外周血核因子κB及過氧化物酶Ⅲ在早期肝細(xì)胞癌患者中的表達(dá)水平及其應(yīng)用價值▲

劉艷波 夏醫(yī)君

(1 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第四醫(yī)院急診醫(yī)學(xué)科，義烏市 322000，E-mail：mazhongping_efy@163.com；2 內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院肝膽胰脾外科，呼和浩特市 010017)

論著·臨床研究

外周血核因子κB及過氧化物酶Ⅲ在早期肝細(xì)胞癌患者中的表達(dá)水平及其應(yīng)用價值▲

劉艷波1夏醫(yī)君2

(1 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第四醫(yī)院急診醫(yī)學(xué)科，義烏市 322000，E-mail：mazhongping_efy@163.com；2 內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院肝膽胰脾外科，呼和浩特市 010017)

目的 探討外周血核因子κB(NF-κB)及過氧化物酶Ⅲ(PrdxⅢ)在早期肝細(xì)胞癌(HCC)患者中的表達(dá)水平及其應(yīng)用價值。方法 選擇128例HCC患者(HCC組)、144例肝硬化患者(肝硬化組)以及100例健康人群(對照組)，測定各組血漿NF-κB、血清甲胎蛋白(AFP)、PrdxⅢ水平，采用受試者工作特征曲線對三者單獨或聯(lián)合診斷HCC的敏感度、特異度進(jìn)行分析。結(jié)果 肝硬化組患者血漿NF-κB及血清PrdxⅢ水平均高于對照組(P<0.05)，HCC組血漿NF-κB及血清PrdxⅢ、AFP水平顯著高于對照組、肝硬化組(P<0.05)，但肝硬化組與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。NF-κB及PrdxⅢ聯(lián)合診斷HCC的敏感度為89.41%，特異度為90.45%，而NF-κB、AFP及PrdxⅢ聯(lián)合診斷HCC的敏感度為98.73%，特異度為91.16%，均高于單獨診斷或其他兩兩聯(lián)合診斷。結(jié)論 早期HCC患者外周血NF-κB及PrdxⅢ表達(dá)水平升高。NF-κB及PrdxⅢ聯(lián)合檢測或兩者聯(lián)合血清AFP檢測均可提高HCC診斷的敏感度和特異度，對HCC的早期診斷具有十分重要的臨床價值。

肝細(xì)胞癌；核因子κB；甲胎蛋白；過氧化物酶Ⅲ

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是全球患病率第5、致死率居于第3的惡性疾病[1-2]。流行病學(xué)資料表明，2011年我國肝癌新發(fā)病例約35.6萬例，發(fā)病率為 26.39/10萬，位居我國全部惡性腫瘤的第4位[3]。其具有發(fā)病迅速、惡性程度高、患者生活質(zhì)量差等特點，為此早檢測、早診斷、早治療的“三早”原則對于干預(yù)肝癌疾病進(jìn)程，提高患者生活質(zhì)量具有重要意義。目前，血清甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)廣泛應(yīng)用于HCC的臨床早期檢測及篩查工作，但由于其診斷HCC的敏感度僅為40%～65%，特異度為76%～96%以及較高的假陰性和假陽性結(jié)果，因此，AFP作為HCC早期檢測及篩查指標(biāo)并不理想[4-6]。近年來，研究表明血漿核因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)的活性變化與肝細(xì)胞受損再生、肝癌細(xì)胞周期紊亂、增殖密切相關(guān)，而過氧化物酶Ⅲ(peroxiredoxin Ⅲ，PrdxⅢ)的過度表達(dá)與HCC進(jìn)程顯著相關(guān)，且其在HCC早期診斷中有較高的靈敏性及特異性[7-8]。為此，本研究在健康及不同肝臟疾病人群中聯(lián)合檢測血漿NF-κB、血清AFP及PrdxⅢ水平，以探討其聯(lián)合檢測在HCC早期診斷、篩查中的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2013年11月至2015年10月浙江省杭州市余杭區(qū)中醫(yī)院、浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第四醫(yī)院普外科收治的128例HCC患者(HCC組)、144例肝硬化患者(肝硬化組)以及同期在體檢中心進(jìn)行健康體檢的100例健康人群(對照組)為研究對象。其中，HCC的診斷參照《原發(fā)性肝細(xì)胞癌的臨床診斷與分期標(biāo)準(zhǔn)》中的診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]，并經(jīng)手術(shù)或介入及病理證實；患者均采用TNM分期，均為0～Ⅰ期或Ⅱ期；肝硬化的診斷參照《病毒性肝炎防治方案》[10]中的診斷標(biāo)準(zhǔn)。HCC組患者的排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)不符合肝細(xì)胞肝癌病理診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)接受術(shù)前及術(shù)后的經(jīng)動脈化療栓塞等輔助治療；(3)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，如術(shù)后的肝外轉(zhuǎn)移術(shù)后；(4)術(shù)后生存期未超過1個月。肝硬化組患者的排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)不符合肝硬化診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)肝外膽管梗阻者；(3)伴有病毒性肝炎甲、乙、丙、丁、戊型肝炎及酒精性肝病者；(4)自身免疫性肝炎或者合并其他免疫病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡等。對照組均排除心、腦、肺、肝、腎、胰、脾等器官疾病及基礎(chǔ)疾病者，且肝功能、肝炎標(biāo)志物檢查、腹部B超、查體等結(jié)果均提示正常。3組性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性，見表1。

表1 各組人群性別、年齡比較

1.2 血液標(biāo)本的采集 采用兩種不同的一次性真空采血管，清晨空腹抽取靜脈血2份(每份3 ml)，其中一份用乙二胺四乙酸二鈉鹽抗凝劑處理，經(jīng)離心(1 000 g/min，20 min)處理后，獲得血漿并保存上清液于-20℃冰箱用于測定血漿NF-κB水平。另外一份不添加試劑的血樣經(jīng)離心(3 500 g/min，5 min)處理后，吸取上清，12 000 g/min離心10 min，棄去細(xì)胞碎片沉淀，吸取上清獲得血清并保存于-20℃冰箱用于測定AFP及PrdxⅢ水平。HCC組及肝硬化組均于治療前進(jìn)行血清相關(guān)因子水平的檢測。

1.3 細(xì)胞因子的測定 血漿NF-κB因子、血清PrdxⅢ的測定采用酶聯(lián)免疫吸附實驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(上海美軒生物科技有限公司，生產(chǎn)批號MEXN-H0033-1412005、MEXN-H0267-1406012)進(jìn)行測定。實驗操作嚴(yán)格按照試劑盒說明說進(jìn)行，主題步驟如下：依次將標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品、生物素化的抗NF-κB或PrdxⅢ、HRP標(biāo)記的親和素加入往預(yù)先包被抗NF-κB或PrdxⅢ抗體的微孔中，經(jīng)過經(jīng)過溫育并徹底洗滌。用底物顯色，待測物質(zhì)在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色；溶液顯色的程度與待測物質(zhì)中NF-κB或PrdxⅢ水平呈正相關(guān)。隨即利用酶標(biāo)儀(λ=450 nm)測定光密度(A值)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得出NF-κB或PrdxⅢ的濃度。血清AFP水平的測定采用電化學(xué)發(fā)光法，試劑、質(zhì)控物及校準(zhǔn)品均由羅氏公司提供(AFP試劑盒生產(chǎn)批號：152176；配套校準(zhǔn)品生產(chǎn)批號：181650)，儀器為羅氏e601全自動電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料采用(x±s)表示，組間比較采用單因素ANOVA分析。AFP、NF-κB、PrdxⅢ因子診斷的準(zhǔn)確性采用ROC曲線、ROC曲線下面積、95%CI進(jìn)行評估。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組AFP、NF-κB、PrdxⅢ水平的比較 肝硬化組及HCC組患者血漿NF-κB及PrdxⅢ水平均高于對照組(P<0.05)；HCC組血漿NF-κB及PrdxⅢ水平均高于肝硬化組(P<0.05)。HCC組血清AFP水平顯著高于對照組、肝硬化組(P<0.05)，但肝硬化組與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組AFP、NF-κB、PrdxⅢ水平比較(x±s，ng/ml)

注：與對照組比較，aP<0.05；與肝硬化組比較，bP<0.05。

2.2 血漿NF-κB及血清AFP、PrdxⅢ單獨或者聯(lián)合檢測HCC的ROC曲線分析 AFP+NF-κB+PrdxⅢ三者聯(lián)合診斷的敏感度及特異度最高，其次為NF-κB+PrdxⅢ兩者聯(lián)合診斷，NF-κB單獨診斷敏感度最低，AFP單獨診斷特異度最低。見表3。

表3 血漿NF-κB及血清AFP、PrdxⅢ單獨或者聯(lián)合檢測HCC的ROC曲線分析

3 討 論

HCC是由慢性肝臟疾病，如慢性肝炎、肝硬化發(fā)展而來。HCC患者具有較低的生存率[11-12]，因此，對于HCC進(jìn)行早期診斷及治療非常重要。目前，大多數(shù)臨床醫(yī)師除了依據(jù)影像學(xué)技術(shù)診斷HCC外，還采用簡便易行的檢測血清AFP來評估HCC的嚴(yán)重程度。本研究結(jié)果顯示，與肝硬化組及對照組比較，HCC組患者AFP水平顯著升高(P<0.05)，這與Nagaoka等[13]的研究結(jié)果相似。但本研究HCC患者中有18例(28.1%)血清AFP水平低于400 ng/dl，且AFP特異性最低，靈敏度亦不高。而近年來也有研究顯示，AFP由于較低的靈敏度及特異性并不能成為完全可靠的HCC早期診斷、預(yù)防及治療的腫瘤標(biāo)志物[14-15]。理想的腫瘤標(biāo)志物應(yīng)該具有較高的敏感性及特異性，且方便、易測量、微創(chuàng)、準(zhǔn)確，能夠被患者和醫(yī)生普遍接受[16]。

近年研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB是炎癥的核心調(diào)節(jié)因子，肝硬化炎癥反應(yīng)過程及癌癥進(jìn)程所涉及的許多炎癥因子都由NF-κB激活[17]。PrdxⅢ可防御活性氧自由基損害及保護(hù)細(xì)胞免受過氧化氫誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[18]。本研究結(jié)果顯示，與其他兩組相比，HCC組患者血漿NF-κB及Prdx3水平顯著升高(P<0.05)，這與Arsura等[19]的研究結(jié)果相似。Wu等[20]發(fā)現(xiàn)肝臟NF-κB在肝癌發(fā)生時異常增高。Yokoo等[21]報告與HCC癌旁組織相比，HCC癌組織中NF-κB持續(xù)激活。有學(xué)者提出NF-κB信號通路活化是人類肝癌進(jìn)程中主要的分子事件之一[22]。故NF-κB在肝損傷、肝纖維化、肝癌進(jìn)程中可能處于中心環(huán)節(jié)，有望成為肝癌預(yù)防及治療的靶標(biāo)[7]。PrdxⅢ在移除細(xì)胞活性氧時其表達(dá)增高，可抑制細(xì)胞凋亡，有益于腫瘤生長及侵襲[23-24]。Qiao等[25]對HCC組織及癌旁組織蛋白組學(xué)圖譜進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織比較，94.9% HCC患者腫瘤組織的PrdxⅢ過表達(dá)，且PrdxⅢ的過表達(dá)與患者預(yù)后不良相關(guān)。這提示PrdxⅢ影響肝癌的進(jìn)展，有望成為HCC潛在的治療靶標(biāo)。有研究報告血清PrdxⅢ診斷HCC的敏感性、特異性可分別達(dá)85.9%、75.3%[8]，與本研究結(jié)果相似。因此血清PrdxⅢ可作為診斷HCC及評估預(yù)后的非侵襲腫瘤標(biāo)志物[8]。

此外，本研究結(jié)果顯示，AFP、NF-κB和PrdxⅢ三項指標(biāo)聯(lián)合檢測 HCC 的靈敏度、特異度均高于單項檢測及兩兩聯(lián)合檢測，表明三項指標(biāo)在診斷及鑒別診斷 HCC 方面具有優(yōu)勢。AFP、NF-κB和PrdxⅢ三項指標(biāo)聯(lián)合檢測有望成為臨床上早期診斷及鑒別診斷HCC的一個新思路，值得在臨床上推廣。

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Expression levels and application value of peripheral blood nuclear factor-kappa B and peroxiredoxin Ⅲ in patients with early-stage hepatocellular carcinoma

LIUYan-bo1,XIAYi-jun2

(1DepartmentofEmergency,theFourthAffiliatedHospitalofZhejiangUniversitySchoolofMedicine,Yiwu322000,China; 2DepartmentofHepatobiliaryandPancreasSurgery,InnerMongoliaPeople′sHospital,Hohhot010017,China)

Objective To investigate the expression levels and application value of peripheral blood nuclear factor kappa B(NF-κB) and peroxiredoxin Ⅲ(PrdxⅢ) in patients with early-stage hepatocellular carcinoma(HCC).Methods A total of 128 patients with HCC(HCC group),144 patients with liver cirrhosis(liver cirrhosis group) and 100 healthy individuals(control group) were enrolled.The levels of plasma NF-κB,serum alpha-fetoprotein(AFP) and PrdxⅢ were measured in each group.The sensitivity and specificity of the three indices for the diagnosis of HCC alone or jointly were analyzed by receiver operating characteristic curve.Results The levels of plasma NF-κB and serum PrdxⅢ in the liver cirrhosis group were significantly higher than those in the control group(P<0.05),and the levels of plasma NF-κB,serum PrdxⅢ and AFP in the HCC group were higher than those in the control group or liver cirrhosis group(P<0.05).There was no significant difference between liver cirrhosis group and control group(P>0.05).The sensitivity and specificity of NF-κB combined with PrdxⅢ for diagnosing HCC were 89.41% and 90.45% respectively,and the sensitivity and specificity of NF-κB combined with AFP and PrdxⅢ for diagnosing HCC were 98.73% and 91.16% respectively,which were all higher than the sensitivity and specificity of each index alone or the other pairs.Conclusion The expression levels of peripheral blood NF-κB and PrdxⅢ increase in the patients with early-stage HCC.Either NF-κB combined with PrdxⅢ or the two indices combined with serum AFP can increase the sensitivity and specificity for diagnosing HCC,which has an important clinical value for the early diagnosis of HCC.

Hepatocellular carcinoma,Nuclear factor kappa B,Alpha-fetoprotein,Peroxiredoxin Ⅲ

內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金(2013MS11114)；內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院院內(nèi)基金項目(20110920)

劉艷波(1985～)，男，本科，主治醫(yī)師，研究方向：急診醫(yī)學(xué)。

夏醫(yī)君(1963～)，男，碩士，教授，研究方向：肝膽胰脾外科，E-mail：sunhaibin_bmyy@126.com。

R 735.7

A

0253-4304(2016)04-0467-04

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.04.06

2016-01-06

2016-03-17)