人乳頭狀瘤病毒不同亞型感染與宮頸病變程度關(guān)系研究

龐小芬 王佳麗 石丹麗 陳昌賢 莫凌昭

(廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院婦瘤科，南寧市 530021，E-mail：1334049578@qq.com)

臨床創(chuàng)新

人乳頭狀瘤病毒不同亞型感染與宮頸病變程度關(guān)系研究

龐小芬 王佳麗 石丹麗 陳昌賢 莫凌昭

(廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院婦瘤科，南寧市 530021，E-mail：1334049578@qq.com)

目的 探討人乳頭狀瘤病毒(HPV)感染與宮頸病變的相關(guān)性。方法 采用凱普人乳頭狀瘤病毒核酸擴(kuò)增分型檢測方法檢測217例宮頸細(xì)胞學(xué)正常/炎癥患者(對照組)、131例高級別宮頸上皮內(nèi)瘤變(CINⅡ～Ⅲ組)、338例宮頸癌(宮頸癌組)患者HPV基因。3組患者又根據(jù)年齡不同分為年輕組(≤35歲)和中老年組(≥35歲)，根據(jù)民族分為漢族和少數(shù)民族兩組，分別比較各組患者HPV感染率與年齡、民族的關(guān)系。結(jié)果 (1)對照組HPV感染率為20.74%(45/217)，明顯低于CINⅡ～Ⅲ組的86.26%(113/131)、宮頸癌組的90.53%(306/338)(P均<0.05)，CINⅡ～Ⅲ組與宮頸癌組HPV感染率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。(2)對照組、CINⅡ～Ⅲ組、宮頸癌組HPV多重感染率分別為11.11%、27.43%、19.28%，CINⅡ～Ⅲ組多重感染率明顯高于對照組(P<0.05)。(3)常見的亞型檢出率： HPV16為41.25%，HPV18為10.35%，HPV58為9.33%，HPV52為6.27%，HPV33為3.94%。logistic回歸分析顯示：感染HPV16、58、52、33型患CINⅡ～Ⅲ的風(fēng)險(xiǎn)升高(P<0.05)；感染HPV16、18、58、52型患宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)升高(P<0.05)。(4)對照組患者中，年輕組HPV感染率高于中老年組(P<0.05)，宮頸癌組中，中老年組HPV感染率高于年輕組(P<0.05)，CINⅡ～Ⅲ組患者中，年輕組與老年組HPV感染率無差異(P>0.05)。結(jié)論 HPV感染率隨宮頸病變嚴(yán)重程度加重呈升高；HPV多重感染可能是宮頸病變加重的重要因素；HPV16、18、58、52、33型與宮頸病變密切相關(guān)。

宮頸癌；宮頸上皮內(nèi)瘤變；人乳頭狀瘤病毒；基因分型

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅女性的健康和生命。在我國，每年新增宮頸癌患者約13.5萬，占全球發(fā)病數(shù)量的1/3[1]。宮頸癌的發(fā)生發(fā)展是宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)-原位癌-早期浸潤癌-浸潤癌的連續(xù)發(fā)展過程，期間可經(jīng)歷10～15年。故在此過程中，對宮頸病變特別是宮頸癌的篩查、早期診治十分關(guān)鍵。目前認(rèn)為人乳頭狀瘤病毒(human papillomavirus，HPV)，特別高危型別HPV的持續(xù)性感染是引起宮頸癌的基本原因。故HPV的篩查是早期發(fā)現(xiàn)和預(yù)防宮頸癌的重要手段，對HPV特別是高危型HPV的監(jiān)測及分型研究對預(yù)測宮頸病變的進(jìn)展、判斷預(yù)后、指導(dǎo)治療有重要價(jià)值。本文檢測對照組、CINⅡ～Ⅲ組、宮頸癌組患者HPV感染情況，以了解HPV感染與宮頸上皮內(nèi)瘤變、宮頸癌的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2010年8月至2013年8月在廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院就診的CINⅡ～Ⅲ患者131例，年齡24～75歲，宮頸癌患者338例，年齡21～79歲，均經(jīng)我院病理檢查確診。選取同期接受宮頸薄層液基細(xì)胞學(xué)檢測并顯示宮頸細(xì)胞正?；蜓仔苑磻?yīng)性細(xì)胞改變的非宮頸病變患者217例為對照組，年齡19～75歲。所有患者按年齡不同分為年輕組(≤35歲)和中老年組(>35歲)，根據(jù)民族不同分為漢族和少數(shù)民族組。

1.2 試劑及儀器 HPV DNA抽提試劑盒(QIA Mini試劑盒，德國Qiagen公司)；HPV基因分型檢測試劑盒(中國凱普生物科技有限公司)；擴(kuò)增儀(GeneAmp 9700，美國ABI公司)；醫(yī)用核酸分子快速雜分儀(中國凱普生物科技有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集：標(biāo)本采樣前3 d內(nèi)不用陰道內(nèi)藥物，不行陰道沖洗，前1 d起禁止性生活。由婦科醫(yī)師用陰窺器暴露宮頸，用棉拭子擦去宮頸口過多的分泌物，將宮頸刷伸入宮頸口處，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)宮頸刷，順時(shí)針旋轉(zhuǎn)3～5周，慢慢抽出宮頸刷，將其放入含專用保存液的小瓶中，旋緊瓶蓋，標(biāo)記好送檢驗(yàn)室檢測。1.3.2 標(biāo)本DNA提?。喝∩鲜鲆后w0.5 ml，13 000 r/min離心1 min，棄上清液，利用QIA Mini試劑盒提取DNA，具體操作步驟參照試劑盒說明書。

1.3.3 HybriMax法檢測21種HPV亞型：(1)標(biāo)本DNA擴(kuò)增： 將水、PCR MIX、Taq酶和DNA模板按要求混勻，反應(yīng)體系為25 μl。PCR反應(yīng)條件為20℃10 min，95℃預(yù)變性9 min；95℃ 20 s→55℃ 30 s→72℃ 30 s→95℃ 20 s，共40個(gè)循環(huán)后，72℃延伸5 min，最后將溫度維持在4℃。(2)導(dǎo)流雜交： 將擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物加熱變性后冰浴，同時(shí)將固定有特異性核酸探針的膜固定在雜交儀上，進(jìn)行預(yù)雜交。把PCR產(chǎn)物加到薄膜上，讓樣品流入膜內(nèi)進(jìn)行導(dǎo)流雜交，清洗除去未結(jié)合的DNA，整個(gè)雜交過程保持在45℃。(3)芯片顯色： 用封阻液封閉膜，孵育5 min，重復(fù)2次。排出封阻液后加入酶標(biāo)液，25℃溫育3.5 min。用沖洗緩沖液徹底沖洗膜，除去未結(jié)合的酶標(biāo)液，后加入NBT/BCIP底物顯色3～5 min。在顯色后1 h內(nèi)分析結(jié)果。

1.3.4 結(jié)果判定：固定有特異性核酸探針的膜共分隔成21個(gè)小圓，每個(gè)圓點(diǎn)表示一種HPV型別，21種HPV分為高危型和低危型兩類：高危型15種，包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、68、59、66、68；低危型6種，包括HPV6、11、42、43、44、CP8304。顯示為紫藍(lán)色圓點(diǎn)提示該HPV型別檢測結(jié)果陽性，兩個(gè)或兩個(gè)以上圓點(diǎn)顯色者為多亞型感染。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料率的比較采用χ2檢驗(yàn)；采用logistic回歸進(jìn)行相關(guān)性分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組患者HPV感染情況 對照組217例，HPV感染率為20.74%；CINⅡ～Ⅲ組131例，HPV感染率為86.26%；宮頸癌組338例，HPV感染率為90.53%。宮頸癌組HPV感染率高于CINⅡ～Ⅲ組、對照組(χ2=141.474，P<0.001)，CINⅡ～Ⅲ組與宮頸癌組HPV感染率無差異(χ2=1.810，P=0.185)。對照組、CINⅡ～Ⅲ組、宮頸癌組高危型HPV感染率分別為97.78%、98.23%、98.69%。見表1。

表1 3組患者HPV感染率 及高危型HPV感染構(gòu)成比較(%)

2.2 各組患者HPV多重感染情況 對照組多重感染5例，其中二重感染4例，以HPV16與其他型別合并感染為主，共3例。CINⅡ～Ⅲ 組多重感染31例，其中二重感染24例，HPV16與其他型別合并感染為主，占58.06%(18/31)，并以HPV16+18、HPV16+52、HPV16+58多見。宮頸癌組多重感染59例，其中二重感染47例，合并HPV16感染占多重感染47.46%(28/59)，以HPV16+52、HPV16+18、HPV16+58等多見。3組患者的HPV感染均以二重感染為主，其中對照組和CINⅡ～Ⅲ 組主要以合并HPV16感染為主。3組多重感染率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.874，P=0.035)，CINⅡ～Ⅲ組HPV多重感染率高于對照組(P<0.05)，對照組與宮頸癌組、CINⅡ～Ⅲ組與宮頸癌組HPV多重感染率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 3組患者HPV多重感染情況(%)

2.3 HPV亞型的分布及其與CINⅡ～Ⅲ、宮頸癌的關(guān)系 本研究3組共686例患者，檢出HPV感染464例，21種HPV亞型中，除HPV43亞型未檢出外，其他20種HPV亞型均被檢出。3組患者16、18、58、52和33亞型檢出率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=114.870、36.548、28.102、15.823、26.910，P均<0.001)，其余亞型檢出率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。采用logistic回歸分析顯示： 16型(OR=7.017，95% CI=4.114～11.970，P<0.001)、58型(OR=6.782，95% CI=2.977～15.450，P<0.001)、52型(OR=8.884，95% CI=1.915～41.212，P=0.001)、33型(OR=27.934，95% CI=3.644～214.115，P<0.001)HPV感染患CINⅡ～Ⅲ的風(fēng)險(xiǎn)升高。16型(OR=9.778，95% CI=6.155～15.534，P<0.001)、18型(OR=7.437，95%CI=3.151～17.551，P<0.001)、58型(OR=2.452，95% CI=1.099～5.469，P=0.024)、52型(OR=10.855，95%CI=2.571～45.839，P<0.001)HPV感染者患宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)升高。

表3 3組患者 HPV亞型感染分布情況(n，%)

注：多型感染，各亞型單獨(dú)計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)；#P<0.05。

2.4 各組內(nèi)不同年齡、民族患者HPV感染率的比較 對照組患者平均年齡41.97歲(95%可信區(qū)間為：40.65～43.32歲)；CINⅡ～Ⅲ組患者平均年齡42.98歲(95%可信區(qū)間為：41.33～44.63歲)；宮頸癌組患者平均年齡50.11歲(95%可信區(qū)間為：48.97～51.26歲)；3組患者均以35歲為界分為年輕組(≤35歲)、中老年組(>35歲)。對照組中，年輕組HPV感染率明顯高于中老年組患者(P<0.05)；宮頸癌組中，老年患者HPV感染率明顯高于年輕組患者(P<0.05)；CINⅡ～Ⅲ組中，年輕組患者與中老年組患者HPV感染率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。將3組患者分為漢族和少數(shù)民族。對照組、CINⅡ～Ⅲ組、宮頸癌組患者中漢族與少數(shù)民族HPV感染率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 各組內(nèi)年齡、民族患者HPV感染率的比較(%)

3 討 論

流行病學(xué)調(diào)查顯示，HPV感染是宮頸癌前病變和宮頸癌的主要致病因子，目前已經(jīng)分離出130多種HPV亞型，其中30余種與下生殖道良性疣及宮頸癌有密切關(guān)系。根據(jù)與女性生殖道腫瘤的關(guān)系，HPV被分為高危型和低危型，其中HPV6、11、42、43、44、CP8304屬低危型，一般不誘發(fā)癌變，多見于生殖道良性病變；HPV16、18、31、33、35、45、52、58等屬高危型，與宮頸癌的發(fā)生關(guān)系最為密切。本研究中，CINⅡ～Ⅲ組HPV感染率為86.26%、宮頸癌組為90.53%，均明顯高于對照組的20.74%(P<0.05)，3組患者均以含高危型HPV感染為主。說明CINⅡ～Ⅲ和宮頸癌與高危型HPV感染密切相關(guān)。

根據(jù)感染HPV病毒不同，可以分為單一感染和多重感染，多重感染中常見的有二重感染、三重感染，或者更多亞型的合并感染。目前研究雖然在單一HPV感染和多重HPV感染在宮頸疾病的發(fā)生發(fā)展、病情評估及預(yù)后影響上存在不同的意見，但均認(rèn)為多重感染與宮頸病變之間存在密切關(guān)系[2]。陶萍萍等[3]采用凱普導(dǎo)流雜交HPV DNA檢測各種宮頸病變，結(jié)果顯示隨著病變程度的升級，多重感染率逐漸增加，提示多重感染可能與宮頸病變的進(jìn)展有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，對照組、CINⅡ～Ⅲ組、宮頸癌組患者多重感染率分別為11.11%、27.43%、19.28%，CIN Ⅱ～Ⅲ組多重感染率明顯高于對照組(P<0.05)。提示多重感染可能在一定程度上有促進(jìn)宮頸病變加重的作用。但宮頸癌的多重感染率卻低于CINⅡ～Ⅲ組患者，并且與對照組的多重感染率比較無差異(P>0.05)。這與多重感染促進(jìn)宮頸病變加重的觀點(diǎn)并不符合，可能是由于宮頸癌患者子宮頸腫物壞死組織較多，影響取樣，導(dǎo)致宮頸癌患者HPV亞型檢測結(jié)果產(chǎn)生偏差。3組患者多重感染均以二重感染為主，最常見的二重感染型別為HPV16+52、HPV16+18、16+58等。多重感染中含有HPV16的混合感染所占比例最高。由此可見，無論在二重感染還是多重感染中，HPV16都是最主要的感染型別。

有研究顯示，CIN和宮頸癌患者的HPV感染型別和分布在不同區(qū)域有一定的差異[4]。不同亞型的HPV感染其致病后果不同，HPV陽性的宮頸癌患者中，HPV16型感染率最高[5]。本研究中，對照組、CINⅡ～Ⅲ組、宮頸癌組均以HPV16型感染為主要類型。 除HPV16型外，其他20種亞型分布則各有不同，有文獻(xiàn)報(bào)告[5]在拉丁美洲最常見的是33型，其次是39、59型，而在亞洲國家最常見的是58、52型。張東紅等[6]研究發(fā)現(xiàn)，我國宮頸癌HPV感染以HPV16、18、58為主，特別在南方長江中下游地區(qū)，58型感染僅次于16型。本研究HPV各亞型檢出率排序?yàn)镠PV16(41.25%)、18(10.35%)、58(9.33%)、52(6.27%)、33(3.94%)。HPV16型和18型檢出率均大于10%。logistic回歸分析結(jié)果顯示：CIN Ⅱ～Ⅲ的主要風(fēng)險(xiǎn)是感染HPV16、58、52、33型；宮頸癌的主要風(fēng)險(xiǎn)是感染HPV16、18、58、52型。猜測HPV16、58、52型是CINⅡ～Ⅲ和宮頸癌共同的危險(xiǎn)因素；HPV33型可能與CINⅡ～Ⅲ關(guān)系更為密切，而感染HPV18型則可能更容易引起宮頸癌。

近年來宮頸癌的發(fā)病有明顯年輕化趨勢。本組宮頸癌患者最小年齡為23歲，平均年齡50.11歲。將3組患者分別分為年輕組(≤35歲)、中老年組(>35歲)，發(fā)現(xiàn)宮頸癌組的中老年患者HPV感染率(91.88%)明顯高于年輕患者(76.67%)(P<0.05)，說明宮頸癌患者年齡越大的HPV感染率越高，考慮這可能與患者的免疫力下降及激素水平波動(dòng)大等有關(guān)。而在對照組中，HPV感染率則是年輕患者(31.48%)高于中老年患者(19.16%)(P<0.05)，可能由于年輕女性性生活較頻繁，性伴侶多，且免疫系統(tǒng)未被致敏，易受HPV病毒感染。宮頸細(xì)胞學(xué)形態(tài)正常，但可檢出HPV-DNA，相關(guān)文獻(xiàn)稱之為隱匿感染[7]。若這種HPV感染不及時(shí)消退，可能會(huì)進(jìn)一步發(fā)展，導(dǎo)致宮頸細(xì)胞學(xué)形態(tài)改變，引起宮頸癌前病變或?qū)m頸癌。對照組的年輕患者HPV感染率較高從另一方面也反映了宮頸癌年輕化。有文獻(xiàn)報(bào)道，不同地域、不同民族間因?yàn)槲幕町?、生活?xí)慣等因素可導(dǎo)致HPV感染譜不同[8]。廣西是多山地區(qū)，少數(shù)民族多集中居住在邊遠(yuǎn)山區(qū)。此次調(diào)查的患者中涉及多個(gè)民族，3組患者均包含有多個(gè)少數(shù)民族，如壯族、苗族、仫佬族等，本研究提示各民族HPV感染率比較無差異。

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龐小芬(1990～)，女，碩士，研究方向：婦科腫瘤。

莫凌昭(1971～)男，博士，副教授，研究方向：婦科腫瘤學(xué)，E-mail：1279512058@qq.com。

R 737.33

A

0253-4304(2016)10-1430-04

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.10.25

2016-04-18

2016-07-22)