腦脊液細菌16S核糖體RNA基因檢測在抗生素治療后化膿性腦膜炎患兒中的應用價值▲

鄭可魯 楊思達 高媛媛 陳文雄 黃怡玲 張雅妮

(廣州市婦女兒童醫(yī)療中心兒童神經內科，廣州市 510623，E-mail：zhao86453@163.com)

論著·臨床研究

腦脊液細菌16S核糖體RNA基因檢測在抗生素治療后化膿性腦膜炎患兒中的應用價值▲

鄭可魯 楊思達 高媛媛 陳文雄 黃怡玲 張雅妮

(廣州市婦女兒童醫(yī)療中心兒童神經內科，廣州市 510623，E-mail：zhao86453@163.com)

目的 探討腦脊液細菌16S 核糖體RNA(16S rRNA)基因檢測在抗生素治療后化膿性腦膜炎患兒中的應用價值。方法 選擇化膿性腦膜炎患兒60例，在抗生素使用早期及后期采集腦脊液標本，同時進行16S rRNA基因檢測及細菌培養(yǎng)，比較兩種方法的檢測陽性率，分析抗生素應用時間對兩種檢測方法結果的影響。結果 腦脊液16S rRNA基因檢測陽性21例(35.0%)，腦脊液細菌培養(yǎng)陽性9例(15.0%)，16S rRNA基因檢測陽性率高于細菌培養(yǎng)(P<0.05)?？股貞迷缙?6S rRNA基因檢測陽性率略高于抗生素應用后期，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；抗生素應用早期腦脊液細菌培養(yǎng)檢測陽性率高于抗生素應用后期(P<0.05)。結論 對于抗生素治療后化膿性腦膜炎患兒，腦脊液16S rRNA基因檢出陽性率高于腦脊液細菌培養(yǎng)，且可能更少受抗生素應用時間的影響。

化膿性腦膜炎；抗生素；腦脊液；16S 核糖體RNA；細菌培養(yǎng)；基因檢測

化膿性腦膜炎是一種小兒常見的疾病，其發(fā)病急，若不及時治療，患兒會出現(xiàn)嚴重后遺癥，嚴重者甚至死亡[1-2]。近年來，由于抗生素廣泛使用，兒童化膿性腦膜炎的臨床表現(xiàn)趨于不典型，診斷難度加大。傳統(tǒng)腦脊液細菌培養(yǎng)多需要48 h以上，藥物敏感試驗結果則需要72 h，且培養(yǎng)陽性率不高，極大限制了腦脊液細菌培養(yǎng)的應用[3-4]?？股刂委熀笃冢X脊液細菌培養(yǎng)陰性，而腦脊液常規(guī)和生化檢測卻持續(xù)異常，導致停用抗生素缺乏足夠依據(jù)。過早停藥會增加病情遷延、復發(fā)的概率；長時間用藥則增加患兒痛苦及其家庭的經濟負擔，且易致耐藥菌產生，不符合抗生素使用原則[5-6]。本研究以60例小兒化膿性腦膜炎患兒為研究對象，對患兒腦脊液進行16S核糖體RNA(16S ribosomal RNA，16S rRNA)基因檢測分析，并與腦脊液細菌檢測結果進行比較，分析抗生素應用時間對腦脊液細菌16S rRNA基因檢測的影響，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2014年2月至2016年3月在我院就診的化膿性腦膜炎患兒60例，其中男40例、女20例，年齡0.1～13歲，平均年齡6.5歲，病程3～7 d。診斷標準參考《實用新生兒學》中的相關診斷標準[7]：(1)體溫異常，精神差，拒奶，驚厥或有敗血癥的表現(xiàn)；(2)顱內壓增高，前囪隆起，骨縫裂開，腦膜刺激征陽性；(3)腦脊液：白細胞>20×106/L，葡萄糖降低，蛋白質升高；(4)腦脊液細菌培養(yǎng)陽性或涂片上可見細菌。符合(1)～(3)條可臨床診斷，具備(4)可確診。所有患兒均確診患有化膿性腦膜炎。本研究經我院倫理委員會同意，患兒家屬簽署知情同意書。

1.2 治療方法 根據(jù)患兒的細菌培養(yǎng)結果，使用青霉素、頭孢唑肟等相應敏感抗生素治療。對于病情較重患兒輔以高壓氧治療。根據(jù)患兒實際情況進行電解質平衡維持、丙種球蛋白支持以及甘露醇、地塞米松等對癥治療。

1.3 腦脊液檢測 抗生素治療<3 d為早期，治療后4 d至2周為后期；如腦脊液常規(guī)、生化2周仍明顯異常者，于抗生素治療4周第3次留取腦脊液做為后期標本。分別在抗生素應用早期、后期，通過嚴格無菌操作腰椎穿刺獲取組中患兒腦脊液標本，每位患兒標本分為兩份各2 ml，同時采用以下兩種方法進行檢測。

1.3.1 16S rRNA基因檢測：應用16S rRNA寬范圍PCR擴增技術，對化膿性腦膜炎患兒腦脊液標本中細菌基因組 DNA擴增，并將PCR陽性產物測序，明確細菌菌種。主要試劑與儀器包括：DNA提取試劑(廣州東盛生物科技有限公司)、PCR反應試劑盒(廣州東盛生物科技有限公司)、9600型PCR分析儀(美國ABI公司)。主要步驟如下：(1) 16S rRNA寬范圍PCR擴增法：取2 ml腦脊液離心后沉淀以500 μl TE緩沖液懸浮，經溶菌酶、蛋白酶K孵育，用酚-氯仿法提取腦脊液中DNA。對照菌株經LB培養(yǎng)基增菌后取2 ml，通過以上方法提取腦脊液標本中細菌DNA。采用寬范圍 PCR 擴增，PCR反應條件為：95℃預變性5 min，然后95℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，30個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。每次擴增臨床標本時均包含陽性對照和陰性對照，陽性對照為金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌標準菌株，陰性對照為PCR體系中不加模板DNA。(2)在GenBank(www.ncbi.nlm.nih.gov/)中應用BLAST檢索工具對所有陽性PCR產物進行序列對比，從而確立菌名。在GenBank中比對結果同源性超過 98%才能確立為同一種屬。

1.3.2 普通細菌培養(yǎng)：(1)腦脊液標本接種于美國BacT/ALERT的兒童專用樹脂培養(yǎng)瓶(美國 bioMerieux公司)中，放置BACTEC 9120全自動培養(yǎng)箱(北京普博斯生物科技有限公司)中培養(yǎng)。 (2)陽性報警后移種血、流感嗜血桿菌XV瓊脂平皿，培養(yǎng)18～24 h，分離菌株。(3)采用臨床實驗室標準委員會制訂的標準進行判斷和藥敏試驗[8]。

1.4 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 18.0進行統(tǒng)計學分析，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 兩種檢測方法的檢測結果比較 60例化膿性腦膜炎患兒中，腦脊液16S rRNA基因檢測陽性21例，其中金黃色葡萄球菌4例，大腸埃希菌4例，肺炎鏈球菌3例，無乳鏈球菌3例，腦膜炎球菌3例，流感嗜血桿菌3例，脆弱擬桿菌1例。腦脊液細菌培養(yǎng)陽性9例，其中金黃色葡萄球菌3例，大腸埃希菌2例，腦膜炎球菌2例，流感嗜血桿菌1例，肺炎鏈球菌1例。16S rRNA基因檢測陽性率為35.0%(21/60)，高于細菌培養(yǎng)的15.0%(9/60)，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=6.400，P=0.011)。

2.2 抗生素應用時間對腦脊液細菌16S rRNA基因檢測及細菌培養(yǎng)影響 抗生素應用早期16S rRNA基因檢測陽性率略高于抗生素應用后期，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；抗生素應用早期腦脊液細菌培養(yǎng)陽性率高于抗生素應用后期(P<0.05)。見表1。

表1 不同抗生素應用時期兩組檢測結果比較(n，%)

3 討 論

小兒化膿性腦膜炎是指由化膿性細菌感染導致患兒中樞神經感染的炎癥。近年來，抗生素的不規(guī)范使用，導致患兒化膿性腦膜炎早期臨床表現(xiàn)不明顯，腦脊液檢測結果不穩(wěn)定，如不及時治療會導致患兒出現(xiàn)一系列后遺癥，嚴重者會有生命危險[9]。因此，探討小兒化膿性腦膜炎抗生素應用時間對腦脊液細菌16S rRNA基因檢測的影響，為小兒化膿性腦膜炎早期確診提供參考，有重要的意義。

16S rRNA基因是細菌染色體上編碼16S rRNA相對應的DNA序列，存在于所有細菌的染色體基因組中，但不存在于病毒、真菌等非原核生物體內[10-11]。它具有多拷貝、多信息、長度適中等特點，集保守性與變異性于一身，既能反映不同菌屬之間的差異，又能利用測序技術較容易地得到其序列[8，12]。應用16S rRNA寬范圍PCR擴增技術，可在抗生素應用早、后期對化膿性腦膜炎患兒腦脊液中細菌基因組DNA進行擴增，并將PCR陽性產物測序，明確細菌菌種。而傳統(tǒng)的腦脊液細菌培養(yǎng)檢測，由于還沒有專門的檢測儀器完成對腦脊液自動判斷，只能通過人工鏡像檢測觀察的方法對腦脊液細胞分析，同時采用生化分析儀完成對腦脊液中葡萄糖、蛋白質進行簡單分析，這些方法受人為因素影響較大，檢測可靠性得不到保證[13]。此外，由于患者多為嬰兒，腦脊液總量少，難以足量留取標本量以提高培養(yǎng)陽性率，亦對腦脊液細菌培養(yǎng)影響較大。本研究結果顯示，患者中16S rRNA基因檢測陽性21例(35.0%)，腦脊液細菌培養(yǎng)陽性僅9例(15.0%)，16S rRNA基因檢出陽性率顯著高于腦脊液細菌培養(yǎng)(P<0.05)。

本研究結果顯示，抗生素應用早期16S rRNA基因檢測陽性率為36.67%，略高于應用抗生素后期，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而抗生素應用早期腦脊液細菌培養(yǎng)檢測陽性率顯著高于應用抗生素后期(P<0.05)，提示與腦脊液細菌培養(yǎng)比較，腦脊液16S rRNA基因檢測可能更少受抗生素應用時間的影響。這是由于腦脊液細菌16S rRNA基因檢測不受腦脊液中細菌增殖分裂的影響，即使腦脊液中細菌濃度較低，也能獲得較好的檢測結果。這表明即使在服用抗生素治療后期，腦脊液16S rRNA基因檢測亦能得到準確的檢測結果，為停用抗生素提供有力判斷依據(jù)，避免抗生素的濫用及病情的遷延與反復。

綜上所述，在抗生素治療化膿性腦膜炎患兒中，進行腦脊液16S rRNA基因檢測較傳統(tǒng)細菌培養(yǎng)法具有較高的陽性率，且在抗生素應用早期及后期的檢出陽性率差異不大。這有助于提高對化膿性腦膜炎患兒的早期診斷能力，并為臨床醫(yī)師及時、合理地使用抗生素治療提供依據(jù)。

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Application value of cerebrospinal fluid bacterial 16S ribosomal RNA gene detection in children with purulent meningitis after antibiotic therapy

ZHENGKe-lu,YANGSi-da,GAOYuan-yuan,CHENWen-xiong,HUANGYi-ling,ZHANGYa-ni

(DepartmentofPediatricNeurology,GuangzhouWomenandChildrenMedicalCenter,Guangzhou510623,China)

Objective To investigate the application value of cerebrospinal fluid(CSF) bacterial 16S ribosomal RNA(16S rRNA) gene detection in children with purulent meningitis after antibiotic therapy.Methods Sixty children with purulent meningitis were enrolled.The CSF specimens were collected during the early and late stages of antibiotic therapy,and used for 16S rRNA gene detection and at the bacterial culture.The detection positive rates were compared between the two methods,and the effect of antibiotic application time on the results of the two methods was analyzed.Results Twenty-one(35.0%) and 9(15.0%) positive cases were observed in CSF 16S rRNA gene detection and CSF bacterial culture respectively.The detection positive rate of 16S rRNA gene detection was higher than that of bacterial culture(P<0.05).For 16S rRNA gene detection,the detection positive rate during the early stage of antibiotic therapy was higher than that during the late stage,but no statistical difference was observed(P>0.05).For CSF bacterial culture,the detection positive rate during the early stage of antibiotic therapy was significantly higher than that during the late stage(P<0.05).Conclusion For the children with purulent meningitis after antibiotic therapy,the detection positive rate of CSF 16S rRNA gene detection is higher and is less affected by the application time of antibiotics compared to the rate of CSF bacterial culture.

Purulent meningitis,Antibiotics,Cerebrospinal fluid,16S ribosomal RNA,Bacterial culture,Gene detection

廣東省廣州市衛(wèi)生局課題(20151A010050)

鄭可魯(1979～)，男，本科，主治醫(yī)師，研究方向：神經內科。

R 512.3

A

0253-4304(2016)10-1367-03

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.10.08

2016-05-15

2016-07-18)