道地通管湯對(duì)輸卵管炎大鼠轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-βⅡ型受體和Smad2的mRNA表達(dá)的影響▲

潘小敏 吳媛媛 羅志娟 李芳艷 韋欣宏 鐘 琳 謝智光

(1 廣西中醫(yī)藥大學(xué)，南寧市 530011，E-mail：autum19890303@163.com；2 廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院婦科，3 檢驗(yàn)科，南寧市 530022；4 廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院仁愛(ài)分院婦科，南寧市 530023)

論著·基礎(chǔ)研究

道地通管湯對(duì)輸卵管炎大鼠轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-βⅡ型受體和Smad2的mRNA表達(dá)的影響▲

潘小敏1吳媛媛2羅志娟2李芳艷1韋欣宏1鐘 琳4謝智光3

(1 廣西中醫(yī)藥大學(xué)，南寧市 530011，E-mail：autum19890303@163.com；2 廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院婦科，3 檢驗(yàn)科，南寧市 530022；4 廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院仁愛(ài)分院婦科，南寧市 530023)

目的 觀察道地通管湯對(duì)輸卵管炎大鼠輸卵管組織中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-βⅡ型受體(TGF-βRⅡ)mRNA和Smad2 mRNA的影響。方法 68只雌性SD大鼠，隨機(jī)抽取12只作為正常組，剩余大鼠采用混合菌制成輸卵管炎模型，建模成功的48只大鼠分為模型組和道地通管湯低、中、高劑量組，各12只。正常組與模型組給予生理鹽水灌腸，道地通管湯低、中、高劑量組分別給予不同濃度的道地通管湯灌腸[0.35 g/(100 g·d)、0.7 g/(100 g·d)、1.4 g/(100 g·d)]，并于給藥第15天、30天隨機(jī)抽取每組6只大鼠檢測(cè)其輸卵管組織中TGF-βRⅡ和Smad2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量情況。結(jié)果 (1)與正常組比，模型組給藥第15、30天時(shí)TGF-βRⅡ和Smad2 mRNA的表達(dá)量均增高(P<0.05)；道地通管湯各劑量組給藥第30天時(shí)，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。(2)與模型組比，給藥第15、30天時(shí)道地通管湯中、高劑量組TGF-βRⅡ和Smad2 mRNA的表達(dá)量均降低(P<0.05)，給藥第15天時(shí)道地通管湯低劑量組TGF-βRⅡ的表達(dá)量也降低(P<0.05)。(3)道地通管湯各劑量組中TGF-βRⅡ和Smad2 mRNA的表達(dá)量呈低劑量組>中劑量組>高劑量組，給藥第30天時(shí)道地通管湯低劑量組與道地通管湯高劑量組的TGF-βRⅡ表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其余組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。(4)道地通管湯各劑量組中，給藥第30天時(shí) TGF-βRⅡ和Smad2 mRNA 的表達(dá)量均低于給藥第15天，其中道地通管湯各劑量組中Smad2 mRNA 的表達(dá)量組內(nèi)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 道地通管湯能抑制輸卵管炎性大鼠輸卵管組織中TGF-βRⅡ和Smad2的mRNA表達(dá)；道地通管湯給藥30 d作用效果較好，且道地通管湯中劑量與高劑量作用效果相近。

輸卵管炎；道地通管湯；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-βⅡ型受體；Smad2；信使RNA；大鼠

輸卵管炎性疾病可導(dǎo)致異位妊娠、不孕，嚴(yán)重影響患者的身心健康[1]。道地通管湯是羅志娟教授治療盆腔炎性疾病及輸卵管炎性堵塞不孕的經(jīng)驗(yàn)方，臨床療效顯著[2]。實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示道地通管湯能改善輸卵管炎模型動(dòng)物血液“黏、稠、滯”的狀態(tài)[3]，降低血漿C反應(yīng)蛋白、白介素6的含量[4]，具有抗炎、抗粘連作用，但其具體機(jī)制不明確。相關(guān)研究顯示，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)/Smads 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)炎癥的發(fā)生和發(fā)展有重要的影響[5-6]，而道地通管湯是否可通過(guò)作用于TGF-β1/Smads信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)分子而起抗炎、抗粘連的作用？本實(shí)驗(yàn)采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)檢測(cè)道地通管湯灌腸后輸卵管炎癥大鼠輸卵管組織中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-βⅡ型受體(transforming growth factor-β receptor Ⅱ，TGF-βRⅡ)和Smad2的mRNA含量變化情況，探討道地通管湯的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無(wú)特定病原體級(jí)雌性SD大鼠68只，體重(220±20)g，8～10周齡，購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(桂)2014-0002，飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 材料

1.2.1 藥物：道地通管湯水煎濃縮至生藥含量為1.75 g/ml、3.5 g/ml、7.0 g/ml的溶液。

1.2.2 混合菌：將金黃色葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌、大腸桿菌按1 ∶1 ∶2比例用無(wú)菌生理鹽水配成3×108/ml的混合液。

1.2.3 主要試劑：Trizol-A+Reagent總RNA提取試劑盒(北京天根公司，批號(hào)：DP421)，F(xiàn)astQuant cDNA第一鏈合成試劑(北京天根公司，批號(hào)：KR106)，SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(大連寶生物公司，批號(hào)：AK6503)，引物由上海生物工程技術(shù)有限公司合成。

1.2.4 主要儀器：紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo公司，型號(hào)：NanoDrop2000)，大容量冷凍高速離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司，型號(hào)：Eppendorf 5810R)，ABI實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司，型號(hào)：StepOnePlus)等。

1.3 造模方法 68只雌性SD大鼠，采用隨機(jī)數(shù)字表法抽取12只作正常組，對(duì)其余56只大鼠進(jìn)行造模。采用混合菌造模法[7]，選擇動(dòng)情后期雌性大鼠，用10%水合氯醛溶液0.3 ml/100 g腹腔注射后，仰臥固定、剃毛、消毒、鋪布，行縱形切口，打開(kāi)腹腔，找到Y(jié)形子宮，分別在子宮角近輸卵管處注射細(xì)菌混懸液0.05 ml，緩慢注射，每側(cè)注射混合菌液 0.05 ml，然后將輸卵管納回腹腔，用1號(hào)絲線先縫合腹壁再縫合皮膚，75%酒精消毒手術(shù)傷口，正常組不做任何處理。術(shù)后將大鼠側(cè)臥位放于鼠籠內(nèi)，每只大鼠單獨(dú)放于一個(gè)籠，待其自然蘇醒，再觀察術(shù)后大鼠的情況，造模術(shù)后所有大鼠自由飲食，使用普通飼料喂養(yǎng)，不使用抗生素治療。使用隨機(jī)數(shù)字表法分別于術(shù)后第5、10、15天選取1只大鼠及術(shù)后第20天選取2只大鼠，剖腹觀察記錄其輸卵管盆腔變化情況，截取輸卵管組織使用蘇木精-伊紅染色，檢測(cè)其病理形態(tài)學(xué)變化，以確定輸卵管炎模型造模成功。

1.4 給藥方法 56只進(jìn)行造模的大鼠中，3只急性感染死亡，5只用于確定造模成功，剩余48只采用隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、道地通管湯低劑量組、道地通管湯中劑量組、道地通管湯高劑量組，每組12只。造模術(shù)后第21天開(kāi)始灌腸，正常組與模型組給予生理鹽水0.2 ml/(100 g·d)，道地通管湯低、中、高劑量組分別給予不同濃度的水煎濃縮液[0.35 g/(100 g·d)、0.7 g/(100 g·d)、1.4 g/(100 g·d)，分別等效于人臨床常規(guī)量的1/2和1、2倍]灌腸。

1.5 標(biāo)本的采集與制備 給藥第15、30天，采用隨機(jī)數(shù)字表法分別抽取每組6只大鼠，打開(kāi)腹腔截取輸卵管組織迅速放于凍存管投入液氮過(guò)夜后保存于-80℃冰箱，采用qRT-PCR進(jìn)行檢測(cè)。

1.6 TGF-βRⅡ和Smad2 mRNA表達(dá)情況 按Trizol法提取大鼠輸卵管組織的總RNA；按反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟合成cDNA；采用SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95℃ 30 s，1個(gè)循環(huán)；95℃ 5 s，60℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)。PCR實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析采用相對(duì)定量方法，計(jì)算方法選擇2-ΔΔCt法。引物見(jiàn)表1。

表1 β-actin、TGF-βRⅡ、Smad2引物序列與產(chǎn)物長(zhǎng)度

注：β-actin為β-肌動(dòng)蛋白。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，多組均數(shù)的比較采用單因素方差分析；道地通管湯各組組內(nèi)用藥15 d與30 d的比較采用配對(duì)資料t檢驗(yàn)或符號(hào)秩檢驗(yàn)；以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組TGF-βRⅡmRNA相對(duì)表達(dá)量比較 與正常組比，給藥第15、30天模型組 TGF-βRⅡ mRNA表達(dá)量增高(P<0.05)，道地通管湯各組表達(dá)量有不同程度增高，其中與給藥第15天時(shí)道地通管湯低、中劑量組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比，道地通管湯各組表達(dá)量有不同程度降低，除給藥第15天時(shí)的道地通管湯低劑量組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)外，其余各組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。道地通管湯各劑量組中，TGF-βRⅡ mRNA表達(dá)量呈低劑量組>中劑量組>高劑量組，但僅給藥第30天時(shí)，道地通管湯低劑量組與道地通管湯高劑量組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。道地通管湯各劑量組中，給藥第30天TGF-βRⅡ mRNA表達(dá)量均低于給藥第15天，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 給藥后各組大鼠輸卵管組織中 TGF-βRⅡ mRNA相對(duì)表達(dá)量比較(x±s)

注：與正常組比較：*P<0.01；與模型組比較：#P<0.05。

2.2 各組Smad2 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 (1)與正常組比較，模型組Smad2 mRNA表達(dá)量增多(P<0.05)，道地通管湯各劑量組表達(dá)量不同程度增高，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與模型組比，道地通管湯各組Smad2 mRNA表達(dá)量有不同程度降低，其中與給藥第15、30天時(shí)道地通管湯中、高劑量組的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；道地通管湯各劑量組Smad2 mRNA呈低劑量組>中劑量組>高劑量組，但組間比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。(2)道地通管湯各劑量組中，給藥第30天Smad2 mRNA均低于給藥第15天，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 給藥后各組大鼠輸卵管 組織中Smad2 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較(x±s)

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

3 討 論

大量研究表明TGF-β1/Smads信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是炎癥發(fā)揮作用的主要途徑[5-6]。在炎癥刺激下，TGF-β1通過(guò)血纖維蛋白溶酶、活性氧、血小板-1和酸的作用從結(jié)合蛋白中水解分裂出來(lái)[8-9]，激活的TGF-β1結(jié)合其受體，通過(guò)分泌的方式發(fā)揮生物學(xué)作用[6]。TGF-β1最先結(jié)合TGF-βRⅡ，從而激活TGF-βRⅠ激酶，使受體調(diào)節(jié)型Smad2、Smad3磷酸化，繼而聯(lián)合Smad4成為一個(gè)Smad復(fù)合體；Smad復(fù)合體進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮促使成纖維細(xì)胞增生的相關(guān)生物學(xué)效應(yīng)，使膠原蛋白趨化為單核細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等，使細(xì)胞外基質(zhì)沉淀，最終導(dǎo)致TGF-β1/Smads信號(hào)通路反復(fù)被激活，進(jìn)而使細(xì)胞內(nèi)鈣離子增多，導(dǎo)致白介素6、腫瘤壞死因子大量釋放，由此產(chǎn)生的炎癥因子又存在正反饋的效應(yīng)，而加強(qiáng)炎癥反應(yīng)；其中當(dāng)炎癥發(fā)生時(shí)，TGF-β1/Smads信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的TGF-βRⅡ和Smad2表達(dá)增多，而炎癥好轉(zhuǎn)時(shí)，TGF-βRⅡ和Smad2表達(dá)減少[10-12]。

本課題組的前期實(shí)驗(yàn)已證實(shí)道地通管湯具有抗炎、抗粘連的作用[3-4]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠輸卵管組織TGF-βRⅡ與Smad2 mRNA 的表達(dá)量均高于正常組(P<0.05)；且與模型組比，給藥第15、30天時(shí)道地通管湯中、高劑量組TGF-βRⅡ和Smad2 mRNA的表達(dá)量均降低(P<0.05)，給藥第30天時(shí)道地通管湯低劑量組TGF-βRⅡ的表達(dá)量也降低(P<0.05)。這提示道地通管湯可能通過(guò)抑制 TGF-βRⅡ與Smad2的mRNA的表達(dá)，從而起到抗炎、抗粘連的作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，給藥30 d時(shí)，道地通管湯各劑量組TGF-βRⅡ和Smad2 mRNA的表達(dá)量與正常組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，且中、高劑量組TGF-βRⅡ和Smad2 mRNA的表達(dá)量接近正常組；而道地通管湯中劑量組與高劑量組TGF-βRⅡ和Smad2 mRNA 的表達(dá)量比較，差異也均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。這提示道地通管湯給藥30 d作用效果較好，且道地通管湯中劑量與高劑量作用效果相近。對(duì)于道地通管湯各劑量組兩兩比較以及組內(nèi)比較部分無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這可能與本研究樣本量少有關(guān)。

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Effect of Daodi Tongguan decoction on expressions of transforming growth factor-betareceptor Ⅱ and Smad2 mRNAs in rats with salpingitis

PANXiao-min1,WUYuan-yuan2,LUOZhi-juan2,LIFang-yan1,WEIXin-hong1,ZHONGLin4,XIEZhi-guang3

(1GuangxiUniversityofChineseMedicine,Nanning530011,China;2DepartmentofGynaecology,3DepartmentofClinicalLaboratory,RuikangHospitalAffiliatedtoGuangxiUniversityofChineseMedicine,Nanning530022,China;4DepartmentofGynaecology,Ren′aiDivision,theFirstAffiliatedHospitaltoGuangxiUniversityofChineseMedicine,Nanning530023,China)

Objective To observe the effect of Daodi Tongguan decoction on the expressions of transforming growth factor-β receptor Ⅱ(TGF-βRⅡ) mRNA and Smad2 mRNA in fallopian tube tissues of rats with salpingitis.Methods Twelve of 68 female SD rats were selected randomly as the normal group,and salpingitis models were established using mixed bacteria in the rest rats.The 48 successful rat models were divided into model group,low-,medium- and high-dose Daodi Tongguan decoction groups,with 12 rats in each group.The rats in the normal group and model group were given normal saline by enemata,while the rats in the low-,medium- and high-Daodi Tongguan decoction groups were given Daodi Tongguan decoction with the concentrations of 0.35 g/(100 g·d),0.7 g/(100 g·d) and 1.4 g/(100 g·d) by enemata respectively.On the 15th and 30th day after administration,six rats were randomly selected from each group to detect the relative expressions of TGF-βR Ⅱ and Smad2 mRNAs in their fallopian tube tissues.Results ① Compared to the normal group,the expression quantities of TGF-βR Ⅱ and Smad2 mRNAs in the model group increased on the 15th and 30th day after administration (P<0.05);on the 30th day after administration,no significant differences in the expression quantities of TGF-βR Ⅱ and Smad2 mRNAs were found among all Daodi Tongguan decoction groups(P>0.05).② Compared to the model group,the expression quantities of TGF-βR Ⅱ and Smad2 mRNAs in the medium- and high-dose Daodi Tongguan decoction groups decreased on the 15th and 30th day after administration(P<0.05),and the expression quantity of TGF-βR Ⅱ in the low-dose Daodi Tongguan decoction group also decreased on the 15th day after administration(P<0.05).③ Among all Daodi Tongguan decoction groups,the expression quantities of TGF-βR Ⅱ and Smad2 mRNAs deceased in the order of low-,medium- and high-dose Daodi Tongguan decoction groups.There was significant difference in the expression quantity of TGF-βR Ⅱ between the low- and high-dose Daodi Tongguan decoction groups(P<0.05),and no statistical difference was observed among other Daodi Tongguan decoction groups(P>0.05).④ Among the Daodi Tongguan decoction groups,the expression quantities of TGF-βR Ⅱ and Smad2 mRNAs on the 30th day after administration were lower than those on the 15th day,and the statistical difference was found in the expression quantity of Smad2 mRNA among the Daodi Tongguan decoction groups(P<0.05).Conclusion Daodi Tongguan decoction can inhibit the expressions of TGF-βR Ⅱ and Smad2 mRNAs in fallopian tube tissues of rats with salpingitis.The efficacy is better on the 30th day after administration,and the medium-dose Daodi Tongguan decoction obtains a similar efficacy as the high-dose Daodi Tongguan decoction.

Salpingitis,Daodi Tongguan decoction,Transforming growth factor-βreceptor Ⅱ,Smad2,Message RNA,Rat

國(guó)家自然科學(xué)基金(81360594)

潘小敏(1989～)，女，在讀碩士研究生，研究方向：不孕不育與生殖內(nèi)分泌。

羅志娟(1960～)，女，本科，教授，研究方向：不孕不育與生殖內(nèi)分泌、婦科炎癥，E-mail：lzj60123@163.com。

R 285.5

A

0253-4304(2016)09-1189-04

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.09.01

2016-04-14

2016-06-20)