p28GANK蛋白在肝細(xì)胞性肝癌組織中的表達(dá)及其臨床意義▲

莫瑞祥 楊 威 李西融 廖文勝 張慧明 陳澤峰 黃 芳

(廣西壯族自治區(qū)南溪山醫(yī)院1 外一科，2 病理科，桂林市 541002，E-mail：moruixiang@126.com)

論著·臨床研究

p28GANK蛋白在肝細(xì)胞性肝癌組織中的表達(dá)及其臨床意義▲

莫瑞祥1楊 威1李西融2廖文勝1張慧明1陳澤峰1黃 芳1

(廣西壯族自治區(qū)南溪山醫(yī)院1 外一科，2 病理科，桂林市 541002，E-mail：moruixiang@126.com)

目的 探討p28GANK蛋白在肝細(xì)胞性肝癌(HCC)組織中的表達(dá)及其臨床意義。方法 收集HCC組織及其相應(yīng)癌旁組織60例(其中32例伴有肝硬化組織)、正常肝組織30例，采用免疫組化法檢測(cè)HCC、癌旁組織、肝硬化組織、正常肝組織組織中p28GANK蛋白的表達(dá)，分析p28GANK蛋白表達(dá)水平與HCC患者臨床病理特征關(guān)系。結(jié)果 p28GANK蛋白在HCC、癌旁肝組織、肝硬化組織性、正常肝組織陽性表達(dá)率分別為71.7%、10.0%、12.5%、6.7%，HCC中p28GANK蛋白的陽性表達(dá)率高于其他組織(P<0.05)。HCC患者中，低分化(Ⅲ～Ⅳ級(jí))、淋巴結(jié)和(或)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及TNM分期Ⅲ+Ⅳ者p28GANK蛋白表達(dá)陽性率分別高于高分化(Ⅰ～Ⅱ級(jí))、無淋巴結(jié)和(或)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期Ⅰ+Ⅱ者(P<0.05)。結(jié)論 p28GANK蛋白表達(dá)可能與HCC的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，p28GANK可作為HCC診斷的分子標(biāo)志物。

肝腫瘤；p28GANK基因；蛋白

原發(fā)性肝癌是常見惡性腫瘤之一，在我國(guó)惡性腫瘤死亡率中居第二位，在廣西原發(fā)性肝癌仍然是最主要的惡性腫瘤。肝細(xì)胞性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)發(fā)生可能與HBV、HCV、黃曲霉毒素B1等致癌因子通過癌基因的改變而起作用，如N-ras基因、C-myc，C-fos等癌基因激活及p53抑癌基因失活有關(guān)。分子機(jī)制研究表明，p28GANK基因主要通過Rb、鼠雙微基因2(murine double mimute 2，MDM2)-p53等重要信號(hào)途徑，調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程、促進(jìn)細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡[1-3]，提示該基因在細(xì)胞增殖和腫瘤發(fā)生發(fā)展中具有極為重要的作用。本研究通過檢測(cè)并對(duì)比HCC、癌旁組織、肝硬化組織及正常肝組織中p28GANK基因表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)情況，同時(shí)分析HCC組織中p28GANK蛋白表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系，探討p28GANK基因在HCC發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 材料和方法

1.1 臨床資料 選取2010年1月至2015年12月廣西區(qū)南溪山醫(yī)院病理科存檔的蠟塊標(biāo)本，包括HCC及其相應(yīng)癌旁組織60例(其中32例伴有肝硬化組織)、正常肝組織30例，所有病例均為未接受放療和化療治療。HCC病例中，男性37例，女性23例，年齡22～72歲，中位年齡40歲；Edmondson-Steiner分級(jí)[4]Ⅰ級(jí)14例，Ⅱ級(jí)15例，Ⅲ級(jí)18例，Ⅳ級(jí)13例；TNM分期[4]Ⅰ期10例，Ⅱ期12例，Ⅲ期20例，Ⅳ期18例。32例HCC伴有肝硬化病例中男性21例，女性11例，年齡28～72歲，中位年齡43歲。正常肝組織來源于肝膽外傷手術(shù)切除患者，其中男性22例，女性8例，年齡21～63歲，中位年齡38歲。HCC、肝硬化及正常肝組織患者的性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。所有標(biāo)本均經(jīng)10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片厚4 μm。

1.2 主要試劑 兔抗人p28GANK單克隆抗體為Santa Cruz公司產(chǎn)品(生產(chǎn)批號(hào)：20130458)，鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶聯(lián)結(jié)(streptavidin-perosidase，SP)法即用型抗兔免疫組織化學(xué)超敏UltraSensitiveTMSP試劑盒、正常非免疫羊血清和二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色試劑盒購(gòu)于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司(生產(chǎn)批號(hào)：1506030031)。

1.3 免疫組織化學(xué)S-P法染色及結(jié)果評(píng)估 組織芯片切片脫蠟、水化后，置入3% H2O2中室溫30 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，正常非免疫羊血清室溫封閉30 min，滴加p28GANK單克隆抗體(濃度1 ∶50)，置密封濕盒中4°C過夜，滴加即用型生物素標(biāo)記二抗和標(biāo)記過氧化物酶的鏈霉菌抗生物素蛋白，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片。用已知陽性的結(jié)腸腺癌切片作陽性對(duì)照，磷酸緩沖鹽溶液代替一抗作陰性對(duì)照。結(jié)果評(píng)估參照文獻(xiàn)[5]報(bào)告的方法，由兩位未知患者臨床病理資料的資深病理醫(yī)師顯微鏡下獨(dú)立觀察，p28GANK免疫組化染色陽性物質(zhì)定位于細(xì)胞質(zhì)和胞核。每例標(biāo)本至少隨機(jī)觀察3個(gè)視野(×200)，根據(jù)陽性細(xì)胞比例和染色強(qiáng)度判定染色結(jié)果。無陽性細(xì)胞記0分，陽性細(xì)胞<30%記1分，30%～60%記2分，>60%記3分；無染色記0分，弱陽性記1分，陽性記2分，強(qiáng)陽性記3分。兩項(xiàng)評(píng)分分值相加，0～2分為p28GANK表達(dá)陰性，3～6分為陽性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料間比較采用χ2檢驗(yàn)或精確概率法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 p28GANK蛋白在HCC、癌旁肝組織、肝硬化組織及正常肝組織中的表達(dá)情況 p28GANK蛋白陽性表達(dá)信號(hào)為棕黃色細(xì)小顆粒狀，定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)。p28GANK蛋白在HCC、癌旁組織、肝硬化組織及正常肝組織的表達(dá)情況見圖1。HCC中p28GANK蛋白的表達(dá)高于癌旁組織、肝硬化組織及正常肝組織(χ2=73.167，P<0.001)，見表1。

圖1 p28GANK蛋白在HCC、癌旁肝組織、肝硬化組織及正常肝組織中的表達(dá)(親和組化染色法，×400)

注：與HCC組織比較，*P<0.05。

2.2 p28GANK蛋白表達(dá)水平與HCC患者臨床病理特征關(guān)系 不同分化程度的患者肝癌組織p28GANK蛋白表達(dá)陽性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，低分化(Ⅲ～Ⅳ級(jí))的患者p28GANK蛋白表達(dá)陽性率高于高分化(Ⅰ～Ⅱ級(jí))的患者；淋巴結(jié)和(或)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者肝癌組織p28GANK蛋白表達(dá)陽性率高于無淋巴結(jié)和(或)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者(P<0.05)；TNM分期Ⅲ+Ⅳ的患者肝癌組織p28GANK蛋白表達(dá)陽性率高于Ⅰ+Ⅱ的患者(P<0.05)。見表2。

表2 HCC患者肝癌組織p28GANK蛋白與臨床病理特征關(guān)系(n，%)

3 討 論

p28GANK系日本科學(xué)家Fujita等應(yīng)用消減雜交法從人HCC組織高表達(dá)的基因中篩選出一條編碼重復(fù)gankyrin序列的新基因，并在人胎盤cDNA文庫(kù)中克隆出它的全長(zhǎng)cDNA序列，該序列在哺乳動(dòng)物中高度保守[6]。gankyrin基因cDNA全長(zhǎng)約1.5 kb，開放閱讀框編碼一個(gè)226氨基酸組成的蛋白質(zhì)，分子量約為25 kDa。p28GANK 分子表面有凹槽，可以與其他蛋白質(zhì)分子相互作用，因此，具有多種生物學(xué)功能[7]。MDM2-p53通路在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用，MDM2在多數(shù)腫瘤細(xì)胞中有促進(jìn)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)變潛能，它可以與腫瘤抑制基因p53結(jié)合進(jìn)而降低其活性，而p28GANK能夠與MDM2 N-端RING結(jié)構(gòu)域結(jié)合激活后者引起構(gòu)象變化，從而發(fā)揮與p53結(jié)合功能，促進(jìn)p53泛素化而降解，促進(jìn)細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化[8-10]。Rb蛋白能夠調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡等多種惡性生物學(xué)行為，p28GANK過表達(dá)可以促進(jìn)Rb磷酸化，使其出核后在胞漿降解[11-12]。

研究表明，p28GANK在消化道腫瘤中普遍呈高表達(dá)，p28GANK在食管癌、結(jié)腸癌等[5，13]組織中表達(dá)均高于癌旁或正常組織，并且在食管癌中p28GANK表達(dá)與腫瘤組織大小及預(yù)后明顯相關(guān)[13]，結(jié)腸癌組織p28GANK表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)深度、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Dukes分期及術(shù)后生存期相關(guān)[5]。為探討p28GANK與HCC發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，我們應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)p28GANK蛋白在HCC、癌旁組織、肝硬化組織及正常肝組織的表達(dá)，結(jié)果顯示，HCC中p28GANK蛋白的陽性表達(dá)率明顯高于癌旁組織、肝硬化組織及正常肝組織(P<0.05)，提示HCC的發(fā)生可能與p28GANK蛋白表達(dá)上調(diào)相關(guān)，p28GANK在HCC發(fā)生中起重要作用。對(duì)p28GANK蛋白表達(dá)水平與HCC患者臨床病理特征的關(guān)系分析結(jié)果顯示，低分化(Ⅲ～Ⅳ級(jí))、淋巴結(jié)和(或)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及TNM分期Ⅲ+Ⅳ的患者肝癌組織p28GANK蛋白表達(dá)陽性率分別高于高分化(Ⅰ～Ⅱ級(jí))的患者、無淋巴結(jié)和(或)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期Ⅰ+Ⅱ的患者(P<0.05)，提示p28GANK蛋白表達(dá)陽性可能與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)和(或)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)，說明p28GANK對(duì)HCC的惡性進(jìn)展具有促進(jìn)作用。上述結(jié)果與p28GANK在食管癌[12]、結(jié)腸癌[4]研究中的結(jié)果相似。

綜上所述，p28GANK可能參與了HCC發(fā)生過程并且對(duì)腫瘤惡性進(jìn)展具有促進(jìn)作用，這為研究HCC的發(fā)病機(jī)制提供了新的線索，同時(shí)也為HCC診斷提供分子靶標(biāo)。

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Expression of p28GANK protein in hepatocellular carcinoma tissues and its clinical significance

MORui-xiang1,YANGWei1,LIXi-rong2,LIAOWen-sheng1,ZHANGHui-ming1,CHENZe-feng1,HUANGFang1

(1TheFirstDepartmentofSurgery,2DepartmentofPathology,NanxishanHospitalofGuangxiZhuangAutonomousRegion,Guilin541002,China)

Objective To explore the expression of p28GANK protein in hepatocellular carcinoma(HCC) tissues and its clinical significance.Methods Sixty specimens of HCC tissues and matched para-carcinoma tissues(32 of which contained hepatocirrhosis),30 specimens of normal liver tissues were collected.Immunohistochemistry was used to detect the protein expression of p28GANK in HCC tissues,para-carcinoma tissues,hepatocirrhosis tissues and normal liver tissues.The relationship between the expression level of p28GANK protein and clonicopathological features of patients with HCC was analyzed.Results The positive expression rates of p28GANK protein in HCC tissues,para-carcinoma tissues,hepatocirrhosis tissues and normal liver tissues were 71.7%,10.0%,12.5%,6.7%,respectively.The positive expression rate of p28GANK protein in HCC tissues was significantly higher than that in the other tissues(P<0.05).In the patients with HCC,the positive expression rates of p28GANK protein in the patients with poorly differentiated type(Class Ⅲ-Ⅳ),with lymphatic/distant metastasis,and with TNM stage Ⅲ+Ⅳ were higher than those in the patients with well differentiated type(Class Ⅰ-Ⅱ),without lymphatic/distant metastasis,and with TNM stage Ⅰ+Ⅱ respectively(P<0.05).Conclusion The expression of p28GANK protein might be associated with tumorigenesis and progress of HCC.And p28GANK may become a molecular marker for the diagnosis of HCC.

Liver neoplasms,p28GANK gene,Protein

廣西醫(yī)療衛(wèi)生重點(diǎn)科研課題(重2012014)

莫瑞祥(1965～)，男，本科，主任醫(yī)師，研究方向：肝膽腫瘤的基礎(chǔ)與臨床研究。

R 735.7

A

0253-4304(2016)07-0919-03

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.07.07

2016-03-21

2016-05-24)