犬卵透明帶3蛋白原核表達(dá)和抗血清的制備

張貝貝， 王穎， 張冀， 張富春

(新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆生物資源基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊830046)

犬卵透明帶3蛋白原核表達(dá)和抗血清的制備

張貝貝， 王穎， 張冀， 張富春*

(新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆生物資源基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊830046)

在研發(fā)控制流浪犬卵透明帶3(CZP3)免疫不育疫苗的過(guò)程中，需要制備特異性的CZP3抗血清進(jìn)行免疫檢測(cè)。本研究克隆獲得CZP3的cDNA(全長(zhǎng)1 281 bp)和除去跨膜區(qū)和信號(hào)肽的核心片段(CZP3C，984 bp)，通過(guò)構(gòu)建原核表達(dá)載體pET28a-CZP3C，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)。在28 ℃下以0.6 mmol·L-1異丙基硫代β-D-半乳糖苷誘導(dǎo)表達(dá)4 h，獲得CZP3C融合蛋白。利用CZP3C融合蛋白免疫新西蘭大白兔，制備特異性的抗血清，并對(duì)抗血清的特異性和效價(jià)進(jìn)行評(píng)價(jià)。SDS-PAGE結(jié)果表明，融合蛋白以包涵體形式存在。經(jīng)過(guò)鎳柱親和純化及8 mmol·L-1尿素復(fù)性后，獲得了高純度的CZP3C融合蛋白。用0.8g·L-1的CZP3C融合蛋白免疫新西蘭大白兔，免疫后的兔抗血清用Western blot及間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，結(jié)果證明CZP3C兔抗血清具有較高的特異性，ELISA檢測(cè)效價(jià)為1∶409 600。本研究所制備的抗血清能夠?yàn)榱骼巳庖卟挥呙绲难兄铺峁z測(cè)材料。

犬；卵透明帶3；原核表達(dá)；融合蛋白；抗血清

目前，城市流浪狗數(shù)量激增已成為一個(gè)全球性的問(wèn)題(?zenetal.,2016；Rinzinetal.,2016)，隨之而來(lái)的擾民傷人、制造交通事故、污染環(huán)境和傳播疾病等問(wèn)題，極大地激起了與人類(lèi)的矛盾并亟待解決(Houetal.,2012；Cima，2013；Ortiz-Pradoetal.,2015)。現(xiàn)已知約100多種人畜共患病是由狗和貓所攜帶并傳播的(Kareshetal.,2012；Zangenahetal.,2016)。因此，有效控制流浪動(dòng)物的數(shù)量成為了一個(gè)迫切的社會(huì)問(wèn)題(Tottonetal.,2010；?zenetal.,2016；Rinzinetal.,2016)。

哺乳動(dòng)物從受精到新個(gè)體產(chǎn)生是一個(gè)精密且復(fù)雜的過(guò)程，為使卵細(xì)胞受精，精子必須結(jié)合并穿透卵透明帶(zona pellucida)和卵細(xì)胞膜融合(Eggeetal.,2015)。卵透明帶是圍繞在哺乳動(dòng)物卵細(xì)胞和早期胚胎表面的一層細(xì)胞膜外結(jié)構(gòu)，通常情況下由3～4種糖蛋白組成(包括ZP1、ZP2、ZP3和ZP4)(Stetsonetal.,2014)，ZP3是卵透明帶的重要組成部分，作為精子的初級(jí)受體，在受精過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。精子只有和ZP3相互作用后，才能穿過(guò)卵透明帶與卵細(xì)胞膜融合，形成受精卵(Miwa，2015)，并引起卵透明帶三維結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，阻止其他精子進(jìn)入，避免多精子受精現(xiàn)象的出現(xiàn)(Shresthaaetal.,2015)。核酸疫苗和蛋白類(lèi)疫苗通過(guò)激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生抗ZP3抗體，同卵細(xì)胞表面的ZP3結(jié)合，占據(jù)精子的結(jié)合位點(diǎn)，使精子無(wú)法識(shí)別和結(jié)合卵透明帶，最終導(dǎo)致受精失敗(Wassarman & Litscher，2010)，因此，ZP3被認(rèn)為是不孕疫苗的理想靶抗原。以卵透明帶為基礎(chǔ)的不孕疫苗已經(jīng)在控制美國(guó)的野馬Equuscaballus(Turner & Kirkpatrick，2002)和白尾鹿Odocoileusvirginianus(Milleretal.,2000)的種群數(shù)量上產(chǎn)生了明顯效果，且未對(duì)免疫動(dòng)物的健康產(chǎn)生較大的影響。澳大利亞和新西蘭也已經(jīng)廣泛展開(kāi)以卵透明帶為潛在疫苗控制灰袋鼠Macropusgiganteus和刷尾負(fù)鼠Trichosurusvulpecula種群的研究工作(Curtisetal.,2007；Kitcheneretal.,2009)。因此，以卵透明帶為基礎(chǔ)的不孕疫苗很可能為緩解人類(lèi)與野生動(dòng)物生存環(huán)境的沖突，控制野生動(dòng)物的種群數(shù)量，并防止人畜共患病等諸多問(wèn)題提供一個(gè)很好的解決思路(Hanetal.,2010)。

本研究通過(guò)原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)犬卵透明帶3核心片段(core fragment of canine zona pellucida 3，CZP3C)融合蛋白，在純化融合蛋白后免疫新西蘭大白兔，獲得抗血清，并在體外情況下初步驗(yàn)證了抗血清與小鼠卵細(xì)胞表面精子抗原表位結(jié)合的能力，為犬不育疫苗的深入研究奠定了理論基礎(chǔ)，也為進(jìn)一步研究有效的CZP3疫苗提供檢測(cè)材料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 體質(zhì)量為2 kg的雌性新西蘭大白兔和8周齡雌性KM小鼠均購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(新)2011—0003，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(新)2011—0001]。1.1.2 儀器和試劑 Trizol試劑為Invitrogen公司產(chǎn)品，RT-PCR試劑盒、EcoR I、XhoI和Solution I快速連接酶均為T(mén)aKaRa公司產(chǎn)品，質(zhì)粒提取試劑盒和DNA膠回收試劑盒為OMEGA公司產(chǎn)品，弗氏完全佐劑和不完全佐劑為Sigma公司產(chǎn)品，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG和FITC標(biāo)記的抗小鼠IgG二抗為北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，蛋白marker和BCA蛋白定量試劑盒為T(mén)hermo Fisher公司產(chǎn)品，注射用孕馬血清促性腺激素(pregnant mare’s serum gonadotropin，PMSG)和注射用人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，HCG)為浙江寧波市三生藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，BMOC培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品，鏈霉素和青霉素為上海復(fù)申生物科技有限公司產(chǎn)品，透明質(zhì)酸酶為上海源葉生物科技有限公司產(chǎn)品，感受態(tài)細(xì)胞EscherichiacoliDH5α和BL21(DE3)為北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，超聲破碎儀為寧波新之生物科技有限公司生產(chǎn)。原核表達(dá)載體pET28a及pMD18-T由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1CZP3C基因的克隆及重組表達(dá)載體的構(gòu)建 取新鮮的比格犬卵巢組織，以Trizol法提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄cDNA，以cDNA為模板，再以上游引物(P1)5’-CGGAATTCCAGACCATTTGGCCGACCGAAAC-3’和下游引物(P2)5’-CCGCTCGAGATTGCGGGTATGTGACACGCTA-3’進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，31個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。獲得除去跨膜區(qū)和信號(hào)肽的984 bp核心片段，與pMD18-T連接后通過(guò)藍(lán)白斑篩確定正確連接的重組克隆載體后進(jìn)行酶切、測(cè)序及膠回收，將pET28a和回收產(chǎn)物同時(shí)用EcoRⅠ和XhoⅠ 37 ℃過(guò)夜雙酶切，用PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收，用Solution Ⅰ快速連接酶連接4 h，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至DH5α，經(jīng)鑒定正確之后，轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株BL21(DE3)中后再次提取質(zhì)粒雙酶切鑒定。

1.2.2 CZP3C融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的優(yōu)化 將-80 ℃保存的陽(yáng)性菌落按1/100接入5 mL含1/1 000卡那霉素的LB培養(yǎng)液中，第二次活化后，同樣再按1/100接入36管含5 mL 1/1 000卡那霉素的LB培養(yǎng)液中，于37 ℃，220 r·min-1條件下培養(yǎng)4 h至OD600為0.6～0.8后，取誘導(dǎo)前LB培養(yǎng)液1 mL作對(duì)照，分別進(jìn)行3個(gè)溫度：20 ℃、28 ℃和37 ℃；6個(gè)IPTG濃度：0.1 mmol·L-1、0.2 mmol·L-1、0.4 mmol·L-1、0.6 mmol·L-1、0.8 mmol·L-1和1.0 mmol·L-1進(jìn)行表達(dá)條件優(yōu)化，220 r·min-1誘導(dǎo)4 h后，收集菌體，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌沉淀3次后，用500L PBS懸浮菌體沉淀，超聲破碎收集上清，沉淀用500L PBS懸浮，SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)蛋白表達(dá)情況，篩選出最佳的蛋白表達(dá)條件。

1.2.3 CZP3C融合蛋白包涵體的純化 將4 ℃保存活化后的菌株按1/100接入1 L含1/1 000卡那霉素的LB培養(yǎng)液中，于37 ℃，220 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)4 h至OD600為0.6～0.8，離心收集菌體沉淀，用20 mL PBS懸浮后，超聲破碎，棄上清，收集沉淀，用含8 M尿素的結(jié)合緩沖液充分溶解包涵體沉淀，離心后上清用0.45 mm濾器過(guò)濾上鎳柱結(jié)合2 h后，用40 mmol·L-1、100 mmol·L-1、200 mmol·L-1、300 mmol·L-1和500 mmol·L-1的咪唑洗滌柱子各3次，收集包括穿流在內(nèi)的所有洗滌液，SDS-PAGE檢測(cè)各組分內(nèi)蛋白成分，確定目的蛋白的洗脫條件后，將洗脫液裝入選取合適孔徑的透析袋內(nèi)，分別用8 mol·L-1、6 mol·L-1、4 mol·L-1和2 mol·L-1濃度尿素逐步梯度降低的方法進(jìn)行尿素梯度透析除鹽和復(fù)性各12 h，48 h后將透析袋內(nèi)的蛋白進(jìn)行定量，置于-80 ℃保存。1.2.4 CZP3C融合蛋白Western blot特異性分析 將抗原蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳后，然后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉4 ℃封閉2 h，TBS-T漂洗3遍，每次10 min，然后將PVDF膜轉(zhuǎn)入含抗His標(biāo)簽抗體(1∶2 000)3%脫脂奶粉的一抗中，低速搖床上結(jié)合2 h，TBS-T洗膜3次，每次10 min，接著與HRP標(biāo)記羊抗兔二抗在低速搖床上結(jié)合1 h，TBS-T洗膜3次，每次10 min，最后用DAB顯色至目的條帶清晰。

1.2.5 抗血清的制備 將弗氏完全佐劑500 μL與抗原蛋白500 μL(蛋白濃度為800 μg·mL-1)共1 mL，1∶1完全乳化后，采用背部、足掌、淋巴結(jié)周?chē)⒍蟮攘馨徒Y(jié)富集處皮內(nèi)或皮下多點(diǎn)注射免疫新西蘭大白兔，注射抗原蛋白量為每只兔子400g。2周后，第一次加強(qiáng)免疫，抗原蛋白含量減半為每只兔子200 μg，總注射量不變，4周后，第二次加強(qiáng)免疫，方法同上。整個(gè)過(guò)程共免疫3次，每次免疫前從耳緣靜脈采血，收集血清并于-20 ℃保存。第二次加強(qiáng)免疫后第10天，耳緣靜脈采血檢測(cè)抗體水平，當(dāng)抗體水平符合陽(yáng)性血清的要求時(shí)，于第14天采用耳緣動(dòng)脈和頸動(dòng)脈法放血，收集血清，檢測(cè)抗血清效價(jià)后置于-80 ℃保存。

1.2.6 抗血清效價(jià)檢測(cè) 將純化的蛋白作為抗原過(guò)夜包被酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)板，將分離的抗血清按照1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600和1∶3 200等比例稀釋后作為一抗，羊抗兔IgG(1∶3 000)作為二抗，最后用TMB顯色15～30 min，ELISA終止液終止反應(yīng)后用酶標(biāo)儀在OD450下檢測(cè)其光密度(optical density，OD)值，免疫前血清作為陰性對(duì)照。

1.2.7 抗血清特異性檢測(cè) 將抗原蛋白SDS-PAGE凝膠電泳后直接電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉4 ℃封閉2 h，TBS-T漂洗3遍，每次10 min，然后將PVDF膜轉(zhuǎn)入含CZP3C抗血清的(1∶500)3%脫脂奶粉的一抗中，低速搖床上結(jié)合2 h，TBS-T洗膜3次，每次10 min，之后與HRP標(biāo)記羊抗兔二抗在低速搖床上結(jié)合1 h，TBS-T洗膜3次，每次10 min，最后用DAB顯色至目的條帶清晰。

將10只KM小鼠隨機(jī)分為2組，每組5只。每只小鼠腹腔注射15 U PMSG，48 h后再次腹腔注射15 U HCG，14 h后用針頭挑破壺腹部，收集卵細(xì)胞團(tuán)，1%的透明質(zhì)酸酶處理10 min，用加熱拉伸過(guò)的巴斯德管將分散開(kāi)的單獨(dú)卵細(xì)胞轉(zhuǎn)移至新的BMOC培養(yǎng)基中，接著用PBS沖洗3遍，轉(zhuǎn)移至用多聚賴(lài)氨酸處理過(guò)的防脫片上，用無(wú)水乙醇進(jìn)行固定，之后用5%BSA 37 ℃CO2培養(yǎng)箱中封閉1 h，PBS沖洗3遍后轉(zhuǎn)入含有抗血清(1∶50，對(duì)照為免疫前血清)的3%BSA中，37 ℃，CO2培養(yǎng)箱中封閉2 h，PBS沖洗3遍，轉(zhuǎn)入含有FITC標(biāo)記的抗小鼠IgG二抗(1∶50)的2%BSA中37 ℃，CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h，PBS沖洗5遍，甘油封片后在熒光顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1CZP3C基因的克隆

以P1和P2為引物，以反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增出約984 bp大小的特異性基因片段，大小與預(yù)計(jì)結(jié)果相符(圖1)。

圖1 逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增CZP3C基因的瓊脂糖凝膠電泳分析Fig. 1 Agarose gel electrophoresis analysis of CZP3C gene by reverse transcription PCR amplification

1.CZP3C基因， 2. DL5000 DNA marker， 3. 陰性對(duì)照。

1.CZP3Cgene， 2. DL5000 DNA marker， 3. Negative control.

2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-CZP3C的構(gòu)建

重組表達(dá)載體pET28a-CZP3C經(jīng)過(guò)EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切后，出現(xiàn)2條條帶，1條為載體，1條為984 bp的目的片段(圖2)，測(cè)序結(jié)果與GenBank中的已知序列一致。

圖2 重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-CZP3C的雙酶切分析Fig. 2 Analysis of recombinant expression plasmid pET28a-CZP3C by EcoR Ⅰ and Xho Ⅰ digestion

1. DL5000 DNA marker， 2. pET28a經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切， 3. pET28a-CZP3C經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切。

1. DL5000 DNA marker， 2. pET28a plasmid digested byEcoRⅠ andXhoⅠ， 3. pET28a-CZP3Crecombinant plasmid digested byEcoRⅠ andXhoⅠ.

2.3 CZP3C融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

菌株經(jīng)小量誘導(dǎo)優(yōu)化后表明，蛋白表達(dá)量在28 ℃、0.6 mmoL·L-1IPTG條件下達(dá)到最優(yōu)，且主要以包涵體的形式存在(圖3)。SDS-PAGE結(jié)果顯示誘導(dǎo)后菌體相對(duì)于誘導(dǎo)前，40 kDa處出現(xiàn)1條明顯的表達(dá)條帶。

圖3 CZP3C融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)Fig. 3 Induction and expression of CZP3C fusion protein1. 170.0 kDa蛋白marker， 2. 誘導(dǎo)前的CZP3C融合蛋白， 3. 誘導(dǎo)后的CZP3C融合蛋白， 4. 誘導(dǎo)后CZP3C融合蛋白上清， 5. 誘導(dǎo)后CZP3C融合蛋白沉淀溶于PBS， 6. 誘導(dǎo)后CZP3C融合蛋白沉淀溶于尿素。

1. 170.0 kDa protein marker， 2. CZP3Cbefore induction， 3. CZP3Cafter induction， 4. Supernatant of CZP3C， 5. CZP3Cprecipitation dissolved in PBS， 5. CZP3Cprecipitation dissolved in urea.

2.4 CZP3C融合蛋白的純化

大量誘導(dǎo)超聲破碎后獲得包涵體沉淀，上鎳柱，經(jīng)咪唑梯度洗脫，洗脫液樣品SDS-PAGE證明200 mmol·L-1咪唑?qū)⒛康牡鞍紫疵撓聛?lái)(圖4：A)，因此，將200 mmol·L-1洗脫收集液用透析袋尿素梯度復(fù)性，收集復(fù)性后的蛋白，定量后-80 ℃保存，SDS-PAGE凝膠電泳顯示其大小約為40 kDa，純度達(dá)到90%以上(圖4：B)。

圖4 CZP3C融合蛋白的SDS-PAGE檢測(cè)Fig. 4 SDS-PAGE analysis of CZP3C fusion protein

A： 1. 穿流， 2. 170.0 kDa蛋白marker， 3. 40 mmol·L-1咪唑洗脫液， 4. 80 mmol·L-1咪唑洗脫液， 5. 100 mmol·L-1咪唑洗脫液， 6. 200 mmol·L-1咪唑洗脫液， 7. 300 mmol·L-1咪唑洗脫液， 8. 500 mmol·L-1咪唑洗脫液; B： 1. 180.0 kDa蛋白marker， 2. 純化后的CZP3C融合蛋白。

A： 1. Protein in cross flow， 2. 170 kDa protein marker， 3. Protein in 40 mmol·L-1elution solution， 4. Protein in 80 mmol·L-1elution solution， 5. Protein in 100 mmol·L-1elution solution， 6. Protein in 200 mmol·L-1elution solution， 7. Protein in 300 mmol·L-1elution solution， 8. Protein in 500 mmol·L-1elution solution; B： 1. 180 kDa protein marker， 2. CZP3Cfusion protein after purification.

2.5 CZP3C融合蛋白特異性檢測(cè)

將抗原蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳后，直接轉(zhuǎn)膜進(jìn)行Western blot，以檢測(cè)已獲得蛋白的特異性，結(jié)果表明：在40 kDa處，抗體與CZP3C融合蛋白發(fā)生特異性結(jié)合，其大小與預(yù)期值相符(圖5)。

圖5 CZP3C融合蛋白Western blot檢測(cè)Fig. 5 Western blot detection of CZP3C fusion protein

1. 180.0 kDa蛋白marker， 2. CZP3C融合蛋白[一抗(1∶5 000)， 二抗(1∶3 000)]。

1. 180.0 kDa protein marker， 2. His-CZP3Cfusion protein after purification (dilution ratio of primary and secondary antibodies are 1∶5 000 & 1∶3 000， respectively).

2.6 抗血清效價(jià)及特異性檢測(cè)

第三次免疫后第14天，采用耳緣動(dòng)脈與頸動(dòng)脈放血法放血，分離血清，再通過(guò)ELISA法確定抗血清效價(jià)，以免疫前血清為陰性對(duì)照，抗體效價(jià)可達(dá)到1∶409 600(圖6)。

圖6 ELISA法檢測(cè)CZP3C兔抗血清效價(jià)Fig. 6 The detection of rabbit CZP3C antiserum titer with ELISA

以抗血清作為一抗(1∶500)，羊抗兔IgG作為二抗(1∶3 000)，Western blot檢測(cè)抗血清的特異性，結(jié)果表明，抗體能夠特異性地與CZP3C融合蛋白結(jié)合，為了進(jìn)一步證明該抗血清對(duì)內(nèi)源性ZP3蛋白的識(shí)別能力，采用間接免疫熒光的方法驗(yàn)證了抗犬ZP3抗體與小鼠卵細(xì)胞結(jié)合的能力。結(jié)果表明，在熒光顯微鏡下，小鼠卵細(xì)胞表面的卵透明帶顯現(xiàn)出了強(qiáng)烈的綠色熒光(圖7)。

圖7 Western blot和間接免疫熒光檢測(cè)CZP3抗血清的特異性Fig. 7 The specificity detection of rabbit antiserum against CZP3 with Western blot and indirect immunofluorescence

1. 180.0 kDa蛋白marker， 2. 純化后CZP3C融合蛋白(一抗1∶500，二抗：1∶3 000)；A，C. 0.9%生理鹽水，B，D. CZP3C融合蛋白。

1. 180.0 kDa protein marker， 2. CZP3Cfusion protein after purification (dilution ratio of primary and secondary antibodies is 1∶500 and 1∶3 000， respectively); A， C. 0.9%NaCl， B， D. CZP3Cfusion protein.

3 討論

基因工程重組蛋白能夠在不同的表達(dá)系統(tǒng)中獲得，常見(jiàn)的有原核表達(dá)系統(tǒng)、酵母表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲(chóng)細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)(范翠英等，2016)。以大腸桿菌為代表的原核表達(dá)系統(tǒng)以其遺傳背景清楚、成本低、表達(dá)量高和表達(dá)產(chǎn)物分離純化相對(duì)簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)成為了最常用、最經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的蛋白表達(dá)系統(tǒng)(楊川，胡敏，2016)。本研究選取大腸桿菌表達(dá)菌株BL21(DE3)，在參考文獻(xiàn)關(guān)于6個(gè)組氨酸(6-His)融合蛋白的純化方法后(Liu & Naismith， 2008；王毅飛等，2009；Wuetal.,2016)，結(jié)合CZP3蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，摸索并誘導(dǎo)純化獲得了純度達(dá)到90%以上、產(chǎn)量為12 mg·L-1的CZP3C融合蛋白，經(jīng)過(guò)SDS-PAGE及Western blot檢測(cè)證明獲得的融合蛋白與預(yù)期一致。

抗血清是一種含有多克隆抗體的血清，通過(guò)注射抗血清可以傳遞被動(dòng)免疫治療許多疾病。目前唯一能夠治療埃博拉病毒患者的方法就是通過(guò)注射前一個(gè)患者的抗血清到患者體內(nèi)用以中和體內(nèi)的病毒抗原，從而達(dá)到治療的目的?？寡宀粌H在臨床中發(fā)揮了重要作用，而且在預(yù)防及治療性疫苗的研發(fā)階段同樣不可或缺(Chenetal.,2015；Shimadaetal.,2015；Ratanabanangkoonetal.,2016)。以卵透明帶為基礎(chǔ)的不孕疫苗，需要驗(yàn)證抗ZP3抗體對(duì)犬類(lèi)受精的抑制效果，由于犬ZP3與小鼠ZP3存在免疫交叉，在模式動(dòng)物小鼠上驗(yàn)證抗原抗體的結(jié)合以及對(duì)受精效果的影響，才有可能保證后期犬類(lèi)免疫不孕疫苗試驗(yàn)的成功。研究證明CZP3免疫兔的抗血清能夠與小鼠ZP3有效結(jié)合，間接證明其對(duì)受精抑制的可能性，為后期開(kāi)展犬類(lèi)體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)提供理論支持。

在動(dòng)物免疫的過(guò)程中，抗原蛋白同弗氏佐劑必須完全乳化后，通過(guò)背部、足掌、淋巴結(jié)周?chē)⒍蟮攘馨徒Y(jié)富集處皮內(nèi)或皮下多點(diǎn)注射，才能夠激起免疫動(dòng)物的抗體水平，這種油包水的形式在進(jìn)入機(jī)體體內(nèi)后會(huì)增強(qiáng)抗原的免疫原性，并且富集抗原遞呈細(xì)胞對(duì)抗原的遞呈作用，使機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生有效且有針對(duì)性的免疫防御(Gutierrez-Sanchezetal.,2015)。

研究發(fā)現(xiàn)：以CZP3全長(zhǎng)基因表達(dá)融合蛋白時(shí)，改變誘導(dǎo)條件并不會(huì)對(duì)誘導(dǎo)的含量產(chǎn)生大的影響，而在去除了跨膜區(qū)和信號(hào)肽只保留核心片段之后，誘導(dǎo)后蛋白含量大幅度增加，完全滿(mǎn)足了后期的動(dòng)物免疫和免疫學(xué)檢測(cè)。通過(guò)構(gòu)建高效表達(dá)抗原蛋白的原核表達(dá)載體，獲得了純度高的抗原蛋白，免疫新西蘭大白兔，獲得了特異性和效價(jià)均較高的CZP3C兔抗血清。ELISA結(jié)果表明，在免疫了抗原蛋白后，免疫動(dòng)物的抗體水平極大地提高。Western blot和間接免疫熒光進(jìn)一步證明了所獲得抗血清是有效且特異的。

流浪犬作為一個(gè)特殊的群體，由于生活環(huán)境的不穩(wěn)定，捕獲成為免疫研究工作中一個(gè)很大的挑戰(zhàn)。相對(duì)于寵物犬，流浪犬擁有更完善的適應(yīng)性和免疫防御能力，需要有效的送藥系統(tǒng)和多次免疫相結(jié)合才能達(dá)到令人滿(mǎn)意的效果，僅通過(guò)一次免疫獲得長(zhǎng)期不孕還面臨很多難題。目前，國(guó)內(nèi)外免疫不孕研究工作主要關(guān)注三個(gè)方面，通過(guò)中和由下丘腦分泌的促性腺激素釋放激素來(lái)抑制配子(精子和卵細(xì)胞)產(chǎn)生，從而從根本上阻止受精過(guò)程；以參與受精的相關(guān)蛋白為DNA或蛋白疫苗免疫動(dòng)物，使被免疫動(dòng)物產(chǎn)生相關(guān)的抗體，從而阻斷受精過(guò)程；通過(guò)免疫介導(dǎo)能夠中和HCG，而HCG是一種由胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞分泌的糖蛋白，對(duì)維持人類(lèi)胚胎的發(fā)育所需要的環(huán)境和胚胎的生長(zhǎng)和發(fā)育有重要作用。免疫介導(dǎo)的中和作用會(huì)使被免疫動(dòng)物血液中的HCG大量減少，導(dǎo)致流產(chǎn)和畸形胚的產(chǎn)生，從而降低生育率，達(dá)到控制種群數(shù)量的目的?？傊瑢?duì)待流浪犬這個(gè)特殊的群體，需要探索發(fā)現(xiàn)簡(jiǎn)便、作用時(shí)間長(zhǎng)且副作用小的免疫不孕疫苗。

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The Prokaryotic Expression of Canine Zona Pellucida 3 Protein and Preparation of its Antiserum

ZHANG Beibei， WANG Ying， ZHANG Ji， ZHANG Fuchun*

(College of Life Sciences and Technology， Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering，Xinjiang University， Urumqi 830046， China)

To develop the canine zona pellucida 3 (CZP3) contraceptive vaccine that could be used to control the birth rate of stray dogs， antiserum is required to carry out immune detection. In this study， the full length cDNA ofCZP3 (1 281 bp) and the core fragment ofCZP3 (CZP3C， 984 bp) without the transmembrane domain and the signal peptide were cloned， respectively.CZP3Cwas ligated to pET28a vector to generate the recombinant plasmid pET28a-CZP3C， and then the plasmid was transferred intoEscherichiacoliBL21(DE3). The expression of CZP3Cfusion protein was induced with 0.6 mmol·L-1isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) at 28 ℃ for 4 h. The specific antiserum of CZP3Cfusion protein was obtained from the rabbit after immunization， and the specificity and titer of the prepared antiserum were evaluated. The results of SDS-PAGE showed that CZP3Cmainly existed in the form of inclusion bodies. High purity of the fusion protein was obtained after nickel column affinity purification and 8 mmol·L-1urea renaturation. Two Newzealand rabbits were immunized with CZP3Cof 0.8g·L-1， respectively， the generated polyclonal antiserum was detected with Western blot and indirect immunofluorescence. The results showed that the anti-CZP3Crabbit serum had high specificity， and the titer was 1∶409 600 as determined by the enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). The prepared antiserum can provide testing materials for the development of stray dog contraceptive vaccines.

dog; zona pellucida 3; prokaryotic expression; fusion protein; antiserum

2016-05-31 接受日期：2016-08-19

新疆維吾爾自治區(qū)科技支疆項(xiàng)目(201591134)

張貝貝(1989—)， 男， 碩士研究生， 研究方向：分子免疫學(xué)， E-mail：1056203290@qq.com

*通信作者Corresponding author， 博士生導(dǎo)師， 研究方向：分子與生物化學(xué)， E-mail：zfcxju@qq.com

10.11984/j.issn.1000-7083.20160145

Q78; Q959.8

A

1000-7083(2016)05-0697-06