：97℃預(yù)變性3 min，94℃變性45 s，44℃退火1 min，72℃延伸45 s，共35個(gè)循環(huán)，72℃繼續(xù)延伸5 min。用胎盤(pán)DNA經(jīng)Sss-1酶催化，亞硫酸氫鈉處理后作為陽(yáng)性對(duì)照PCR模板，陰性對(duì)照采用去離子水代替模板DNA進(jìn)行PCR。擴(kuò)增所得hMLH1甲基化和非甲基化產(chǎn)物，經(jīng)6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分析。甲基化特異性引物擴(kuò)增產(chǎn)物存在判定為甲基化陽(yáng)性；甲基化特異性引物擴(kuò)增產(chǎn)物不存在且非甲基化特異性引物擴(kuò)增產(chǎn)物存在判定為甲基化陰性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，正態(tài)分布的計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布的計(jì)量資料以〔M（P25，P75）〕表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料的分析采用χ2檢驗(yàn)，采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析hMLH1啟動(dòng)子甲基化與hMLH1 mRNA、蛋白的相關(guān)性。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外周血單個(gè)核細(xì)胞hMLH1 mRNA表達(dá)比較 病例組hMLH1 mRNA相對(duì)表達(dá)量為0.56（0.24，0.69），低于對(duì)照組的0.80（0.68，0.93），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z＝－3.98，P＜0.05，見(jiàn)圖1）。

2.2 外周血單個(gè)核細(xì)胞hMLH1蛋白表達(dá)比較 病例組hMLH1蛋白相對(duì)表達(dá)量為0.70（0.62，0.76），低于對(duì)照組的0.80（0.68，0.94），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z＝－2.23，P＜0.05，見(jiàn)圖2）。

圖1 病例組和對(duì)照組hMLH1 mRNA凝膠譜帶Figure 1 hMLH1 mRNA gel bands from the case group and the control group

圖2 病例組和對(duì)照組hMLH1蛋白凝膠譜帶Figure 2 hMLH1 protein gel bands from the case group and the control group

2.3 hMLH1啟動(dòng)子甲基化 病例組hMLH1啟動(dòng)子甲基化陽(yáng)性率為90.9%（30／33），高于對(duì)照組的13.2%（5／38），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝42.72，P＜0.05）。hMLH1啟動(dòng)子甲基化程度與mRNA、蛋白相對(duì)表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)（rs＝－0.866、－0.541，P＜0.01）。

2.4 病例組不同臨床特征患者h(yuǎn)MLH1 mRNA、蛋白相對(duì)表達(dá)量及其啟動(dòng)子甲基化陽(yáng)性率比較 病例組不同性別、年齡、C反應(yīng)蛋白（CRP）與紅細(xì)胞沉降率（ESR）水平患者h(yuǎn)MLH1 mRNA、蛋白相對(duì)表達(dá)量及啟動(dòng)子甲基化陽(yáng)性率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。類(lèi)風(fēng)濕因子（RF）陽(yáng)性患者h(yuǎn)MLH1 mRNA、蛋白相對(duì)表達(dá)量低于陰性患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；兩者h(yuǎn)MLH1啟動(dòng)子甲基化陽(yáng)性率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，見(jiàn)表1）。

3 討論

證據(jù)顯示，類(lèi)風(fēng)濕性滑膜細(xì)胞慢性炎癥可能導(dǎo)致體細(xì)胞突變，使滑膜細(xì)胞變形形成攻擊性滑膜，侵略骨和軟骨，并從其上脫離［14］。而類(lèi)風(fēng)濕性滑膜細(xì)胞中存在的DNA損傷和突變［15］，常伴有錯(cuò)配修復(fù)酶變化及MSI現(xiàn)象［7－8］。

hMLH1位于染色體3p21-23，其基因組DNA全長(zhǎng)約58 kb，含19個(gè)外顯子，cDNA有2 268 bp的開(kāi)放閱讀框架，編碼蛋白含756個(gè)氨基酸［16］。hMLH1基因是錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)的重要組成成分，在錯(cuò)配修復(fù)過(guò)程中具有識(shí)別錯(cuò)配的重要功能，其功能缺陷使DNA復(fù)制時(shí)出現(xiàn)的錯(cuò)配難以得到有效修復(fù)，常表現(xiàn)為MSI的發(fā)生［17－18］。

表1 病例組不同臨床特征患者h(yuǎn)MLH1 mRNA、蛋白相對(duì)表達(dá)量及其啟動(dòng)子甲基化陽(yáng)性率比較Table 1 Comparison of hMLH1 mRNA，protein relative expression and promoter methylation positive rate among patients with different clinical features in the case group

本研究發(fā)現(xiàn)，RA患者外周血hMLH1啟動(dòng)子甲基化陽(yáng)性率為90.9%，明顯高于健康人群的13.2%。hMLH1啟動(dòng)子的異常甲基化與hMLH1 mRNA及蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示甲基化可能是導(dǎo)致hMLH1蛋白表達(dá)缺失的重要機(jī)制之一。當(dāng)hMLH1啟動(dòng)子發(fā)生異常甲基化時(shí)，在細(xì)胞傳遞信號(hào)的影響下轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合物呈分散狀態(tài)，無(wú)法作用于DNA分子，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄失活，因此不能表達(dá)錯(cuò)配修復(fù)蛋白，使其錯(cuò)配修復(fù)基因功能喪失，最終導(dǎo)致RA的發(fā)生及發(fā)展。

hMLH1啟動(dòng)子異常甲基化導(dǎo)致hMLH1蛋白表達(dá)減少或缺失，影響hMLH1錯(cuò)配修復(fù)功能的發(fā)揮，可能導(dǎo)致單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)的出現(xiàn)。已有研究顯示，RA患者存在MSI現(xiàn)象，hMLH1基因的功能缺陷使DNA復(fù)制時(shí)出現(xiàn)的錯(cuò)配難以得到有效修復(fù)，常表現(xiàn)為MSI［7－8］，而hMLH1表達(dá)的缺失與該基因啟動(dòng)子胞嘧啶甲基化直接有關(guān)。推測(cè)hMLH1啟動(dòng)子甲基化可能參與或影響RA的發(fā)生發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)，RF陽(yáng)性患者h(yuǎn)MLH1 mRNA、蛋白表達(dá)均低于RF陰性患者，RF陽(yáng)性與陰性患者間hMLH1基因啟動(dòng)子甲基化陽(yáng)性率無(wú)差異，提示hMLH1 mRNA、蛋白表達(dá)減少參與RA疾病過(guò)程，但未發(fā)現(xiàn)hMLH1啟動(dòng)子甲基化與RA病情活動(dòng)和嚴(yán)重程度存在相關(guān)性，hMLH1啟動(dòng)子甲基化可能只是RA發(fā)病的早期事件，參與了RA疾病的發(fā)生。本研究樣本較少，也可能沒(méi)有足夠的證據(jù)證明hMLH1基因啟動(dòng)子甲基化與RF的關(guān)系。

綜上所述，RA患者外周血hMLH1啟動(dòng)子呈異常超甲基化狀態(tài)，其影響hMLH1轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)，可能參與了RA疾病的發(fā)生發(fā)展。

作者貢獻(xiàn)：甄艷鳳進(jìn)行課題設(shè)計(jì)與實(shí)施、資料收集整理、撰寫(xiě)論文、成文并對(duì)文章負(fù)責(zé)；付麗紅、李淑瑾、馬春玲、倪志宇、姚玉霞協(xié)助進(jìn)行課題實(shí)施、評(píng)估、資料收集；劉興宇、周云濤、叢斌進(jìn)行質(zhì)量控制及審校。

本文無(wú)利益沖突。

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hMLH1 Promoter Methylation From Peripheral Blood Mononuclear Cells of PatientsW ith New ly Diagnosed Rheumatoid Arthritis

ZHEN Yan－feng，LIU Xing－yu，ZHOU Yun－tao，et al．The Second Department of Endocrine，Tangshan Gongren Hospital，Tangshan 063000，China

ObjectiveTo explore promotermethylation and gene inactivation ofmismatch repair gene－h(huán)MLH1 in the genesis and developmentof rheumatoid arthritis（RA）.MethodsA total of 33 RA patients diagnosed in the second and third hospital of HebeiMedical University from April2006 to April2007 were enrolled as the case group and at the corresponding period another 38 healthy persons from Hebei Province Blood Center were recruited as the control group.Peripheral blood mononuclear cells from subjects were separated by density gradient centrifugation.hMLH1 mRNA and protein relative expression of peripheral blood mononuclear cells were detected by RT-PCR and Western－blotting.DNA primers of promoter methylation and nonmethylation were designed respectively after sodium bisulfite modification.Promoter methylation of patients in two groups were detected.ResultshMLH1 mRNA relative expression of the case group was 0.56（0.24，0.69），lower than 0.80（0.68，0.93）of the control group（Z＝－3.98，P＜0.05）.hMLH1 protein relative expression of case group was 0.70（0.62，0.76），lower than 0.80（0.68，0.94）of the control group（Z＝－2.23，P＜0.05）.hMLH1 promotermethylation positive rate of the case group was 90.9%（30／33），higher than 13.2%（5／38）of the control group（χ2＝42.72，P＜0.05）. hMLH1 promotermethylation was negatively correlated withmRNA and protein relative expression（rs＝－0.866，－0.541，P＜0.01）.hMLH1mRNA and protein relative expression of patientswith positive rheumatoid factorswere lower than those of the patients with negative rheumatoid factors（P＜0.05）.The difference of hMLH1 promoter methylation positive rate between patients with positive and negative rheumatoid factors was not significant（P＞0.05）.ConclusionhMLH1 promoter methylation may be a crucial mechanism of hMLH1 gene inactivation.hMLH1 promoter abnormal hypermethylation may be involved in the occurrence and development of RA.

Rheumatoid，arthritis；DNA mismatch repair；hMLH1；DNA methylation

R 593.22

A

10.3969／j.issn.1007－9572.2016.07.015

2015－09－21；

2015－12－29）

（本文編輯：吳立波）

河北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（H2014105040）

063000河北省唐山市，唐山市工人醫(yī)院內(nèi)分泌二科（甄艷鳳），神經(jīng)外科（劉興宇），中心實(shí)驗(yàn)室（周云濤）；河北醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)系（叢斌，付麗紅，李淑瑾，馬春玲，倪志宇，姚玉霞）

叢斌，050017河北省石家莊市，河北醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)系；E-mail：jane791115＠126.com